Name: 慢性沙门氏菌感染小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解建立慢性Salmonella typhimurium感染小鼠模型的方法，通过灌胃给药和粪便检测实现肠道持续定植。该模型可用于研究宿主-病原体相互作用及长期感染机制，为开发治疗策略提供重要实验基础。

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本工作获得了NIDDK KO1 DK075386基金以及美国癌症协会RSG-09-075-01-MBC对Jun Sun的资助。

本方案包含三个部分：细菌培养、小鼠灌胃和 沙门氏菌 检测
1. Salmonella 生长条件。
<ol>
	<li>制备 沙门氏菌 LB 培养基平板，37 °C 培养 37° C 过夜。</li>
	<li>从LB平板上挑取一个克隆，放入含有7 ml LB培养基的12 ml离心管中，振荡培养 37°C 约5小时。</li>
	<li>接种50 ml LB培养基，加入0.05 ml对数期末期培养物，并在37°C下培养 37°C 静置约18小时，不进行振荡。</li>
	<li>将过夜培养的细菌在室温下以6000 rpm离心10分钟，用HBSS按100:3的比例（LB: HBSS）重悬细菌。例如： 每50 ml LB培养物将悬浮于1.5 ml HBSS中。</li>
	<li>对于动物灌胃，将细菌培养物进一步按1:10比例稀释。例如： 每1.5 ml LB培养物将悬浮于15 ml HBSS中。</li>
</ol>
2. 沙门氏菌感染模型*。
<ol>
	<li>配制链霉素溶液。每只小鼠需给予7.5 mg链霉素溶于100 μl HBSS中。例如，为10只小鼠配制总量为90 mg链霉素溶于1.2 ml HBSS的溶液。配制链霉素溶液时，应始终多准备一些体积。</li>
	<li>在口服灌胃处理前4小时停止供应饮水和食物。</li>
	<li>通过灌胃法给予小鼠7.5 mg链霉素（对照组小鼠给予100 μl HBSS）。用拇指和中指牢固抓住小鼠肩部皮肤，用食指伸直其头部与颈部，使食管保持平直。将喂养针的圆头沿口腔顶部向咽后部右侧推进，然后轻柔地进入食管，并注入100 μl溶液。操作过程中不应感到任何阻力。</li>
	<li>链霉素处理后20小时，再次停止供水和食物，随后对小鼠进行细菌感染。</li>
	<li>每只小鼠通过口服灌胃给予100 μl HBSS中的菌液悬液，或给予无菌HBSS（对照组）。灌胃操作步骤同2.3）中链霉素灌胃方法。</li>
</ol>
动物实验采用6至7周龄的无特定病原体雌性C57BL/6小鼠（Taconic，Hudson，NY）进行，具体方法如前所述1。实验方案经罗切斯特大学动物资源使用委员会（UCAR）批准。
3. 检测 沙门氏菌 在肠道中。
<ol>
	<li>收集小鼠粪便（约 100 mg）。</li>
	<li>将粪便样本转移至含有 1 ml PBS 的 1.5 ml 微量离心管中，并剧烈涡旋振荡。</li>
	<li>以 800 rpm 离心 10 分钟，将上清液转移至新的洁净微量离心管中。</li>
	<li>以 6000 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，向沉淀中加入 200 μL PBS 并涡旋振荡。</li>
	<li>用一次性细胞涂布器将 200 μl PBS 涂布于 BBL CHROMagar 平板上，以检测 Salmonella。Salmonella 菌落呈紫红色（从粉红至紫色，见图 1）。若 200 μl 样本导致平板上菌落过多，可改用 100 μl 或 50 μl 进行涂布。</li>
</ol>
4. 代表性结果。
当实验方案正确执行时，可在小鼠肠道内检测到 Salmonella typhimurium 的定植，持续超过6个月。Salmonella 可通过粪便培养在感染后6个月以上仍被检测到（图1）。该模型的典型结果是，在感染后4周内出现体重下降和死亡。根据所使用的 Salmonella 菌株不同，部分小鼠可能无法存活超过6个月。
<img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="细菌细胞形态，革兰染色，显微镜图像，显示紫色和粉红色染色的细菌。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 肠道 沙门氏菌 在 沙门氏菌 菌落呈紫红色（从玫瑰色至紫色），这是由于在特定显色剂存在下代谢差异所致。其他细菌则被抑制，或形成蓝绿色或无色菌落。
<img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="生存分析图；生存率 vs. 天数；对照组 vs. PhoPc 组；实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 感染 Salmonella 突变株 PhoPc、PhoPc AvrA-、PhoPc AvrA-/AvrA+ 和 PhoPc AvrA 的小鼠在 4 周（28 天）内的生存比例。
表1. 感染小鼠的体重 沙门氏菌 4 周。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>0</td>
			<td>1 周</td>
			<td>2 周</td>
			<td>3 周</td>
			<td>4 周</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照</td>
			<td>16.78 ± 1.05</td>
			<td>16.91 ± 1.28</td>
			<td>18.26 ± 1.23</td>
			<td>19.31 ± 1.26</td>
			<td>20.26 ± 1.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc</td>
			<td>16.89 ± 1.03</td>
			<td>17.14 ± 1.19</td>
			<td>17.43 ± 1.63*</td>
			<td>18.68 ± 1.78</td>
			<td>20.05 ± 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPcAvrA-</td>
			<td>16.91 ± 1.12</td>
			<td>16.96 ± 1.39</td>
			<td>17.06 ± 2.14**</td>
			<td>18.71 ± 2.18</td>
			<td>20.15 ± 1.56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc AvrA-/AvrA+</td>
			<td>16.94 ± 0.96</td>
			<td>17.17 ± 1.02</td>
			<td>17.63 ± 1.42*</td>
			<td>18.44 ± 2.03</td>
			<td>20.09 ± 1.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*与对照组相比，p&lt;0.05 
**与对照组相比，p&lt;0.01
表2. 本研究中使用的Salmonella菌株。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>描述</td>
			<td>参考文献或来源</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella 14028s</td>
			<td>野生型 S. typhimurium</td>
			<td>ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc</td>
			<td>非致病性复杂调控因子突变株</td>
			<td>Miller et al., 1990</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc AvrA-</td>
			<td>AvrA- 突变</td>
			<td>Collier-Hyams et al., 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPcAvrA-/AvrA+</td>
			<td>携带编码 AvrA 的互补质粒的 PhoPcAvrA- 菌株</td>
			<td>Collier-Hyams et al., 2002</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

使用该系统需要研究人员掌握对动物进行灌胃的技术。我们详细介绍了一种制备细菌培养物并对小鼠进行灌胃的方法。我们还展示了如何监测沙门氏菌（Salmonella）在胃肠道（GI）中的持续存在情况。本方案中的关键步骤包括： <ol> <li>链霉素预处理：链霉素预处理可清除部分共生肠道菌群，使小鼠易于感染Salmonella2。</li> <li>Salmonella 灌胃：对初学者而言，灌胃操作可能具有挑战性。有时灌胃失败，原因是溶液误注入气道，导致小鼠死亡。</li> <li>持续性细菌定植：需密切监测胃肠道内的细菌。除小鼠粪便培养外，盲肠内容物也可用于BBL CHROMagar平板上的Salmonella检测。在Salmonella感染后处死小鼠时收集盲肠内容物。</li> </ol> 我们已在不同浓度下检测了Salmonella在小鼠体内的定植情况：1 × 103 至 1 × 108 菌落形成单位（100...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>喂养针</td><td>Popper &amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>一次性细胞涂布棒</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性 salmonella 感染小鼠模型

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

细菌感染小鼠模型是研究感染、炎症、免疫学、信号转导以及肿瘤发生等领域的一种强大模型系统。许多研究人员已利用由结肠炎所诱导的Salmonellatyphimurium 进行炎症和感染早期阶段的研究。然而，关于慢性感染的报道却很少。in vivo. 小鼠具有Salmonella胃肠道中的持续存在使我们能够探索长期的宿主-细菌相互作用、信号转导以及肿瘤发生过程。我们已建立了一种慢性细菌感染的小鼠模型，用于Salmonella沙门氏菌在小鼠肠道内定植长达6个月。使用该系统需要研究人员掌握细菌培养物的制备以及对动物进行灌胃的技术。我们详细描述了制备细菌培养物和对小鼠进行灌胃的方法。同时，我们也展示了如何检测Salmonella在胃肠道中的持续存在。总体而言，本方案将有助于研究人员利用细菌感染小鼠模型来解答具有根本重要性的生物学和微生物学问题。

建立具有持续性慢性细菌感染的小鼠模型 沙门氏菌 肠道中鼠伤寒沙门氏菌定植持续27周。

慢性 Salmonella 感染小鼠模型

细菌感染小鼠模型是研究感染、炎症、免疫学、信号转导等领域的有力模型系统。

本实验的总体目标是建立一种慢性沙门氏菌感染的小鼠模型。首先制备沙门氏菌溶液，然后通过灌胃法给予小鼠链霉素，随后接种沙门氏菌，或仅给予链霉素。该实验步骤的第三步是从小鼠粪便中分离沙门氏菌，并使用BL显色平板检测小鼠肠道内的沙门氏菌感染。实验步骤的最后一步是观察并记录小鼠体重，以及记录沙门氏菌感染后活力的变化。最终可获得结果，表明通过灌胃方式可成功在小鼠肠道内建立沙门氏菌感染。大家好，我是来自罗切斯特大学医学院约翰逊博士实验室的Michelle P。我同时也来自孙实验室，我是孙实验室的Y。今天我们将向您展示一种建立感染性利纳尔小鼠模型的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究宿主与细菌相互作用的信号转导以及肿瘤发生。现在开始操作。实验前，为每种沙门氏菌菌株准备足量的LB液体培养基平板，并在实验过程中使用。平板可冷藏保存数月。接下来，准备沙门氏菌培养物。取出一管在负80摄氏度下冷冻保存的沙门氏菌原液，在台面上解冻，以用于涂布沙门氏菌平板。将接种环在酒精灯上灭菌后，浸入解冻的菌种中。在LB平板的上三分之一区域来回划线。再次灼烧接种环，并旋转平板。以Z字形划线穿过前一次的划线区域，将细菌涂布到平板的第二个三分之一区域。重复操作一次。再次灼烧接种环。切勿让接种环刺入琼脂内部。将培养皿置于37摄氏度培养箱中过夜培养，使菌落生长。若操作正确，沙门氏菌培养皿至少在一个区域应形成单个菌落。第二天，使用无菌牙签或细菌接种环从 LB 平板上挑取一个单克隆，接种于 12 毫升离心管中的 7 毫升 LB 培养基中，在 37 摄氏度下振荡培养约 5 小时。取 0.05 毫升该培养物接种于 Falcon 管中的 50 毫升 LB 培养基中。在 37°C 下静置培养约 18 小时。在室温下以 5,000 RPM 离心 50 毫升细菌过夜培养物 10 分钟，弃去上清液。接着，在离心管中加入 1.5 毫升 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）以重悬细菌，或按 LB 与 HBSS 体积比为 100:3 加入。然后用 HBSS 将总体积补至 15 毫升，或维持 LB 与 HBSS 体积比为 1:10。每只小鼠需要接种100微升稀释后的沙门氏菌培养物，即含1×10⁶至1×10⁸个菌落形成单位的菌液。在开始灌胃前4小时，需停止供应小鼠饮水和食物。灌胃前立即配制链霉素溶液：将7.5毫克粉末状链霉素溶于100微升HBSS中。为每只待注射的小鼠准备溶液时，应额外多准备一定体积，以弥补灌胃前可能的损耗。首先，准备一支装有100微升链霉素溶液的灌胃针。将第一只小鼠从笼中取出以进行灌胃，使小鼠朝向实验台方向固定。用拇指和中指牢固地抓住小鼠肩部皮肤，并用食指伸展其头部与颈部，使食管伸直。将喂养针的球形针尖沿上颚向咽后部右侧引导，然后轻柔地将其送入食管，并注入100 µL链霉素溶液。操作过程中不应感到任何阻力。对所有接受实验的实验组和对照组小鼠重复此过程。在链霉素处理及灌胃后约20小时，以及沙门氏菌灌胃前4小时，移除将接受口服沙门氏菌灌胃的小鼠的饮水和食物。以与之前相同的方式对每只小鼠进行灌胃，使用100 µL的HBSS沙门氏菌溶液。灌胃后，将每只小鼠转移至新笼子以开始粪便收集。从灌胃后约八小时开始，小鼠排便后立即从笼中取出粪便。收集100毫克小鼠粪便作为实验样品。根据研究周期的长短，每日或每周采集粪便样本用于沙门氏菌分析。将粪便样本转移至含有1毫升PBS的1.5毫升微量离心管中，充分涡旋混匀后，在800 RPM条件下离心10分钟。将上清液转移至干净的1.5毫升离心管中，在6,000 RPM条件下离心5分钟。弃去上清液，向沉淀中加入 200 µL PBS，涡旋振荡以重悬。接着，使用 BB l roag 平板检测沙门氏菌。每块平板使用 10 至 100 µL 粪便溶液，按第二节所示方法涂布于平板上。由于在特定显色剂存在下代谢特性的差异，沙门氏菌菌落呈现紫红色。通过计数培养皿上沙门氏菌的菌落数量，以比较不同小鼠之间的感染水平。在本实验中，我们使用了6至7周龄的无特定病原体雌性C57BL/6小鼠。小鼠感染了沙门氏菌以及链霉素加HBSS。对照组小鼠仅通过灌胃给予链霉素。所使用的沙门氏菌菌株包括：鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株ATCC 14028 S FPC、非致病性沙门氏菌突变株，以及来自James Madera博士实验室的三种携带毒力相关AAV R age基因的FPC菌株，该基因位于PSKW29低拷贝质粒中。采用此方案，可在小鼠肠道中检测到鼠伤寒沙门氏菌的定植。通过粪便分析测量慢性沙门氏菌感染，并采集体重及肠道组织样本用于免疫荧光染色。通常在感染后四周内出现体重下降和死亡。此处显示感染后四周的存活比例。小鼠在感染后存活超过四周后，体重开始增加，且在随后的23周内死亡事件减少。总体而言，感染鼠伤寒沙门氏菌菌株FSY fsy、A VRA null或fsy. A VRA杂合子的小鼠中，超过65%可在肠道持续感染的情况下存活超过六个月。急性感染后，幸存小鼠体内仍携带沙门氏菌，使用本方案所述方法可在感染后六个月检测到该菌。对感染后27周小鼠肠道组织样本进行免疫荧光分析，结果显示沙门氏菌已侵入肠黏膜。在该图像中，细胞核染成蓝色，感染沙门氏菌的区域显示为绿色。如对照组所示，未见亮绿色染色，表明无沙门氏菌定植。而在感染沙门氏菌的小鼠中，感染后27周时可见肠道黏膜出现亮绿色染色。这表明在链霉素预处理的小鼠中，沙门氏菌感染持续存在。我们刚刚向您展示了如何在小鼠模型中诱导慢性感染。进行此操作时，重要的是要记住，需新鲜制备培养物用于接种，掌握正确的接种技术，并检测抗核抗体（ANA）的存在，以确保您的实验模型有效。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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