实验转移的含量
August 24th, 2010
本文介绍的，是用来确定人类癌症细胞系的转移潜能的一个实验性转移检测的程序。
以下实验的总体目标是通过尾静脉注射测试人类癌细胞的转移能力。在免疫缺陷小鼠中，准备注射细胞。然后将细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，一到两个月后会产生肺转移。
解剖小鼠，定量和培养肺转移。此类检测的结果表明特定类型癌细胞的转移程度。大家好，我是来自罗切斯特大学生物医学遗传学系 Dr.LE 实验室的 Sonali Mohanty。
今天我们将向您展示进行实验转移分析的程序。我们在实验室中使用该程序来研究癌症转移。那么让我们开始吧。
从生长至约 70%Co flulic 的细胞开始，从板中吸出培养基，然后用一个 XPBS 轻轻洗涤一次。接下来，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶反向。轻轻摇动板以促进细胞分离。
在显微镜下观察细胞脱离的情况。添加大量含有 FBS 的培养基，以淬灭活动中的跳闸。然后转移到 50 毫升试管中。
使用血细胞计数器对细胞进行计数。测定浓度后，以约 200 倍重力离心 3 分钟，不要干扰细胞沉淀。小心地去除培养基 Resu，悬浮适量的 Hank 平衡缓冲溶液或 HBSS，以达到约 5 倍 10 至每毫升 6 个细胞的最终浓度。
接下来，通过 Falcon 的 70 微米比色皿过滤器进行过滤。要排除大细胞聚集体，请将移液器的尖端直接放在过滤器上，放在 5 mL 培养管上。通过过滤器将悬浮液快速弹出到管中。
使用 trian blue 再次计数细胞以确定活力。注射前活力应大于 90%。然后稀释至终浓度 2.5 乘以 10 至每毫升 6 个细胞。
保持在冰上。轻轻抓住免疫缺陷小鼠的尾巴，将其拉入小鼠限制器中，使其背部靠在狭缝上，尾巴从背部的小开口中伸出。沿着狭缝慢慢向内滑动环。
一旦环卡住鼠标的嘴巴，就将其锁定到位。鼠标不应能够自由移动，但应具有正常的呼吸频率。找到主要的尾脉。
小鼠尾巴中存在四条主要血管。动脉位于尾巴的背侧和腹侧。静脉位于侧面。
将至少 200 微升制备的细胞吸入 1 毫升注射器中。连接 30 号半针并推出任何气泡。注射器中的最终体积应为 200 微升。
准备注射到尾巴的远端。因此，如果第一次试验失败，可以使用尾巴的更近端区域进行第二次尝试。用 70% 乙醇擦拭注射部位后，将尾巴笔直拉。
用拇指握住尖端，用食指支撑注射点。将针头插入静脉并注射细胞。在注射过程中，确保针头和注射器与静脉平行。
否则，针头会戳穿血管壁，细胞将被注射到相邻的尾部组织中。如果手术成功，请拔出针头。血液应从注射部位灌注。
按压干净的棉球以方便使用牙线，并向上触诊尾巴以将任何残留样品推入循环。将鼠标从限制器中释放，然后将其放回笼子中。在实验室笔记本中记录注射试验的次数和注射的细胞数。
确定注射后细胞的活力。与以前一样，此步骤可确保细胞在整个注射过程中保持活力。在注射实验结束时，细胞的活力会下降，但应保持在 80% 以上作为可选步骤，旋转剩余的细胞并用 PBS 冲洗沉淀一次。
然后将沉淀物在零下 80 摄氏度下冷冻，以备将来分析，例如蛋白质印迹。确认敲低时的基因表达 一到两个月后，解剖小鼠以确定转移的位置。首先将安乐死的小鼠放在解剖站上。
用乙醇大量喷洒小鼠。切开胸腔，露出肺和心脏。然后小心地切除它们并将它们放入 PBS 中。
肺是转移的主要部位，因为它包含细胞遇到的第一个毛细血管床。进入循环后，取出心脏并用 PBS 冲洗肺部，然后在解剖显微镜下观察肺的每个肺叶。计算肺两侧可检测到的转移灶的数量，然后一起计算所有四个肺叶上的肺转移灶的数量，以确定肺转移灶的总数。
接下来，使用剪刀通过切除来分离单个肺转移。将每个转移瘤转移到 70 微米的细胞过滤器中，并使用无菌针帽的末端将其切碎。用几毫升培养基冲洗细胞过滤器，并收集通过过滤器的细胞。
在培养皿中，每个培养皿都包含来自一个转移瘤的细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育至少四天，不受干扰。最初，癌细胞和成纤维细胞都会在平板上生长，但逐渐成纤维细胞会死亡并被癌细胞取代。
如果癌细胞携带任何耐药基因，请选择具有相应抗生素的细胞三天后，用 PBS 洗去培养皿上的任何血液或组织碎屑、碎屑，并加入新鲜培养基。通过用针对人特异性蛋白的抗体进行免疫染色来评估衍生细胞的纯度，即使在没有药物选择的情况下也可以使用抗人 menting 抗体。超过 99% 的细胞应该是人类。
现在可以将新衍生的细胞再次注射到免疫缺陷小鼠中，以在该测定结束时测试它们的转移能力。高度转移性的癌细胞系通常会引起许多肺转移，而极少数肺转移会来自转移性较差的癌细胞系。这些图像显示了注射人黑色素瘤细胞系两个月后的肺转移。
A 3 7 5 平方米使用这种方法衍生的细胞在测试时通常比亲本细胞系引起更多的转移。再次使用此检测，我们刚刚向您展示了进行实验转移检测的程序。
进行此程序时，请务必记住确保将细胞注射到尾静脉中，而不是注射到尾部和尾部组织中。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文描述了一种实验性转移测定法，用于通过免疫缺陷小鼠尾静脉注射评估人类癌细胞系的转移潜力。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 转移研究
- 实验生物学
背景
- 理解癌症转移对开发有效治疗至关重要。
- 实验性测定有助于量化癌细胞的转移潜力。
- 免疫缺陷小鼠为研究人类癌细胞行为提供了适当的模型。
- 尾静脉注射是评估肺转移的常用方法。
研究目的
- 测试人类癌细胞的转移能力。
- 量化和培养注射细胞产生的肺转移。
- 提供对不同癌细胞系转移潜力的见解。
使用的方法
- 准备人类癌细胞以供注射。
- 将细胞注射到免疫缺陷小鼠的尾静脉中。
- 监测一到两个月内肺转移的发展。
- 解剖小鼠以量化和培养肺转移。
主要结果
- 成功从注射的癌细胞中产生肺转移。
- 转移的量化提供了关于转移潜力的数据。
- 培养的转移可用于进一步分析。
- 结果表明不同癌细胞系之间的转移能力存在差异。
结论
- 实验性转移测定法有效评估癌细胞行为。
- 获得的见解可以为针对转移性癌症的治疗策略提供信息。
- 进一步的研究可以在这些发现的基础上探索潜在机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
The experimental metastasis assay provides a quantitative in vivo model to assess the metastatic potential of human cancer cell lines, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling the isolation and propagation of highly metastatic derivatives, the assay facilitates the identification of genes and pathways regulating metastatic progression, thereby informing lead identification and preclinical prioritization. This approach enhances predictive confidence in downstream therapeutic development by linking in vitro findings to functional metastatic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying metastatic ability of cancer cells following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo readout for functional target validation in metastasis-relevant pathways.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular alterations to metastatic phenotypes in immunocompromised mice.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metastasis counts that serve as dependent variables for screening modulators of metastatic dissemination.
- Operational Value: Standardizes cell preparation, injection, and tissue harvesting procedures to ensure reproducibility across experiments.
- Scientific Value: Enables derivation of metastatic cell lines with enhanced invasive properties for use in secondary screening and target deconvolution.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system where lung metastasis formation mirrors clinical patterns of hematogenous spread.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing re-injection of cultured metastases to assess stability of the metastatic phenotype.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery by enabling molecular profiling of isolated metastases compared to parental lines.
Pipeline & Workflow Integration
The assay functions as a discovery-stage tool that bridges target hypothesis testing with phenotypic validation, informing decisions on compound progression and mechanistic follow-up in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of metastasis regulators through quantitative lung colonization assays.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (metastasis number per lung) enabling comparison across genetic or chemical conditions.
- Analytics: Generates count-based data suitable for statistical analysis to determine significant differences in metastatic potential.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by providing a model that reflects organ-specific metastatic tropism.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating metastatic capacity across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by demonstrating causal links between gene modulation and metastatic suppression or enhancement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell viability thresholds (>90% pre-injection, >80% post-injection) and standardized injection volumes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional metastasis data that complements in vitro invasion and proliferation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated effect on metastatic burden in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, intravenous injection techniques, and aseptic tissue dissection.
- Dependent on access to immunodeficient mouse models and facilities for long-term animal housing (one to two months).
- Necessitates standardized protocols for cell preparation, viability assessment, and metastasis quantification to minimize variability.
- Involves technical considerations for metastasis isolation, including enzymatic or mechanical dissociation and filtration to obtain single-cell cultures.
- Limited to modeling early dissemination and lung colonization; does not capture later stages of metastasis such as extravasation or distant organ growth beyond the lung.
