利用FACS辅助的细胞类型特异性表达谱分析研究植物组织和器官特异性的光敏色素反应 拟南芥

为了研究特定植物细胞类型中的光敏色素反应，将GAL4GFP增强子捕获系与UAS-BVR转基因品系杂交，以产生光敏色素缺陷型植株。从杂交获得的UAS-BVR与GA4GFP后代植株中分离叶片原生质体。

接下来，通过流式细胞术对原生质体进行分选，以分别获得GFP阴性和GFP阳性的原生质体样品，分离后的原生质体通过共聚焦激光扫描显微镜进行分析。为确认GFP阳性原生质体的收集效果，从原生质体中提取RNA并进行光谱分析。大家好，我是来自密歇根州立大学能源部植物研究实验室BARDA Montgomery实验室的Sanka Pivar。

今天我们将向您展示一种从顶端 ANA 分离叶原生质体的实验方法，用于荧光辅助细胞分选及细胞类型特异性基因表达分析。我们在实验室中采用该方法研究组织和器官特异性的光敏色素依赖性响应。现在让我们开始吧。

本实验所用的拟南芥 ANA 品系是通过双组分增强子捕获方法的亲本杂交获得的。其中一个亲本来自具有不同 gal 或表达模式的增强子捕获品系文库。亲本一还在上游激活序列（UAS）的控制下表达 GFP。

简言之，转录因子GA four能够激活任何由UAS控制的基因。在亲本一线中，GA four激活GFP；将亲本一与亲本二杂交，在亲本二中，BVR基因通过UAS受到GAL four的调控。

由杂交得到的品系为 U-A-S-B-V-R 与 G 4G FP 的杂交后代。在亲本品系中，光敏色素生色团的生物合成途径从 LA 经血红素生成胆绿素（缩写为 bv）。但在后代中，BVR 基因的产物通过还原 BV 前体，阻断了光敏色素生色团的生物合成。该增强子捕获型 BVR 后代品系已得到验证，可用于研究活性光敏色素水平降低对不同植物组织的影响。

开始本实验前，需准备用于种植植物以获得叶片原生质体的土壤和花盆。每个实验每份样品约将2000粒种子在花盆土壤中进行表面灭菌。向盛有花盆的托盘底部加水，并用塑料薄膜覆盖整个托盘。

在22摄氏度和70%湿度条件下，用白光照射培养植物五周。播种后第五至第六天，确认种子萌发，并从培养皿上移除塑料封膜。为了分离原生质体，首先配制1升TEX缓冲液，称取GA's B5盐、MES、氯化钙、硝酸铵和蔗糖。

将组分完全溶解于约 900 毫升去离子蒸馏水（简称 DD H2O）中，并用 1 摩尔 KOH 调节 pH 至 5.7。然后将终体积定容至 1 升，并进行过滤除菌。

接下来，从植株上采集健康的绿色叶片。用烧杯松散地收集约 250 毫升的叶片。用 40 毫升水冲洗叶片。

用去离子水洗涤四次，再用无菌去离子水冲洗两次，使用20号手术刀将叶片切成细条，并将组织均等分至两个50毫升无菌塑料管中。1倍叶片消化液的配制方法：取5毫升10倍储存液（由2%（质量/体积）MazY R 10和4%（质量/体积）纤维素酶Onozuka R 10溶于TEX缓冲液中）加入45毫升新鲜TEX缓冲液中配制而成。

加入约 25 毫升 1× 叶片消化液，混匀各管中的叶片条，确保所有叶组织均被覆盖。随后进行真空处理，使消化液渗透叶片组织。

使用连接水泵的真空干燥器，在室温下将开放管中的样品混合一小时。将含有叶片组织和叶片消化混合液的管子用铝箔包裹，避免光照。随后在室温下于摇床上轻柔振荡孵育三小时。

三小时后，将摇床速度提高并持续两分钟，以释放原生质体。将粗制原生质体悬液通过两层无菌纱布过滤，去除残渣，并将滤液收集到无菌玻璃烧杯中。再将滤液通过无菌的100微米尼龙滤网过滤至无菌培养皿中。

收集流穿部分，并转移至一个新的无菌50毫升离心管中。使用约15至20毫升新鲜TEX缓冲液冲洗无菌培养皿，收集附着在表面的原生质体。使用水平转子离心机，在10摄氏度下以100 × g离心15分钟，离心时加速度设为6，减速设为0，离心结束后收集沉淀。

使用无菌的9英寸玻璃巴氏管，连接至蠕动泵，小心移除漂浮原生质体层下方约25至30毫升的液体（其中含有残留的沉淀碎片），注意不要扰动漂浮的原生质体层，保留约10至50毫升。去除沉淀碎片后，加入新鲜TEX缓冲液，使最终体积达到40毫升。在轻柔重悬原生质体的同时，重复进行碎片去除操作，并重新悬浮剩余的漂浮原生质体。

再重复两次，以尽可能去除细胞碎片 D。第一次重复时离心时间缩短至 10 分钟，最后一次重复时缩短至 5 分钟。最后，使用无菌的 1 毫升移液管吸取漂浮的原生质体，并将其转移至新的 15 毫升离心管中。

在分选前直接进行分选操作。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）通过488纳米激光激发来观察原生质体，以确认原生质体的完整性及其群体中绿色荧光蛋白（GFP）荧光的存在。需尽量减少碎片，以避免堵塞分选喷嘴，通过传真机在TEX缓冲液中分选分离的原生质体。

采用改良方案，使用配备200微米喷嘴的大型分选头，在事件速率为6,000至15,000、系统压力约为9 psi的条件下，利用野生型非GFP原生质体确定自发荧光阈值，以分选GFP阳性原生质体细胞。使用在488纳米氩离子激光线上以100毫瓦功率运行的气冷式阿贡激光器进行分选。通过530/30带通滤光片检测GFP荧光信号，完成GFP阳性原生质体的收集后，再次在显微镜下观察已分选的原生质体，以进行分选前的表达谱分析。

从分选的原生质体中提取总RNA。然后可制备cDNA用于杂交。随后将cDNA用于杂交至TH one OPSYS Ametri全基因组芯片。

以下是野生型对照原生质体分选的一些代表性结果。在GFP阳性门控中，野生型原生质体无任何信号。然而，在分选前，从GAL4GFP品系分离的原生质体样品可检测到GFP阳性信号；而在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析中，从野生型植株分离的原生质体无任何GFP荧光。

在对GAL4GFP品系原生质体样本进行处理后，通过检测可发现其中既含有无GFP荧光的原生质体，也含有具有GFP荧光的原生质体。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析表明，可从代表性GAL4GFP品系中分离出GFP阳性的原生质体，且从分离得到的原生质体中可提取RNA，每1毫升分离产物所获得的RNA量足以通过荧光分光光度法进行检测。我们刚刚向您展示了如何从拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中分离原生质体，用于荧光辅助细胞分选以及细胞类型特异性的基因表达分析。

进行此操作时，重要的是要注意轻柔处理原生质体，并尽量减少其暴露于光照下。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。