Name: 实验转移的含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习通过尾静脉注射评估人癌细胞转移潜能的实验方法。本方案使用免疫缺陷小鼠模型，在注射后一至两个月内监测肺转移灶的形成，并对转移灶进行定量分析和培养，为肿瘤转移机制研究提供重要数据。

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该实验方案最初在麻省理工学院（MIT）Richard Hynes 博士的实验室中进行测试和优化。经费由纽约干细胞科学计划（NYSTEM）IDEA 奖项（资助 L.X.）以及露丝·L·柯施斯坦国家研究服务奖（Ruth L. Kirschstein National Research Service Award，资助 L.X.）提供。

1. 样品制备
<ol>
 <li> 在含有生长因子或胎牛血清（FBS）的特定培养基中（例如，MC-1 细胞使用含 10% FBS 的 DMEM）将细胞培养至约 70% 汇合度。吸除培养板中的培养基，并用 1 × PBS（8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.15 g/L Na2HPO4·7H2O、0.2 g/L KH2PO4，pH 7.3）轻轻洗涤数次。</li>
 <li> 吸除 PBS，加入 2 mL 含 0.05% 胰蛋白酶的 versene 溶液（含 0.014 g/L 酚红和 0.2 g/L EDTA-Na 的 1 × PBS，pH 7.2）。轻轻摇动培养板以促进细胞从板底脱落。在显微镜下观察细胞，通常需要 2–5 分钟细胞即可脱落。</li>
 <li> 加入足量含 FBS 的培养基（或大豆胰蛋白酶抑制剂）以终止胰蛋白酶活性，并将细胞收集至 50 mL Falcon 离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。取 10 μL 细胞悬液滴加到清洁的血细胞计数板上。每毫升细胞数等于五个大方格中每个方格的平均细胞数乘以 104。</li>
 <li> 在台式离心机中以 1000 RPM（或约 200 ×g）离心 3 分钟。</li>
 <li> 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用适量的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）重悬细胞，使其最终浓度约为 5 × 106 个细胞/mL。</li>
 <li> 通过 Falcon 70 μm 细胞筛过滤细胞，以去除大的细胞团块。将移液器尖端直接置于滤膜上方，对准已标记的 5 mL Falcon 培养管，迅速将悬液推过滤膜进入培养管中。</li>
 <li> 再次使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其稀释至最终浓度为 2.5 × 106/mL。将细胞置于冰上保存。</li>
 <li> 测定细胞活力。取部分细胞与台盼蓝混合，使用血细胞计数板测定蓝色（死亡）细胞占总细胞的百分比。注射前细胞活力应 ≥ 90%。</li>
</ol>
2. 静脉注射
<ol>
 <li>更换手套。轻轻抓住一只免疫缺陷小鼠（裸鼠、NOD-SCID 或 NSG，Jackson 实验室）的尾巴，将其拉入小鼠固定器中，使小鼠背部紧贴狭缝，尾巴从小固定器后部的小开口伸出。</li>
 <li>沿狭缝缓慢将环向内滑动，当环卡住小鼠口部时将其锁定。小鼠应无法自由活动，但应保持正常的呼吸频率。</li>
 <li>找到尾部主要静脉。小鼠尾巴中有四条主要血管。位于尾巴背侧和腹侧的血管为动脉，静脉则位于尾巴的两侧。</li>
 <li>将超过 200 μL 的制备好的细胞吸入 1 mL 注射器中。安装 30 G 1/2 英寸针头，并排出可能存在的任何气泡。注射器中细胞的最终体积应为 200 μL（即总共 5 × 105 个细胞）。</li>
 <li>将细胞注入尾静脉。
 <ol class="lalpha">
 <li>从尾巴远端开始注射，以便如果第一次尝试失败，可使用更近端的区域进行第二次尝试。</li>
 <li>用 70% 乙醇擦拭尾巴，将尾巴拉直。用拇指夹住尾尖，用食指支撑注射部位。</li>
 <li>将针头插入静脉并注射细胞。确保注射过程中针头和注射器与静脉平行，否则针头会刺穿血管壁，将细胞注入周围尾部组织中。</li>
 <li>注射后拔出针头。若注射成功，注射部位应有血液流出。用干净的纸巾或棉签按压注射部位以促进凝血，并从下向上轻柔按摩尾巴，推动静脉内残留的样品进入循环。</li>
 <li>将小鼠从小鼠固定器中释放并放回笼中。在实验记录本中记录注射过程（例如，注射细胞所用的尝试次数以及注射的细胞量）。</li>
 <li>按照样品制备部分第 9 步所述，测定注射后细胞的活力。此步骤可确认细胞在整个注射过程中保持存活。在注射实验结束时，细胞活力可能会有所下降，但仍应高于 80%。</li>
 <li>（可选）将剩余细胞离心，用 PBS 洗涤沉淀一次。将沉淀在 -80 °C 冷冻，用于后续分析（例如，通过 Western blot 检测基因表达或基因敲低效果）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>通常在一个月或两个月后，对小鼠进行解剖，并肉眼确定转移灶的位置。肺是主要的转移部位，因为当细胞进入循环系统后，肺是其遇到的第一个毛细血管床。</li>
 <li>用 PBS 冲洗后，在解剖显微镜下观察肺的每个叶（或其他含有转移灶的组织）（图 1）。计数肺两侧可检测到的转移灶数量，并将四个肺叶上的肺转移灶数量相加，得到肺转移灶总数1。若将肺组织在福尔马林中固定过夜，则更容易检测肺转移灶，因为转移灶会呈现为与周围深棕色肺组织形成对比的浅白色斑点。</li>
</ol>
3. 肺转移灶来源细胞的培养
<ol>
 <li> 从注射的小鼠中分离肺转移灶。每个转移灶应单独培养。</li>
 <li> 使用无菌的针帽末端在70 μm细胞筛网上将每个转移灶切碎。</li>
 <li> 用数毫升培养基冲洗细胞筛网，并收集滤过筛网的细胞至培养皿中。</li>
 <li> 将细胞在37 °C条件下孵育，至少四天内不要扰动。</li>
 <li> 用PBS洗去培养皿中的血液或组织碎片。</li>
 <li> 加入新鲜培养基。初期，癌细胞和成纤维细胞均会在培养板上生长，但随着时间推移，成纤维细胞将逐渐死亡并被癌细胞取代。如果癌细胞携带任何药物抗性基因，可使用相应的抗生素进行筛选。</li>
 <li> 通过使用针对人特异性蛋白的抗体进行免疫染色来评估所获得细胞的纯度。我们使用抗人波形蛋白抗体（NCL-VIM-V9, Novocastra）。所获得的细胞通常含有人源细胞比例超过99%，即使未进行药物筛选也是如此。新获得的细胞可再次注射至免疫缺陷小鼠体内，以检测其转移能力，方法如上所述。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<ol>
 <li> 在本实验结束时，高转移性癌细胞系通常会形成大量肺转移灶（图1）1，而低转移性癌细胞系则几乎不形成肺转移灶。</li>
 <li> 使用该方法获得的细胞在再次通过本实验检测时，通常比亲本细胞系产生更多的转移灶1-3。</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="显微镜下的组织样本，组织学实验中的细胞形态学研究，生物学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 小鼠尾静脉注射癌细胞后肺组织的代表性图像。将5 × 105个转移性人黑色素瘤细胞系SM细胞4注射至免疫缺陷小鼠的尾静脉中。两个月后，分离肺组织，发现转移灶散在于正常肺组织中。

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

转移是癌症患者死亡的主要原因。它包括四个主要步骤：癌细胞从原发部位脱落、进入循环系统（内渗）、离开循环系统（外渗）以及在远端器官中存活并增殖。在人体中，转移被认为是一个缓慢的过程，通常在多年潜伏期后才显现。为了及时研究其进展，已在免疫缺陷小鼠中建立了上述相对较快的实验方法4。自建立以来，该方法已被有效用于分离具有不同转移能力的细胞，鉴定在转移过程中上调或下调的基因1,2,5，并验证这些基因在转移过程中的因果作用3。

该实验中最困难的步骤是将细胞注入尾静脉。掌握注射技术需要反复练习。即使是经验丰富的研究人员，通常也需要经过数次尝试才能成功完成注射。小鼠尾部的静脉非常细，将针头准确插入静脉正中央并不容易。注射前使用灯短暂加温尾部并轻轻按摩，可促使血管扩张，从而有助于注射。大多数研究人员常犯的一个错误是认为静脉位于尾部较深的位置，因而将细胞注射得过深。实际上，静脉非常靠近皮肤表面，因此应尽可能进行浅层注射。

如果针头成功插入静脉内，注射过程应顺畅无阻力。如...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 离心管</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Falcon 培养管</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12; 号针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

实验性转移检测

Experimental Metastasis Assay

转移是癌症患者死亡的主要原因。为了理解转移的机制，研究人员建立了利用免疫缺陷小鼠的实验性转移检测方法。本文详细说明了该检测中的各项操作步骤，包括样本制备、静脉注射以及从肺转移灶中培养细胞。简而言之，预先确定数量的人类癌细胞被制备in vitro并通过尾静脉直接注入免疫缺陷小鼠的循环系统。少量细胞能够存活于血液循环的湍流环境中，并在肺等内脏器官中形成转移灶。注射一定时间后，解剖小鼠，利用解剖显微镜确定转移灶在组织中的分布情况。计数特定组织中转移灶的数量，该数量与所注射癌细胞的转移能力直接相关。将形成的转移灶分离并进行培养in vitro细胞系在再次注射到免疫缺陷小鼠体内时，通常表现出比亲本细胞系更强的转移能力。这些高转移性衍生细胞系成为识别调控转移进展相关基因或分子通路的有力工具。

本文描述了一种用于测定人癌细胞系转移潜能的实验性转移检测方法的操作步骤。

转移是癌症患者死亡的主要原因。为了理解转移的机制，建立了一种实验性转移检测方法……

以下实验的总体目标是通过尾静脉注射来检测人类癌细胞的转移能力。将细胞在免疫缺陷小鼠体内进行注射前准备，随后将细胞注射入免疫缺陷小鼠体内，经过一至两个月后，小鼠将形成肺转移灶。处死小鼠后进行解剖，定量并培养肺转移灶。此类检测的结果可表明特定类型癌细胞的转移程度。大家好，我是来自罗切斯特大学生物医学遗传学系LE博士实验室的Sonali Mohanty。今天我们将向您展示一种进行实验性转移检测的方法。我们在实验室中使用该方法来研究癌症转移。现在让我们开始吧。取生长至约70%汇合度的细胞，吸去培养板中的培养基，用一倍体积的PBS轻柔洗涤一次。随后，加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻摇动培养板以促进细胞脱落。在显微镜下观察细胞脱落情况。加入含有胎牛血清（FBS）的足量培养基以终止胰酶的消化作用，然后转移至50毫升离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。确定浓度后，在不扰动细胞沉淀的前提下，以约200 ×g离心3分钟。小心吸除培养基，用适量的Hank's平衡缓冲液（HBSS）重悬细胞，使其最终浓度达到约5 × 10⁶ 个细胞/毫升。接下来，使用 Falcon 70 微米细胞滤网进行过滤。为去除较大的细胞聚集体，将移液器吸头直接置于放置在 5 毫升培养管上的滤网上，迅速将悬液通过滤网排入管中。使用台盼蓝再次计数细胞以确定细胞活力。注射前细胞活力应高于90%。然后将细胞稀释至终浓度为每毫升2.5×10⁶个细胞。保持在冰上。轻轻抓住一只免疫缺陷小鼠的尾巴，将其拉入小鼠固定器中，使小鼠背部紧贴狭缝，尾巴从小后方的小开口伸出。缓慢沿狭缝将环向内滑动。当套环卡住小鼠的嘴部后，将其固定到位。小鼠不应能自由活动，但应保持正常的呼吸频率。找到尾部的主要静脉。小鼠尾巴中存在四条主要的血管。动脉位于尾巴的背侧和腹侧，静脉则位于两侧。将至少200微升的制备好的细胞吸入一个1毫升的注射器中。安装一个30号半针头，并排出所有气泡。注射器中的最终体积应为200微升。准备向尾部远端注射。如果首次尝试失败，可使用尾部更近端的区域进行第二次尝试。用70%乙醇擦拭注射部位后，将尾巴拉直。用拇指握住针尖，以食指固定注射点。将针头插入静脉并注入细胞。注射过程中，确保针头和注射器与静脉保持平行。否则，针头会刺穿血管壁，导致细胞被注入尾部周围组织。若操作成功，应撤出针头。血液应从注射部位灌注流出。按压干净的棉球以方便使用牙线，并从下向上触诊尾部，促使任何残留样本进入循环。将小鼠从固定器中释放并放回笼中。在实验记录本中记录注射尝试次数以及注射的细胞数量。在注射后测定细胞的活力。此步骤与之前一样，用于确认细胞在整个注射过程中保持存活。在注射实验结束时，细胞活力会有所下降，但应保持在80%以上。作为可选步骤，可将剩余细胞离心，沉淀用PBS洗涤一次。然后将沉淀物在 minus 80 degrees Celsius 下冷冻，以用于后续分析，如蛋白质印迹。为验证基因在敲低后的表达情况，在 1 至 2 个月后解剖小鼠以确定转移灶的位置。首先将已处死的小鼠置于解剖台上开始操作。用乙醇充分喷洒小鼠。剪开肋骨以暴露肺和心脏，然后小心地将其取出并置于 PBS 中。肺是转移的主要部位，因为它含有细胞进入循环后所遇到的第一个毛细血管床。细胞进入循环后，取出心脏，用 PBS 冲洗肺组织，然后在解剖显微镜下观察肺的每个叶。计数肺两侧可检测到的转移灶数量，再将四个肺叶的肺转移灶数量相加，以确定肺转移灶的总数。接下来，使用剪刀切除并分离单个肺转移灶。将每个转移灶转移至70微米细胞筛中，并用无菌针帽末端将其切碎。用数毫升培养基冲洗细胞筛，收集滤过筛网的细胞。在培养皿中，每个培养皿含有一个转移灶的细胞。将细胞在37摄氏度下孵育，至少四天内不要扰动。最初，癌细胞和成纤维细胞都会在培养板上生长，但随着时间推移，成纤维细胞将逐渐死亡并被癌细胞取代。如果癌细胞携带任何耐药基因，则使用相应的抗生素筛选细胞。三天后，用 PBS 洗去培养皿中的血液或组织碎片及残留物，并加入新鲜培养基。通过针对人特异性蛋白的抗体进行免疫染色，评估所获得细胞的纯度；此处即使未进行药物筛选，也使用抗人脑膜抗体。人源细胞比例应超过 99%。现在可将新获得的细胞再次注射到免疫缺陷小鼠体内，以在本实验结束时检测其转移能力。高转移性癌细胞系通常会产生大量肺转移灶，而低转移性癌细胞系则仅形成极少的肺转移灶。这些图像显示了注射人黑色素瘤细胞系两个月后的肺转移情况。375 个细胞。使用该方法获得的细胞在测试时通常比亲本细胞系产生更多的转移。再次通过该实验，我们刚刚向您展示了进行实验性转移实验的操作步骤。进行此操作时，必须牢记确保将细胞注入尾静脉，而非尾部皮肤或尾部组织。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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医学

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