Name: 缺乏PMS2，ERCC1，Ku86，视野缺损CcOI在结肠癌进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 15 s
Description: 了解DNA修复蛋白Pms2和ERCC1在结肠癌旁黏膜中的表达变化。通过免疫组织化学技术检测组织切片，评估蛋白表达水平与癌症进展的关系，为早期诊断提供潜在标志物。

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由南亚利桑那退伍军人事务卫生保健系统VA优异评审基金0142和亚利桑那生物医学研究委员会基金0803提供资助。

制备用于载玻片观察的组织
<ol>
	<li>结肠镜可通过直肠插入结肠。结肠镜是一种长管状器械，其头部装有照明装置和视频摄像头，可通过向结肠内注入空气，将结肠像长气球一样撑开，以更好地观察结肠内部情况。结肠镜还设有通道，可让活检钳伸出至摄像头前端，夹取结肠内壁“皮肤”或黏膜层约3-5毫米范围的组织，以获取活检标本。活检钳还可用于切除结肠内发现的可能具有癌前病变的息肉。</li>
	<li>我们在取得患者知情同意后，采集了其正常结肠黏膜组织的活检样本。这些患者正在消化科门诊接受筛查性结肠镜检查。我们的活检样本被放入盛有福尔马林的容器中。4小时后，将福尔马林更换为70%乙醇。</li>
	<li>类似组织样本也取自手术切除的结肠标本中距离结肠癌或高级别腺瘤1厘米和10厘米处的区域。这些组织样本同样被置于福尔马林中固定；若组织样本较大，则部分样本在转入70%乙醇前会在福尔马林中保存更长时间。</li>
	<li>组织样本被送往组织学实验室进行处理，并包埋于石蜡块中。</li>
	<li>将石蜡块置于冰箱中冷却，以便更易于用切片机进行切割。</li>
	<li>使用切片机从组织块上切下厚度为4微米的组织切片，并使其漂浮于水面上。</li>
	<li>为比较两种蛋白（例如ERCC1和Pms2）的表达情况，可将交替的组织切片分别转移至两张载玻片上，直至每张载玻片上有三个组织切片。例如，可将第1、3、5号切片置于标记为ERCC1的载玻片上，而将第2、4、6号切片置于标记为Pms2的载玻片上。单张载玻片上包含三个经同一蛋白免疫染色的组织切片，有助于判断隐窝染色模式的异常是真实现象还是人为假象，因为假象通常不会在同一切片上的多个组织切片中重复出现。结肠隐窝直径约为60微米，因此一个隐窝可被连续切出约15个切片，使得同一隐窝可在单张载玻片的多个组织切片中被观察到。</li>
</ol>
组织切片免疫染色
<ol>
	<li>随后将切片进行免疫组织化学标记操作。该过程耗时约8小时，基本属于常规流程。我们所采用的非标准步骤包括使用Sequenza染色容器以及一种名为“Sniper”的降低背景染色的溶液。“Sniper”溶液由美国加利福尼亚州康科德市的Biocare Medical公司以专有配方销售。</li>
	<li>此处展示了我们部分操作步骤。</li>
	<li>以Pms2免疫组织化学为例，首先将切片置于二甲苯中脱蜡，共更换3次（每次3分钟），随后依次用100%乙醇更换2次（每次2分钟）、95%乙醇更换2次（每次2分钟），最后用蒸馏水更换2次（每次2分钟）。上述操作均在具有负压通风的化学通风橱中进行，以避免实验人员接触有机溶剂蒸气。</li>
	<li>当组织最初使用福尔马林固定时，组织样本中的部分蛋白质发生了交联。现在我们需要打断这些交联结构，以便抗体能够识别目标蛋白。将切片置于缓冲液中，并在微波炉中加热至沸腾，随后在中火条件下继续处理10分钟，再于冰上冷却20分钟。此步骤需根据不同微波炉的性能进行测试和优化，直至获得理想结果。需要注意的是，针对CcOI或Ku86的免疫染色，我们使用由9 mL柠檬酸 + 41 mL柠檬酸钠 + 450 mL H2O配制而成的柠檬酸钠缓冲液（含钠离子），其pH约为6.0；对于ERCC1染色，则使用由2.1 g柠檬酸 + 1 L H2O + 约5 mL氢氧化钠调节至pH 6.1的柠檬酸缓冲液（添加钠离子最少）；而对于Pms2染色，则使用5 mL VECTOR公司的抗原修复液 + 533 mL H2O配制的溶液。不同缓冲液的选择旨在增强抗体与特定蛋白表位之间的结合能力。</li>
	<li>随后将切片置于3%过氧化氢（以甲醇稀释）中孵育20分钟，接着用蒸馏水冲洗3分钟，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤5分钟。</li>
	<li>将切片放入称为Sequenza的扁平窄型染色架中（Thermo Scientific公司的Shandon Sequenza免疫染色系统），并用PBS冲洗。</li>
	<li>针对ERCC1或Pms2进行免疫染色的切片，需额外加入3滴来自Biocare公司的专有溶液“Sniper”，处理10分钟，以减少背景蛋白的非特异性染色。</li>
	<li>切片用TBST缓冲液冲洗，TBST的配制方法为：1 mL Tween + 100 mL 10x Tris + 900 mL蒸馏水［其中10x Tris的配制为：24.2 g Trizma + 80 g NaCl + 1,000 mL去离子蒸馏水，加入浓盐酸（约15 mL）调节pH至7.6］。</li>
	<li>切片用缓冲液冲洗三次后，每张切片加入100微升DAKO生物素化二抗（以TBST缓冲液中的2%牛血清白蛋白按1:100稀释），室温孵育30分钟。</li>
	<li>此时配制Vectastain ABC（亲和素-生物素复合物）试剂（Vector Laboratories公司产品），使用2.5 mL PBS、1滴溶液A和1滴溶液B混合，静置30分钟。</li>
	<li>切片用TBST缓冲液冲洗三次。</li>
	<li>每张切片加入3滴Vectastain ABC试剂，室温孵育30分钟，随后用TBST缓冲液冲洗两次。</li>
	<li>将切片浸入DAB（二氨基联苯胺）显色液（2.9 mL DAB + 400 µL PBS + 250 µL过氧化氢）中约5分钟。</li>
	<li>切片用去离子水冲洗两次。</li>
	<li>使用稀释的苏木精溶液进行复染，时间为10秒。切片随后用自来水充分冲洗，再用去离子水冲洗。</li>
	<li>切片依次在95%乙醇中脱水两次（每次2分钟）、100%乙醇中脱水两次（每次2分钟）、二甲苯中脱水两次（每次2分钟）。</li>
	<li>向切片滴加数滴Cytoseal XYL（Richard-Allan Scientific公司产品），盖上盖玻片。</li>
	<li>ERCC1、Ku86和CcOI的免疫组织化学评估采用与Pms2相同的实验流程，仅将Pms2抗体替换为下表中所述的ERCC1、Ku86和CcOI特异性抗体。</li>
</ol>
评估组织切片中ERCC1、Pms2、Ku86和CcOI表达缺陷的隐窝
<ol>
	<li>首先，我们将使用Motic（DM-BA300）光学显微镜观察组织切片，检测结肠黏膜隐窝中Pms2和ERCC1的表达情况。</li>
	<li>Pms2和ERCC1均为DNA修复酶，因此它们定位于细胞核内，即隐窝细胞的细胞核中。图1中显示了这一点：代表ERCC1染色的棕色出现在隐窝细胞的细胞核内。我们在显微镜下首先展示的正常隐窝经ERCC1染色后，可见棕色染色显示ERCC1的定位。我们指出隐窝中不同类型的细胞：其中“杯状细胞”形状类似酒杯，细胞核位于隐窝外缘细胞基底部的一个较小区域，而细胞内侧部分则膨大，充满白色的黏液颗粒。另外两种细胞在染色切片中形态相似，分别为吸收细胞（enterocytes）和肠内分泌细胞（enteroendocrine cells），它们的细胞核也位于隐窝外缘的细胞基底部。在从未发生过结肠肿瘤的患者所取的活检组织中，或远离结肠癌病灶的活检区域中，几乎所有隐窝的所有细胞核均表现出如图所示的正常高水平ERCC1表达。</li>
	<li>为了明确观察方向，我们首先观察来自无结肠肿瘤患者的活检组织切片，检测其正常结肠黏膜中Pms2、ERCC1、CcOI或Ku86的表达水平。使用40倍物镜，我们可以逐层缓慢扫描整个组织切片，观察其中所有隐窝、间质细胞、任何淋巴滤泡（若存在）以及肌层（若活检组织中包含）。</li>
	<li>我们还需指出，在隐窝基底部仅有少数几个细胞为干细胞。这些干细胞可生成整个隐窝约2,000个细胞。若某个干细胞发生突变或表观遗传改变，可能占据整个干细胞微环境，导致整个隐窝对该兴趣酶的染色发生改变（即隐窝转化）。在本张新幻灯片中，我们可见到一些完全缺乏CcOI表达的隐窝，与高表达CcOI的隐窝相邻存在。</li>
	<li>随后，我们展示一例结肠癌或高级别腺瘤患者的组织切片。在此切片中，部分隐窝表现出正常的高水平ERCC1表达，而另一些则表达水平较低。使用10倍物镜对组织切片中所有隐窝进行低分辨率拍照，并将图像拼接，从而在单张图像中呈现整个组织切片。随后对各个隐窝进行编号。</li>
	<li>酶表达水平高、类似于远离肿瘤区域活检中隐窝特征的染色被定义为“4级”染色。其他等级包括：完全无可见表达者为“0级”，仅勉强可检测到表达者为“1级”，有表达但显著低于4级者为“2级”，表达水平低于4级但仍较强者为“3级”。我们在低分辨率图像上以不同颜色标记每张切片：4级为蓝色，3级为绿色，2级为黄色，1级为橙色，0级为红色。此处我们展示使用40倍物镜逐个观察活检切片的过程，并在低分辨率图像上对隐窝进行标记。</li>
</ol> 
<img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="腺上皮组织学；显微镜图像；细胞结构；组织分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 结肠隐窝显示隐窝细胞核中ERCC1高表达。该图像所有颜色均使用Paint Shop Pro 5对对比度和饱和度进行了同等增强。
代表性结果
<ol>
	<li>不同载玻片上的交替组织切片使我们能够通过免疫组织化学方法观察同一结肠隐窝中两种不同蛋白质的表达情况。同一隐窝分别经Pms2染色和ERCC1染色后的图像，可在相邻显微镜及其对应的相邻计算机显示器上进行比对观察。这使我们能够判断两种蛋白质是否存在联合缺陷，或尽管每种蛋白质的缺陷均较常见，但二者是否独立发生。每张载玻片上包含三个组织切片，因此任何一种蛋白质表达的明显缺陷均可在多个切片上得到验证，排除技术假象的可能性。在结肠癌周围组织中，由于存在导致癌症发生的场效应缺陷，ERCC1和Pms2双缺陷的隐窝出现频率较高。</li>
	<li>我们还采用免疫组织化学方法检测了Ku86和CcOI蛋白缺陷隐窝的发生频率。在本张载玻片上，使用40倍物镜对整个Ku86免疫染色的组织切片进行观察，可见该组织切片中Ku86缺陷的隐窝数量较少。</li>
	<li>同样，在本张载玻片上，使用40倍物镜对整个CcOI免疫染色的组织切片进行观察，可见仅有中等数量的隐窝表现为CcOI缺陷。</li>
</ol>

<ol><li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium%3B+clinical+implications+of+multicentric+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li>
<li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li>
<li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li>
<li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li>
<li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+%28SC%29+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li>
<li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+reveals+a+niche%3A+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li>
<li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells%2C+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li>
<li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li>
<li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma%3A+methylation+of+the+E-cadherin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hydrophobic+bile+acids%2C+genomic+instability%2C+Darwinian+selection%2C+and+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li>
</ol>

<ol>
	<li>每张载玻片上必须放置3个组织切片，这一点非常重要。在加入含抗体的介质时可能会产生气泡，导致某些隐窝或隐窝的部分区域因气泡阻隔而无法充分接触抗体，从而染色不充分。隐窝直径约为60微米，组织切片厚度为4微米，因此同一隐窝可能在切片方向上被截取多达15次。通常可以通过隐窝的形态特征作为参考，在同一张载玻片上的多个组织切片中找到相同的隐窝。</li>
	<li>在我们最近的研究中，对于较大的组织样本，在Sequenza装置中进行染色可能无法使抗体充分覆盖整个组织。在这种情况下，可优先采用手工染色方法，即手动将含有抗体的液滴逐一滴加至每个组织样本上。</li>
	<li>为了在计算机显示器上清晰观察显示免疫染色蛋白表达的棕黄色染色以及显示细胞核DNA的蓝色染色，需对Motic光学显微镜软件进行如下设置：增益（Gain）0，偏移（Offset）0，增强（Enhance）0、255，伽马（Gamma）1.00、0，锐度（Sharpness）1，颜色校正（Color Correction）7，红/绿/蓝（R, G, B）增益1.00，红/绿/蓝（R, G, B）亮度0。分辨率设为1024 × 768，并启用白平衡功能。</li>
	<li>本方法可用于评估任何被认为在结肠癌进展过程中起重要作用的蛋白质，分析其在结肠癌或高级别腺瘤周围“场缺陷”区域中表达缺失或可能过表达的发生频率。 </li>
	<li>场缺陷是癌症发生过程中的一个组成部分 “场癌化”（field cancerization）这一术语最早由Slaughter et al. 于1953年提出1，用于描述上皮组织中某一区域或“场”，该区域因当时尚不明确的机制而被预先改变，从而更易发展为癌症。该术语最初应用于口腔癌的研究。此后，“场癌化”和“场缺陷”被更广泛地用于描述任何更容易产生新发癌症的癌前病变组织，场癌化概念在临床肿瘤学中的重要性也日益受到关注2。我们近期综述了胃肠道癌症中场缺陷的相关证据3，其中包括十余项研究，提供了结肠存在场缺陷的证据。 结肠黏膜中的场缺陷可能源于隐窝干细胞中突变细胞或表观遗传改变细胞的自然选择，使得某一干细胞在生态位更替过程中得以存活4。遗传不稳定性或突变表型（可能由DNA核苷酸切除修复或DNA错配修复功能降低引起）会加速这一过程（此前已有报道显示，在结肠癌周围区域中Pms2缺陷较为常见5）。如果在结肠黏膜正常的干细胞群体中，某个细胞因基因突变或表观遗传改变而获得选择优势，它将倾向于以克隆方式扩增，并取代邻近的干细胞。在结肠黏膜中，干细胞生态位通常由≤5个细胞占据6，这些细胞进而产生整个隐窝约2000个细胞。当突变型或表观遗传改变的细胞类型占据干细胞生态位时，即发生“隐窝转化”（crypt conversion）7。 突变克隆（即转化后的隐窝）在结肠上皮中的扩散通常通过隐窝分裂（crypt fission）实现8。图2展示了隐窝分裂的一个实例。通过这种方式形成一片异常组织区域。在此区域内，可能发生第二次类似突变，使某个隐窝相对于区域内其他隐窝具有生长优势，从而以克隆方式扩增，形成原发异常区域内的次级异常区域。在此新的区域内，该过程可能在数十年间重复发生多次，直至出现恶性干细胞并克隆扩增形成癌症。如果散发性结肠腺癌普遍通过这一机制发生，那么结肠腺癌通常应伴随并先于异常“场”的存在。因此，在具有高级别上皮内瘤变的腺瘤或结肠癌周围区域，预期可检测到由转化隐窝组成的异常区域中存在可识别的缺陷。 根据这一肿瘤前进展模型，可预期在结肠肿瘤性病变周围、可能进展为癌症的非肿瘤性结肠黏膜组织样本中，能够发现与肿瘤前进展相关的遗传或表观遗传改变。特别是DNA修复酶或凋亡相关蛋白的缺陷，可能通过加剧基因组不稳定性促进肿瘤进展，因此在缺陷“场”中更可能被检测到。</li>
	<li>在ERCC1缺陷细胞中，经DNA损伤剂处理后对Pms2缺失具有选择优势 Nara et al.9培养了25株中国仓鼠卵巢细胞43-3B，所有细胞均携带使DNA修复基因ERCC1失活的突变，并用DNA损伤剂MNNG处理这些细胞。在经DNA损伤处理后存活的细胞中，从每种培养物中分离出单个细胞并使其形成克隆。所有分离出的克隆对MNNG诱导的细胞杀伤作用的抗性均比亲本株高出约10倍。在这些克隆中，22株被证实存在DNA错配修复（MMR）缺陷。其中5株通过测序检测，3株显示Pms2表达缺失。这种对Pms2缺陷的选择可能是因为Pms2缺失导致细胞对凋亡的敏感性降低，从而在ERCC1缺失导致DNA损伤累积的情况下仍能存活。（正常情况下，Pms2可感知DNA损伤水平，并在损伤过度时诱导细胞凋亡。）因此，当ERCC1缺陷细胞暴露于DNA损伤时，Pms2缺失的细胞被选择性保留。研究显示，同时缺失ERCC1和Pms2的克隆在紫外线照射后突变率比亲本细胞高出约500至1000倍。 </li>
	<li>胆汁酸可引起氧化应激，是DNA损伤剂，并在结肠癌进展中发挥重要作用 脱氧胆酸是一种胆汁酸，可通过多种机制（包括线粒体损伤）诱导活性氧（ROS）生成，从而增加氧化应激10。近期研究表明，活性氧可导致表观遗传改变11，且至少有15项研究证实，在高脂饮食导致浓度升高的情况下，胆汁酸可引起DNA损伤12。Bernstein et al.12的综述指出，膳食脂肪摄入量与结肠癌发病率呈正相关。饮食中的脂肪可刺激胆汁酸分泌至肠道，胆汁酸作为去垢剂协助脂肪消化。因此，高脂饮食与胆汁酸分泌增加相关。在结肠癌高发人群中，粪便胆汁酸浓度升高，长期过量暴露于胆汁酸被认为是结肠癌发生的主要危险因素之一13。胆汁酸可能是结肠中场缺陷的诱因之一。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="肠道组织显微镜图像；染色组织学样本；细胞结构细节；病理学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 一个结肠隐窝分裂为3个隐窝。
结论
我们在结肠癌周围的大范围场缺陷中发现，DNA修复基因ERCC1和Pms2（Pms2也参与凋亡过程）缺陷的隐窝频率较高。ERCC1和Pms2的缺陷（由表观遗传改变或突变引起）可能是导致遗传不稳定性的重要早期事件，而遗传不稳定性在结肠癌发生发展中起核心作用。

<table><tbody><tr><td>PMS2 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>556415</td><td></td></tr><tr><td>ERCC1 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>MS-671-P1</td><td></td></tr><tr><td>Ku86 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9034</td><td></td></tr><tr><td>CcO1 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>生物素化二抗</td><td>Dako</td><td>E0413</td><td></td></tr><tr><td>22% BSA</td><td>Informagen, Inc.</td><td>2327</td><td></td></tr><tr><td>Sniper</td><td>Biocare Medical</td><td>BS966</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR international</td><td>48212-196</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

结直肠癌进展过程中场效应缺损中pms2、ercc1、ku86、ccoi的表达缺失

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

在致癌过程中，“场效应缺陷”在临床上被认识，是因为某些癌症幸存者极易在相同组织类型中发生其他恶性肿瘤，且常常出现在邻近部位。结肠癌中已观察到此类场效应缺陷。在结肠腺癌或伴有进展性异型增生的腺瘤周围组织学正常的黏膜中，应能以较高频率检测到导致结肠场效应缺陷的分子异常；而在无结肠新生物患者的结肠黏膜中，这些异常的出现频率则较低。
通过免疫组织化学方法发现，在结肠腺癌或晚期结肠肿瘤周围两侧各10 cm范围内的完整隐窝中，两种DNA修复蛋白Pms2和/或ERCC1的表达常常降低或缺失。Pms2是一种具有双重功能的蛋白质，既参与DNA错配修复，也在DNA损伤过多的细胞发生凋亡过程中发挥作用。ERCC1则参与DNA核苷酸切除修复。ERCC1和Pms2表达的降低或缺失将导致细胞既具有更强的存活能力（即对凋亡抵抗），又具有更高的突变水平。ERCC1和Pms2表达的降低或缺失可能是结肠癌进展的早期步骤之一。
有研究报道，DNA修复基因Ku86（参与DNA非同源末端连接）和细胞色素c氧化酶亚基I（参与细胞凋亡）在结肠癌邻近的黏膜区域表达均有所降低。然而，通过免疫组织化学方法检测其表达水平发现，在结肠癌或进展期结肠肿瘤周围存在场效应缺陷的隐窝中，仅观察到低至中等频率的隐窝表现出这两种蛋白表达缺失。
本文展示了我们对隐窝中ERCC1、Pms2、Ku86和CcOI表达水平的评估方法。结果显示，在结肠肿瘤周围长达20 cm的区域内，Pms2和ERCC1完全缺失的隐窝所占比例通常高达70%至95%，而Ku86缺失隐窝的比例中位数为2%，CcOI缺失隐窝的比例中位数为16%。整个结肠长约150 cm（约5英尺），其黏膜层约含有1千万个隐窝。因此，结肠癌周围Pms2和ERCC1缺陷的隐窝数量可能多达100万个。结肠癌正是起源于有缺陷的隐窝。

在结肠腺癌两侧各10 cm范围内，整个隐窝中Pms2 和/或ERCC1 表达降低或缺失是一种常见现象，这可能是具有高突变性和癌变进展倾向的场效应缺陷的基础。而Ku86 或 CcOI 的缺陷在这些场效应缺陷中则少见得多。

结直肠癌进展过程中场效应缺损中Pms2、ERCC1、Ku86、CcOI的表达缺失

在致癌过程中，“场效应缺陷”在临床上被认知，是因为某些癌症幸存者易于继发其他……

本实验的总体目标是确定在结肠癌周围区域中常见的 DNA 修复蛋白、表达或与凋亡相关蛋白的表达改变，这些改变可能在结肠癌进展过程中起核心作用。首先收集福尔马林瓶中的组织样本，对照组织来自结肠镜检查期间获取的正常结肠黏膜，实验组织则来自结肠切除术中结肠癌邻近的结肠黏膜，样本经固定并浸入福尔马林中 4 小时。随后将这些组织转移至 70% 酒精中过夜，再进行石蜡包埋。该实验步骤的第二步是从组织块中切下组织切片，并将其转移至显微镜载玻片上。第三步是使用Sequenza染色架对组织切片进行免疫染色，以检测可能的目标蛋白。最后一步是在光学显微镜下观察组织切片。最终可获得的结果显示，在无局部肿瘤的结肠黏膜中，一种或多种蛋白质呈现高水平表达，而在结肠癌周围场效应缺陷区域中，这些蛋白质的表达水平降低，表明其表达减少在向结肠癌进展过程中的重要性。例如，本图显示棕色染色，表明在无结肠肿瘤的结肠黏膜中，ERCC1 呈高水平表达。下一张图像显示棕色染色，表明在无结肠肿瘤患者的结肠黏膜中，PMS2 呈高水平表达；而在靠近结肠癌的结肠黏膜区域，可见一个隐窝 PMS2 表达水平较高，部分隐窝表达水平较低；另一靠近结肠癌的区域则显示 PMS2 表达缺失。大家好，我是来自亚利桑那大学医学院细胞生物学与解剖学系Carol Bernstein实验室的Hoy Wynn。我是Kristi Luo。我是Alex fta。我是Nadia Suna，我们均来自Bernstein实验室。今天我们将向您展示在结肠镜检查期间获取的组织切片，以及从这些组织样本中切取切片的操作步骤。随后，我们将演示对这些组织切片进行免疫染色的实验流程。我们还将向您展示如何使用显微镜检查我们的组织切片。通过检查组织切片中蛋白质的表达情况，以评估其是否与结肠癌的发生发展相关。我们利用这些实验步骤来检测二维DNA修复蛋白是否存在缺陷。ERC 一和 PMMS 二似乎是结肠癌场效应缺陷发生的早期步骤之一。我们还利用这些方法来消除其他可能在结肠癌进展早期发挥重要作用的蛋白质，例如 DNA 修复蛋白 CO 86 和凋亡相关蛋白 CCO 一。现在我们开始操作。在筛查性结肠镜检查过程中，从患者体内获取正常的结肠黏膜组织活检样本，并将其置于含福尔马林的容器中。四小时后，用70%乙醇替代福尔马林。从结肠癌病灶边缘1厘米和10厘米处的结肠切除区域获取类似的组织样本，这些区域为具有高级别神经瘤变的腺瘤。组织样本将被送至组织学实验室，经处理制成石蜡包埋块，随后进行切片。将石蜡包埋块置于冰箱中冷却，以利于使用切片机从组织块上切下厚度为四微米的组织切片，并将切片漂浮于水面，用于比较两种蛋白质的表达。例如，交替将组织切片转移至两张载玻片上，每张载玻片上各放置三个组织切片，分别用于检测ERC one和PMS two。例如，可将第1、3、5号切片置于一张标记为ERCC one的载玻片上，而将第2、4、6号切片置于另一张标记为PMS two的载玻片上。免疫染色的操作步骤。先前制备的组织切片应在负压化学通风橱内进行操作，以避免实验人员接触挥发性气体。我们所采用的方案是一个相当标准的流程，但要获得与我们相似的结果，需遵循此方案。在您的实验室使用本方案时，可能需要根据水质、微波功率和抗体浓度等变量进行调整。在本视频中，我们将演示PMs的两种免疫组织化学方法：首先将切片放入二甲苯中脱蜡，更换三次，每次三分钟；随后在100%乙醇中更换三次，每次两分钟；接着在95%乙醇中更换两次，每次两分钟；最后用蒸馏水更换两次清洗切片。接下来，将切片放入缓冲液中，并在微波炉中加热至沸腾。随后在中火下持续加热10分钟。此步骤称为热诱导表位修复，可打断组织样本在福尔马林固定过程中形成的交联，从而在冰上冷却20分钟后使抗体能够识别目标蛋白。将载玻片分别用 PBS 和蒸馏水各清洗 3 分钟。然后将载玻片置于 3% 过氧化氢溶液中 20 分钟。此步骤的目的是阻断组织中的内源性过氧化物酶活性。此外，通过阻断该活性，我们可以减少抗体可能引起的非特异性背景染色。在内源性过氧化物酶阻断20分钟后，将切片用蒸馏水洗涤，随后用PBS洗涤，每次各3分钟。进行免疫染色时，将切片放入称为sequina的扁平窄染色架中，并用PBS冲洗。针对PS二或ERCC一染色的切片随后接受额外处理，即加入三滴名为sniper的专有溶液，处理10分钟，以减少背景蛋白的非特异性染色。用 TBST 缓冲液冲洗载玻片后，加入针对 PS2 的一抗，室温孵育 2 小时。孵育结束后，用缓冲液冲洗载玻片 3 次，然后每张载玻片加入 100 µL 生物素标记的二抗。按 1:100 稀释比例加入二抗，室温孵育 30 分钟。孵育结束后，再次用 TBST 缓冲液冲洗载玻片 3 次。每张载玻片加入 3 滴 Vector ABC 染色试剂，室温继续孵育 30 分钟。用TBST洗涤一次，将载玻片从测序仪转移到PBS中的载玻片架中。随后将载玻片浸入DAB底物中，最多5分钟，并密切观察，确保棕褐色染色不过深。接着用稀释的苏木精溶液复染10秒，充分冲洗载玻片，先用自来水，再用去离子水冲洗，然后将载玻片依次在95%乙醇中脱水两次，每次2分钟，在100%乙醇中脱水两次，每次2分钟，最后在二甲苯中处理两次，每次2分钟。最后，向每张载玻片滴加数滴封片剂，并盖上盖玻片。现在，Hein DW 将使用 moic photo 显微镜检查染色组织切片，观察结肠黏膜隐窝中 ERCC1 的表达情况。我们将首先在 moic photo 显微镜下使用 20 倍物镜观察一段结肠组织切片。黄色箭头指向一个结肠隐窝。该隐窝内大约有200个结肠隐窝细胞。这些是S间质细胞。这是隐窝腔，而这是结肠腔，粪便通过此处排出。结肠隐窝细胞有三种不同类型。杯状细胞的形状略似高脚酒杯，其细胞核位于隐窝的外缘，如图中所示，并以红色突出显示。在隐窝内侧的细胞部分，还可见一个膨大的区域，其中充满了白色的黏液颗粒，如图所示。另外两种细胞在我们的染色切片中形态较为相似，分别为吸收细胞和肠内分泌细胞，它们的细胞核也位于隐窝外侧，即细胞基底部，此处由红色圆圈标示。该部分组织经ER CC1染色。棕色染色显示ER CC1的定位。本切片中所有腺泡的几乎所有细胞核均显示ER CC1正常高表达。蓝色染色为苏木精，可对细胞核中的DNA进行染色，如图所示。隐窝中的细胞核呈棕色较蓝色更深，这是由于ERCC1的高表达所致。接下来，我们将使用10倍物镜在组织中进行观察。注意，大多数结肠隐窝显示出较高的 EER CCC1 表达水平。此处有一区域，少数隐窝的 ER CCC1 表达较低，表现为细胞核呈蓝色染色。当我们接近组织末端时，可观察到另一区域也表现出较低的 ER CCC1 表达。现在我们将返回并更仔细地观察那些ERCC1缺陷的隐窝。使用20倍物镜观察，我们可以看到低ERCC1表达的隐窝与高ERCC1表达的隐窝相邻。请注意，ERCC1蛋白在缺陷隐窝的细胞质中表达更为强烈，表明ERCC1虽能产生，却无法进入细胞核。现在使用 40 倍物镜，我们可以更清楚地观察到，与细胞质中几乎不含 ERCC1 的隐窝内高表达的细胞核相比，该缺陷隐窝中的细胞核无法摄入 ERCC1。该组织样本取自一位既往患有结肠癌患者的活检。接下来，Nadia Una 将检测结肠黏膜隐窝中细胞色素 C 氧化酶 1（CCO1）的表达情况。我们可以使用 40 倍物镜，通过免疫组织化学染色观察结肠黏膜组织切片中细胞色素 C 氧化酶 1（CCO1）的表达。其中一种为胞质蛋白，在细胞核中不表达，因此细胞核仅呈现蓝色；CCO1在细胞质中表达，表现为棕色染色。在此视野中，我们可以观察到两个结肠隐窝，其中一个隐窝显示CCO1阳性表达，另一个则表现为CCO1表达缺失。在对该组织切片进行逐区观察时，您会注意到大多数结肠隐窝均呈现CCO1阳性表达。现在，Hoy Quinn 将向 CCO 展示一种免疫染色技术，用于标记隐窝中的干细胞区域及其功能。我们正在观察一张经过 CCO 染色的组织切片。相关研究报告指出，在隐窝底部存在少于五个干细胞，这些干细胞可产生隐窝中总共约 2000 个细胞。干细胞区域显示在图中红色方框所示位置。具有突变或表观遗传突变的干细胞可以占据整个干细胞微环境或占据其中一半。此处我们观察到 Crips 显示 ccl 的正常高表达，其中一个表示无突变的干细胞。在此，我们展示了一个突变导致整个隐窝染色发生变化的示例。对于CCL1，注意在整个隐窝中均缺乏CCL1表达，尤其是与正常染色的隐窝相比更为明显。此处我们还展示了另一个突变导致半个隐窝染色发生改变的示例。请注意，与此处显示高水平 CCO 一表达的隐窝区域相比，该隐窝区域显示出较低水平的 CCO 一表达。接下来，Nadia Suna 将展示 CCO 一免疫染色的隐窝横切面，并指出某些隐窝的横切面来源于缺乏 cco 一的突变干细胞。这是一张显示结肠隐窝横切面的组织切片免疫染色图，用于检测 CO 一的表达。我们将使用20倍物镜观察该切片。可见两对鱼刺结构显示出CO1的阳性表达，另有一个鱼刺结构显示隐窝中存在CCO1缺失。该隐窝在整个结构中均表现出CCO1表达缺失，其中所有隐窝干细胞均变为CCO1缺陷细胞。这两个隐窝显示出约 50% 的干细胞缺乏 CCO 一表达的半转化现象。这些干细胞产生了缺陷的半侧组织。接下来，Alex FTA 将检查组织切片的 CCO 一免疫染色，并识别组织中的结构成分，以确定组织中其他一些结构。我们将观察一段经CCO染色的组织切片，其中红框内指示的是一个淋巴小结，管腔边缘的间质细胞，也称为S型基质细胞，以及贯穿组织的肌层。接下来，我们将观察一张切片，该切片取自一位患者因结肠部分切除术后外观正常的组织区域。该区域紧邻结肠癌组织，可被认为存在一种“场效应缺陷”，即肿瘤由此区域发展而来。一些 Crips 的表达水平较高，而另一些则较低。对于 ERCC1，Christi Luau 将向我们展示如何评估这种组织。这是一幅使用 10 倍物镜拍摄的拼接图像，显示的是紧邻癌组织的一段组织切片，该切片进行了 ERCC1 染色，位于癌组织旁边。许多其他CRISPR样本通常缺乏ER CCC1。我们将使用40倍物镜开始评估ER C1表达水平，并根据ER CC1的表达水平为CRISPR样本评分，评分范围从零到四。在低分辨率图像上，每个组织切片根据其表达水平用不同颜色标记：蓝色表示高水平（评分四），绿色表示较高水平（评分三），黄色表示表达降低（评分二），橙色表示表达极低（评分一），无表达则标记为零。0级。这是我们即将评分的第一个视野。如您所见，沿此边缘的细胞核几乎完全缺失。在另一侧边缘。存在少量表达，我们将此隐窝标记为染色程度极低的一级，并用橙色圆点表示。该隐窝几乎所有细胞核中均有较强染色，染色水平达到三级，以绿色圆点表示。相比之下，管腔侧的所有细胞核均呈现非常高的四级染色。该隐窝沿此边缘的ERC1表达水平较低，因此我们将其标记为黄色，表示二级。这个隐窝在一侧呈现高表达，在另一侧也呈现相当高的表达，因此我们用绿色圆点标记其总体表达水平为三级。该隐窝的ERC1表达降低，用黄色圆点标记为二级。这个隐窝具有高水平的四级表达，我们为其标记蓝色圆点。总体来看，这似乎使表达水平降低至二级，呈现黄色点。我们将 CRISPR 表达水平为零、一级和二级（分别对应红色、橙色和黄色）视为表达降低或缺失，而三级和四级（分别对应绿色和蓝色）则视为具有相对较高的表达。该组织切片中有 44 个 CRISPR 表达水平较低，23 个 CRISPR 表达水平相对较高。因此，在靠近结肠癌的组织切片中，67%的隐窝细胞表现出ERCC1表达降低或缺失。从同一组织块连续切下的组织切片，交替放置在不同的载玻片上，使我们能够在两张载玻片上观察同一结肠隐窝。这些组织切片取自紧邻结肠癌的组织区域。我们用针对ERC1的抗体染色一张切片，用针对PMs2的抗生素染色另一张切片。这些组织切片由Christi Luau提供。此处显示的是靠近结肠癌区域的连续切片之一，使用10倍物镜对EER CCC1进行免疫染色。你可以注意到，ERCC1 在靠近管腔处染色较深，尽管大多数隐窝未被染色。在更高倍镜下，你还可以观察到间质细胞中存在相同的圆形染色。由此可见，该隐窝中 ERCC1 表达水平较高。在此，我们展示了靠近结肠癌组织的另一张连续切片，该切片针对PS2进行了免疫染色。当我们观察该组织切片时，可见在已对ER CCC1染色的隐窝中，也出现了PMs2的染色信号。在更高倍镜下，我们观察到同一隐窝中pmms2的高表达。此处两个隐窝成对出现。您可以注意到此处ERC1表达水平较高。同样，用PMs2染色的同一隐窝也显示出高表达。这些邻近的 Crips 并未在此处和此处显示出高表达，而被认定为 PMs 2 的相邻 Crips 在此处和此处也未显示高表达。我们还使用免疫组织化学方法来确定缺乏 KU 86 和 CCO 1 的 Crips 的频率。在此张切片中，将对靠近结肠癌获取的整个组织切片进行 KU 86 的免疫染色。我们观察到，在该癌症相关组织切片中，少数隐窝（Crips）缺乏 KU 86。我们还使用免疫组织化学方法来确定结肠癌组织中缺乏 KU 86 和 CCL1 的隐窝（Crips）的发生频率。在本张切片中，我们使用 10× 物镜观察部分组织切片经 KU 86 免疫染色的结果。在观察组织的过程中，我们发现大多数隐窝均表现出高水平的 KU 86 表达。然而，正如红色框所示，有少数隐窝缺乏 KU 86。在本张切片中，Alex FTA 将展示一段来自神经性结肠癌组织的完整切片，并对其进行 CCO 1 免疫染色。我们现在观察的是距结肠癌组织一厘米处的组织切片，该切片经 CCO1 免疫染色后使用 10 倍物镜拍摄。我们可以观察到一个 CCO1 高表达的隐窝，以及一群 CCO 表达水平较低的隐窝。此处 O1 为高效加密隐窝。这部分表达水平较高，而这一部分表达水平较低。当我浏览该组织切片时，可以注意到大多数 Crips 具有较高的表达水平。我此前已对所有这些 Crips 进行过计数。总共有 189 个隐窝，其中 45 个缺乏 CCO1，该隐窝中缺乏 CCO1 的频率约为 23.8%。大约一半的隐窝高表达 NCCO1，而另一半隐窝缺乏 CCCO1。我们注意到，与 PMMS2 或 ERCC1 缺陷的隐窝相比，CCO1 缺陷的隐窝在结肠癌附近并不那么常见。CCO1 缺陷的隐窝在结肠癌附近的缺乏频率通常为 10% 至 20%，而 ERCC1 和 PMMS2 缺陷的隐窝在结肠癌附近的缺乏频率则通常在 70% 至 90% 左右。我们刚刚向您展示了如何从结肠黏膜中切割免疫染色组织切片，以检测在向结肠癌进展过程中可能起重要作用的蛋白质。我们还向您展示了如何评估这些组织中CRISPR相关蛋白的缺失情况。在进行该操作时，每个载玻片上应放置三个组织切片。在添加介质或孵育抗体时可能会产生气泡，这些气泡会阻碍抗体与组织切片充分接触，导致CRISPR蛋白或其部分区域无法充分结合抗体。隐窝的直径通常为60微米，而组织切片厚度为4微米，因此可能有多达15个组织切片穿过同一个隐窝。通常可以根据隐窝的形态特征作为指引，在载玻片上的多个组织切片中找到相同的隐窝。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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生物学

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