双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪
2010年6月12日
本文介绍了如何正确使用BioRad公司赫利奥斯基因枪引入洋葱表皮细胞的质粒DNA，以及如何测试基于双分子荧光互补的原则（附设）洋葱细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用
该程序测试两种拟南芥转录调节因子（seus 拼写为 SEU，简称 SEU 和 lu holog 或 LUH）之间的体内蛋白质相互作用。通过利用生物分子荧光互补，将 seus 融合到黄色荧光蛋白或 YFP 的末端片段上，并将 LUH 融合到两个质粒构建体的 Y-F-P-D-N-A 的 C 末端片段上。Seuss、NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 被轰炸到洋葱表皮细胞中以测试它们的相互作用。
Seuss 和 LUH 之间的相互作用导致细胞核中 YFP 的末端末端和 C 末端片段结合，从而导致细胞核中的 YFP 荧光。在黑暗中孵育 16 至 20 小时后，在荧光显微镜下观察洋葱表皮，以便观察荧光。大家好，我是来自马里兰大学细胞生物学和分子遗传学系 Zhi Lu 博士实验室的 Courtney Hollander。
今天，我们将向您展示使用 BioRad Helios 基因枪测试洋葱细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的程序。我们在实验室中使用该程序来测试植物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质定位。那么让我们开始吧。
要开始此程序，请按照 Woods 和 Zeto 2008 的 Joe 视频协议为 Helios 基因枪准备墨盒，该方案详细演示了每种墨盒制备的墨盒制备程序。将 50 微克总血浆 DNA 与 12.5 毫克金颗粒和 0.5 毫克/毫升 PVP 溶液混合，用于 BIFC。结合相同的卡盒制备物，推定的相互作用蛋白 Seuss 的两个血浆 DNA 融合到 YFP 的 N 末端一半，缩写为 seus，NYFP 和 LU 同源物融合到 YFP 的 C 末端一半，缩写为 L-U-H-C-Y-F-P。
总量为每次制备 50 μg，每个小柱每 0.25 毫克金产生多达 50 个小柱，每 0.25 毫克金含有 1 μg DNA。每个墨盒用于一次射击。小柱制备后，测试小柱以了解金颗粒是否得到有效推进。
将一块方形的 paraform 包裹在培养皿周围。然后将氦气压力设置为 150 到 200 PSI 之间，并将新制作的墨盒发射到参数方格中。观察香水上微弱的金颗粒。
在不同的氦气压力下，不同数量的金颗粒可能会被推到香水上。但是，如果没有显著差异，请选择较低的轰炸压力。此测试还指示每次拍摄所覆盖的区域。
准备洋葱组织时，用干净锋利的剃须刀片从大黄洋葱上剥去外皮。切成 2 x 8 厘米的矩形区域，深 4 到 5 层。取出矩形洋葱纸巾，丢弃外层两层。
将洋葱的剩余层切成约 1.5 厘米见方的小块。将洋葱块放入装有 3 毫米滤纸圆圈的培养皿中。用无菌水润湿，盖上培养皿。
洋葱块已经准备好轰炸了。首先将小柱装入白色圆形小柱支架中，将包含不同质粒构建体的小柱装入不同的小柱支架中。每个墨盒支架最多可容纳 12 个墨盒，可进行 12 次拍摄。
这里加载了三种不同的支架。第一个支架的盒含有 35 个 S-G-F-P-A 强且组成型的启动子，这些启动子来自花椰菜花叶病毒。该质粒用作阳性对照。
第二个支架装有实验小柱，其中含有等量的 S-E-U-N-Y-F-P 和 L-U-H-C-Y-F-P。第三个卡套卡套装有卡套，其中含有冰球脊柱载体和 LUH 冰球香料的等摩尔混合物。这也用作阴性对照。
将电池和新鲜的枪管衬套插入 Helios 基因喷枪中。确保枪管衬套和枪都连接了各自的 O 形圈。接下来，将空卡套插入基因枪中，使卡套上的标记编号 12 面向枪的顶部。
将墨盒支架推进一次或两次，以确保其正确插入。然后将喷枪连接到氦气罐上，并将压力调节到 150 到 200 PS 之间。我戴上护耳装置，在扣动扳机的同时按住侧面按钮开枪几次。用空弹药筒支架射击喷枪，装填后清理喷枪腔并确保压力稳定。
在拍摄 DNA 之前，在这里拍摄一块洋葱可能是背景荧光的阴性对照。要拍摄 DNA 包被的金颗粒，请取下空的卡套，并插入包含阳性对照的第一个加载的卡套。推进弹药筒支架，使用于点火的弹药筒位于弹药筒支架的底部。
现在将洋葱块放在空培养皿的中间，洋葱的最内层朝上。将基因枪的枪管衬垫放在培养皿上并开枪。前进到下一个墨盒并射击不同的洋葱片。
重复此步骤，直到射出 4 到 5 片洋葱。每个洋葱片在射击后只能射击一次。将轰炸的洋葱片转移到装有潮湿的 3 毫米滤纸的培养皿中，以拍摄实验墨盒。
更换为盒式 Holden。第二，记得更换桶衬以防止污染。如刚才所示，为阳性对照拍摄四到五个洋葱片。
然后换成 Holden 墨盒。第三种，包含阴性对照 DNA。再一次，射出四到五块洋葱。
更换桶衬以防止污染。轰炸后。用盖子盖住装有洋葱块的培养皿。
用 Paraform 包裹它们以防止干燥。将洋葱片在室温下避光孵育 16 至 48 小时。轰炸完成后，关闭气体并释放压力，然后从氦气罐中拆下基因枪，拧下枪管衬垫并取下墨盒支架和用过的墨盒。
最后，将小柱支架和桶衬套浸入装有肥皂水的烧杯中，然后进行超声处理。20 分钟。然后，用水冲洗以去除所有肥皂残留物。
在 70% 乙醇中浸泡一小时，然后在纸巾上晾干。轰炸后 16 到 20 小时继续观察洋葱块。将轰炸的洋葱片在室温下孵育 16 至 20 小时后，使用平头镊子慢慢从洋葱内表皮上剥下单个细胞层。
这是轰炸期间直接面向火炮的层。将去皮的层放在带有盖玻片的载玻片盖上的一滴水上。但要小心尽量减少气泡。
使用荧光显微镜观察 GFP 或 YFP 荧光，例如 zes axio 观察器，此处显示的 Z 点在显微镜的明场下。首先检查细胞质流，以确保细胞是活的。要这样做。
将载玻片暴露在明场光下几分钟以加热洋葱组织，然后寻找移动的塑料细胞质流并不总是容易看到，因此如果它不清晰可见，请不要气馁。对于荧光检测，请使用 GFP 或 YFP 的适当激发和检测滤光片。还要检查阴性对照，即用非荧光质粒拍摄的洋葱片。
受伤的细胞、碎片和洋葱可能会出现微弱的黄色信号。另外，检查阳性对照。含有组成型表达荧光报告基因的质粒。
GFP 荧光见于部分细胞，但并非全部细胞中。气泡也可能产生背景荧光。来自洋葱表皮细胞的可见 GFP 信号表明弹药筒、洋葱组织和基因枪射击已正确准备和执行。
此处显示的是从 35 个 SGFP 阳性质粒中观察到的强荧光。在整个细胞中都可以看到强烈的荧光，包括细胞核和细胞质。明场图像允许人们看到细胞和细胞核的相应轮廓。
并非每个细胞都发生了转变。当实验组合 Seuss、NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 轰炸到洋葱细胞中时，在洋葱细胞核中检测到 YFP 荧光信号，表明 Seuss NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 在体内相互作用。然而，这种相互作用介导的荧光明显弱于阳性对照中的 35 个 SGFP 介导的荧光。
此外，SEUS 和 LUH 转录因子位于细胞核中。因此，仅在细胞核中观察到 YFP 荧光。此外，荧光细胞的数量显著低于 35 个 SGFP 阳性对照。
这是因为 B FFC 仅在两个配对质粒都在同一洋葱细胞中表达时起作用。在洋葱中未检测到荧光信号，用含有冰刺、载体和 L-U-H-C-Y-F-P 混合物的 3 号墨盒支架轰击，如阴性对照所预期的那样。我们刚刚向您展示了如何使用 BioRad Helios 基因枪系统轰炸洋葱细胞以测试蛋白质蛋白质相互作用。
执行此程序时，请务必记住使用适当的阳性和阴性对照，并知道 BIFC 荧光的信号可能较弱，荧光细胞的数量较少。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文展示了使用BioRad Helios基因枪将质粒DNA引入洋葱表皮细胞的方法。它还详细介绍了使用双分子荧光互补（BiFC）测试蛋白-蛋白相互作用的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 分子遗传学
- 植物生物学
背景
- 蛋白-蛋白相互作用对于理解细胞过程至关重要。
- 双分子荧光互补（BiFC）是一种用于研究这些体内相互作用的技术。
- 洋葱表皮细胞作为此类研究的模型系统。
- BioRad Helios基因枪是将质粒DNA输送到植物细胞的有效工具。
研究目的
- 说明使用BioRad Helios基因枪进行基因递送。
- 展示BiFC方法用于检测蛋白相互作用。
- 为植物分子生物学研究人员提供实用协议。
使用的方法
- 使用YFP片段创建SEU和LUH的质粒构建体。
- 使用基因枪将这些构建体轰击洋葱表皮细胞。
- 细胞在黑暗中孵育16到20小时。
- 使用荧光显微镜可视化细胞核中的YFP荧光。
主要结果
- 成功将质粒DNA引入洋葱细胞。
- YFP荧光表明SEU和LUH之间存在蛋白-蛋白相互作用。
- 荧光局限在细胞核中。
- 该方法被证明对于研究转录因子相互作用是有效的。
结论
- BioRad Helios基因枪是一种在植物细胞中进行基因递送的可靠方法。
- BiFC是一种在体内可视化蛋白相互作用的宝贵技术。
- 这项研究为未来的植物分子遗传学研究提供了框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction validation is a critical step in target de-risking for biopharma discovery pipelines. The BiFC assay in onion cells provides a rapid, visual readout for confirming intracellular interactions, supporting early hypothesis testing and mechanistic confidence. This approach enables scalable, low-background screening of transcription factor complexes relevant to disease pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of transcription factor interactions in living plant cells, supporting functional validation of putative targets.
- Operational Value: Utilizes onion epidermal cells as a reproducible, low-autofluorescence system for transient expression and interaction screening.
- Predictive Value: Nuclear-localized YFP signal confirms co-localization and interaction of SEU and LUH, providing mechanistic insight into transcriptional regulatory complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Plasmid DNA delivery via Helios Gene Gun allows standardized, high-efficiency transfection of onion epidermal cells for interaction testing.
- Quantitative Output: Fluorescence intensity and subcellular localization (nuclear vs. cytoplasmic) provide measurable readouts for interaction strength and specificity.
- Scalability: Multiple constructs (positive, experimental, negative controls) can be tested in parallel using separate cartridge holders, enabling comparative screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: While performed in a plant model, the assay framework supports conservation of interaction networks applicable to eukaryotic transcriptional regulation.
- Mechanistic De-risking: Observed nuclear YFP fluorescence upon co-bombardment of SEU-NYFP and LUH-CYFP validates intracellular interaction, reducing false-positive risk in target validation.
- Translational Continuity: The BiFC-Helios Gene Gun workflow establishes a reusable platform for testing protein interactions in semi-intact cellular environments.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC assay integrated with Helios Gene Gun bombardment fits within early discovery workflows, supporting target validation prior to lead identification and preclinical assessment.
- Discovery Biology: Tests intracellular protein-protein interactions in situ, clarifying whether putative partners co-localize and associate in a native-like cellular context.
- Screening: Enables standardized delivery of plasmid pairs via gene gun, ensuring reproducible transfection efficiency across biological replicates.
- Analytics: Nuclear YFP fluorescence serves as a quantitative, imaging-based readout for interaction confirmation, complementing biochemical assays.
- Translational Research: While using onion cells, the method supports conservation of interaction mechanisms relevant to human transcription factor networks.
- Enterprise Reuse: The Helios Gene Gun and BiFC protocol can be adapted across multiple protein pairs and plant-based expression systems for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides spatial and temporal resolution of protein interactions in living cells, reducing reliance on lysate-based assays that may miss transient or context-dependent associations.
- Operational Value: Combines transient expression with visual readout, enabling rapid iteration and optimization of construct design and delivery parameters.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions on target pairs by confirming intracellular interaction, thereby reducing investment in non-validated hypotheses.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of transcription factor complexes with demonstrated nuclear co-interaction, improving risk-adjusted target selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to generate N- and C-terminal YFP fusion constructs.
- Dependent on Helios Gene Gun optimization, including helium pressure (150–200 PSI), gold particle preparation, and cartridge standardization.
- Necessitates fluorescence microscopy with appropriate YFP filter sets and controls for background signal from wounded cells or debris.
- Requires standardized incubation (16–20 hours in dark) to allow for protein expression, interaction, and fluorophore maturation.
- Limited by transfection efficiency; not all cells are transformed, necessitating population-level analysis and use of positive/negative controls for interpretation.
