Name: 人多能干细胞的免疫组织化学分析，使用自制Cytospin器械 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习使用自制Cytospin器械对人多能干细胞进行免疫组织化学分析。该方法可制备单层细胞，便于观察和定量分析SSEA-3/SSEA-4等细胞表面标志物，为干细胞研究提供经济可靠的技术方案。

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本研究的部分经费由美国国家科学基金会职业奖（NSF-CAREER 0744556，Rao）以及弗吉尼亚联邦大学-霍华德·休斯医学研究所科学教育与研究项目（VCU-HHMI Science Education and Research Program，Pascual）的奖学金提供支持。

第1部分：悬浮免疫细胞化学染色
<ol>
 <li>将细胞收集至单细胞悬液中。</li>
 <li>然后将细胞转移至1.5–2 mL微量离心管中，在200g条件下离心4分钟。</li>
 <li>通过吸除上清液，加入1 mL不含Mg2+和Ca2+的PBS--重悬细胞，再在200g条件下离心4分钟，洗涤一次。此步骤应重复两次。</li>
 <li>洗涤后，在室温下用1 mL 4%多聚甲醛（PFA）重悬细胞，固定10分钟。</li>
 <li>细胞再用1 mL PBS--洗涤两次。</li>
 <li>洗涤后，用1 mL封闭液（6%血清/94% PBS--）重悬细胞进行封闭，在室温下孵育45分钟。</li>
 <li>随后，在200g条件下离心4分钟，吸除封闭液，用1 mL一抗溶液（用封闭液按推荐稀释比例配制）重悬细胞。细胞可在室温下孵育1小时，或在4°C过夜，之后进入下一步。</li>
 <li>然后用1 mL封闭液洗涤细胞两次。</li>
 <li>之后，用1 mL二抗溶液（用封闭液按推荐稀释比例配制）重悬细胞，在室温下孵育1小时。</li>
 <li>1小时后，再用1 mL封闭液洗涤细胞两次。</li>
 <li>用封闭液洗涤后，再用1 mL PBS--洗涤细胞一次。</li>
 <li>经过上述各次洗涤后，用1 mL DAPI核染液（DAPI以1:10,000比例稀释于PBS--中）重悬细胞，在室温下孵育5分钟。</li>
 <li>5分钟后，在200g条件下离心4分钟，吸除DAPI染液，用1 mL PBS--重悬细胞。</li>
</ol>
第2部分：通过细胞离心涂片仪将人多能干细胞掺入载玻片
<ol>
 <li>使用台式钻床在塑料载片上钻出所需数量的孔，孔的直径应比所用微移液管尖端的最大直径最多大1 mm。</li>
 <li>用剪刀将滤纸裁剪至与塑料载片相同的尺寸。</li>
 <li>随后在滤纸上打孔，孔的大小应足以使微移液管尖端紧密穿过。</li>
 <li>之后，将一块准备好的塑料载片置于滤纸顶部，玻璃载片置于底部（图1）。用胶带固定各层。</li>
 <li>然后，将第1部分中染色后的细胞悬液最多100μL（根据所需的单层细胞密度而定）加入微移液管尖端顶部。</li>
 <li>如有必要，可对含有细胞溶液的装置进行称重，并制备一个重量相近的配重作为平衡物。</li>
 <li>将细胞离心装置和配重一同放入台式离心机，以200g离心4分钟。</li>
 <li>离心结束后，小心拆卸细胞离心装置，避免细胞从玻璃载片上脱落。</li>
 <li>如有必要，用移液器吸除玻璃载片周围多余的PBS液体。</li>
 <li>随后可使用荧光显微镜观察细胞，以确认是否已获得理想的单层细胞分布。</li>
</ol>
第3部分：载玻片封片
<ol>
 <li>将一滴所需的封片介质直接置于每个含有细胞的区域中央。</li>
 <li>随后，轻轻将盖玻片盖在载玻片上，尽量避免产生气泡。</li>
 <li>然后从载玻片上去除多余的封片介质。</li>
 <li>接着，用指甲油密封盖玻片的四周。</li>
 <li>载玻片可存放于避光的储存区域，直至观察并记录结果。</li>
</ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本实验室的操作中，将一皿35 mm的在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养的干细胞用于免疫细胞化学染色，并配合细胞离心涂片装置使用。通过酶消化传代的方法收集细胞，尽可能去除MEF层，制成单细胞悬液。若需更有效地从MEF层中分离干细胞，可先手动挑选克隆，再消化为单细胞悬液。若干细胞培养采用无饲养层条件，则可直接将克隆刮下并消化为单细胞悬液。尽管初始的单细胞悬液最为理想，但在免疫细胞化学染色过程中多次的洗涤和重悬步骤应能有效打散任何存在的细胞团块。
本视频重点介绍了使用细胞外标记物对人多能干细胞（hPSCs）进行染色的方法。如果需要对hPSCs进行细胞内染色，则在加入封闭液（步骤1.6）之前需增加一个步骤：用通透化溶液（50 mL高盐缓冲液加25 μL Tween 20）将细胞洗涤三次，每次1 mL，然后再将细胞重悬于封闭液中。另一个需要强调的关键点是，从步骤1.9开始，在整个操作过程中应尽量减少样品暴露于光照，以防止二抗和DAPI核染料发生荧光淬灭。
由于该实验流程包含多次洗涤和重悬步骤，建议使用一个含有足量可传代干细胞集...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox 培养皿载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>可重复使用的塑料载玻片材料</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 预清洁显微载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10&amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 SSEA-4 单克隆抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>SSEA-4 染色用一抗</td></tr><tr><td>大鼠抗 SSEA-3 单克隆抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>SSEA-3 染色用一抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>SSEA-4 染色用二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>SSEA-3 染色用二抗</td></tr><tr><td>DAPI 二盐酸盐</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

使用自制细胞离心涂片装置对人类多能干细胞进行免疫细胞化学分析

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），因其无限的自我更新能力以及分化为多种细胞类型的潜力，成为极具前景的细胞来源。hPSCs的多能性状态通常通过qPCR、免疫细胞化学以及其他技术进行评估。in vitro和in vivo可分化为多种细胞类型。其中，免疫细胞化学技术已发展用于常规鉴定hPSCs的未分化状态，主要基于候选细胞内及细胞表面生物标志物的分析。由于hPSCs以集落形式生长，在常规基础上对单个细胞水平的这些标志物表达进行定量时存在困难。流式细胞术分析可解决此问题，但需要较多细胞数量及试剂用量，通常不适用于hPSC培养的常规质量控制评估。因此，开发实用且可重复的方法以制备保持完整性的单层细胞样本用于标志物检测，在干细胞研究中具有诸多优势。这将极大促进免疫细胞化学分析，因为可方便地观察和定量单层中的单个细胞对特定标志物的表达。为实现这一目标，本研究构建并优化了一种自制的细胞离心涂片装置，适用于免疫细胞化学染色。本方案以一种变异型BG01干细胞系为例，分析了两种细胞表面标志物（SSEA3/SSEA4）的表达。

基于自制的细胞离心装置制备细胞单层，从而实现对人多能干细胞（hPSCs）表面标志物（SSEA-3/SSEA-4）进行悬浮免疫细胞化学染色，以便观察与定量分析。

人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），是一类具有广阔前景的细胞……

大家好，我是里克·帕斯夸（Rick Pasqua），来自弗吉尼亚联邦大学化学与生命科学系的干细胞工程实验室。在本视频中，我将演示我们实验室如何使用一种低成本且自制的STO旋转装置，制备出可观察的人类多能干细胞单层，以实现对细胞表面标志物的定量分析。由于许多免疫化学检测方案通常是针对在腔室载玻片上以克隆形式生长的人多能干细胞（hPSCs）而优化的，因此在单个细胞水平上表征生物标志物表达时可能会出现问题。将细胞培养成单层不仅有助于对细胞进行直观分析，还可能有利于定量检测其表达水平。我们实验室使用的细胞铺展装置可以通过大多数实验室常见的材料制备，仅需少量细胞样本，且无需任何特殊试剂。更重要的是，该装置能够稳定地获得分散的单个细胞，便于观察。以下是构建该细胞铺展装置所需的一些材料。塑料载玻片，由于不一定需要清洁，因此如有需要，可以使用旧的腔室载玻片。预清洁的玻璃载玻片。这些载玻片需要进行清洁，因为细胞单层将在此形成。滤纸，任何类型均可，以及微量移液器吸头。我们实验室在开始构建前使用的是1至10微升规格的吸头。应先在塑料载片上打孔。可以使用台式钻床完成此操作。孔的直径取决于微量移液器吸头的大小，应约为标准1至10微升微量移液器吸头最宽部分的宽度，即大约7 mm。在塑料载片上打孔的数量完全取决于您的具体用途。例如，在我们实验室的免疫化学染色中，通常使用两个孔，一个用于阳性染色，另一个用于阴性背景对照。这些载片可以无限次重复使用。对于滤纸，只需将其裁剪成与塑料载片相同的尺寸。以载片上的孔为参考，在滤纸上打上相应位置的孔。滤纸上的孔应足够大，以便微量移液器吸头能够紧密贴合，如图所示。然后需要剪取适当数量的微量移液器吸头，每个孔对应一个，长度约为其一半。这将作为玻璃载片的基底，用于形成细胞单层。接下来，将滤纸放置在其上方。滤纸将用于吸收悬液染色过程中多余的培养基。然后用塑料载片覆盖，作为装置的固体支撑。最后，可用普通家用胶带将四边完全密封。最后，将完整的微量移液器吸头插入装置的切口端。此处用于放置悬浮染色后的细胞样本。为便于识别，也可先在载玻片上标记出切口端吸头所在的位置。我们实验室使用的免疫化学悬浮染色方案首先涉及将干细胞收集为单细胞悬液，通常通过使用胰蛋白酶或基于EDTA的非酶细胞解离缓冲液进行酶解来完成。然后将细胞转移至1 ml或2 ml的微量离心管中，并加入标准培养基。随后在200 ×g下离心4分钟。所有后续的洗涤和离心步骤均使用相同的离心速度。然后手动吸除上清液，在吸液时需格外小心，以确保细胞沉淀不受扰动。随后用 1 ml PBS 洗涤两次，每次均需离心并吸除上清液。下一步是使用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，该试剂的配制方法或所需试剂已在本视频的配套文字说明中列出。将细胞置于4%多聚甲醛溶液中，在室温下孵育10分钟。建议在进行细胞外悬浮染色以及使用细胞离心涂片装置（cyto spin apparatus）之前完成此步骤。随后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的 PFA。然后应对细胞进行封闭，以防止非特异性染色。在上一步 PBS 洗涤后，吸去洗涤液，并加入 1 ml 封闭液。然后在室温下放置约45分钟。在等待封闭液作用的同时，可将一抗用推荐的稀释比例溶于封闭液中进行配制，并于4°C保存。细胞在封闭液中孵育约45分钟后，离心并吸除封闭液，将细胞重悬于一抗溶液中。为了检测非特异性结合和背景信号，最好至少保留一个样本作为阴性对照，即不加一抗，仅将细胞重悬于PBS中。所有样品在室温下放置约一小时。如有需要，固定后的细胞可在一抗溶液中悬浮过夜，随后用封闭液洗涤两次。洗涤过程中可配制二抗溶液。二抗通常对光敏感，因此应尽量调暗实验室灯光，并用铝箔包裹所使用的容器，以防止荧光淬灭。可以将抗荧光淬灭剂加入实验步骤中，但需谨慎使用，因其可能导致背景信号升高。将一抗用封闭液稀释至推荐浓度后加入。洗涤完成后，无论样本是否添加了一抗，均需向所有样本中加入一滴抗荧光淬灭剂。将此置于黑暗处（例如容器内）静置约一小时。用一毫升封闭溶液洗涤细胞两次。此时细胞应已准备好进行DPI染料的核染色。首先将DPI溶液用PBS按1:10,000的比例稀释，用1 ml PBS洗涤细胞一次，然后重悬并悬浮于DPI溶液中，在室温下静置约5至10分钟。与二抗类似，DAPI对光敏感，因此需采取必要措施避免荧光淬灭。用1 ml PBS洗涤一次，最后重新悬浮。再次悬浮于1 mL PBS中。此悬液即可用于细胞离心涂片装置。取最多100微升单细胞溶液，加入微量移液器吸头顶部。建议使用较少的量，以避免不必要的溢出或滴落。随后，将细胞离心装置和平衡物放入台式离心机中，在1000 RPM条件下离心4分钟。之后，小心拆卸细胞离心装置，操作时应尽量减少细胞从玻片上脱落的可能性。在封片前，需在荧光显微镜下确认细胞已充分沉降。这些图片来自细胞离心涂片装置制备的单层BG one V细胞，经SSCA四细胞表面标志物染色。注意细胞彼此之间分离良好，便于进行单细胞观察和记录。该实验方案的优点在于能够稳定地培养出单层细胞，具有可行性高、成本效益好以及易于适应各种干细胞培养常规分析的特点。希望本视频对您有所帮助，并能在您自己的研究中应用该实验方案。

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人多能干细胞的免疫组织化学分析，使用自制Cytospin器械

免疫细胞化学是一种强大的方法，用于确定培养细胞中目标抗原的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列简单易行的步骤，帮助使用者节约抗体并最大限度地优化染色效果。...

免疫细胞化学：人神经干细胞

多能干细胞在悬浮培养中可分化形成类胚体（EBs）。本文展示了如何获得高质量的类胚体冷冻切片，这些切片可用于研究胚胎发生过程中的细胞和分子特征，同时保持其作为细胞聚集体的原有结构。...

通过胚胎体冰冻切片分析多能干细胞

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

本方案提供了一种简单高效的方法，仅使用来源于人胎盘的条件培养基，在明胶包被的培养皿中传代培养人多能干细胞（hPSCs），无需额外添加外源性成分或hPSC特异性的合成基质。...

一种在胎盘条件培养基中利用明胶培养人多能干细胞的新颖培养模型

在将诱导性多能干细胞（iPSCs）用于其他应用之前，常规鉴定这些细胞以确认其多能状态的维持情况，是一项重要的步骤。本文介绍一种专为通过免疫细胞化学方法对人iPSCs进行简便且常规鉴定而设计的小规模传代培养方法。...

无血清条件下小规模扩增人iPSC用于常规免疫细胞化学鉴定

本方案介绍了一种在无异种成分且无饲养层细胞的培养条件下，将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞的简单两步法。此处提供的细胞培养方法能够以较低成本大规模生产具有临床质量的细胞，适用于角膜细胞治疗。...

高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本文介绍了一种自动化细胞培养系统的操作方案。该自动化培养系统可减少人工操作，便于用户使用，尤其有助于不熟悉诱导性多能干细胞（iPS细胞）操作的研究人员，实现从iPS细胞的维持培养到向多种细胞类型分化的全过程。...

一种用于维持和分化人诱导性多能干细胞的自动化培养系统

学习使用自制Cytospin器械对人多能干细胞进行免疫组织化学分析。该方法可制备单层细胞，便于观察和定量分析SSEA-3/SSEA-4等细胞表面标志物，为干细胞研究提供经济可靠的技术方案。

使用自制细胞离心涂片装置对人类多能干细胞进行免疫细胞化学分析

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