双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪

该程序测试两种拟南芥转录调节因子（seus 拼写为 SEU，简称 SEU 和 lu holog 或 LUH）之间的体内蛋白质相互作用。通过利用生物分子荧光互补，将 seus 融合到黄色荧光蛋白或 YFP 的末端片段上，并将 LUH 融合到两个质粒构建体的 Y-F-P-D-N-A 的 C 末端片段上。Seuss、NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 被轰炸到洋葱表皮细胞中以测试它们的相互作用。

Seuss 和 LUH 之间的相互作用导致细胞核中 YFP 的末端末端和 C 末端片段结合，从而导致细胞核中的 YFP 荧光。在黑暗中孵育 16 至 20 小时后，在荧光显微镜下观察洋葱表皮，以便观察荧光。大家好，我是来自马里兰大学细胞生物学和分子遗传学系 Zhi Lu 博士实验室的 Courtney Hollander。

今天，我们将向您展示使用 BioRad Helios 基因枪测试洋葱细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的程序。我们在实验室中使用该程序来测试植物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质定位。那么让我们开始吧。

要开始此程序，请按照 Woods 和 Zeto 2008 的 Joe 视频协议为 Helios 基因枪准备墨盒，该方案详细演示了每种墨盒制备的墨盒制备程序。将 50 微克总血浆 DNA 与 12.5 毫克金颗粒和 0.5 毫克/毫升 PVP 溶液混合，用于 BIFC。结合相同的卡盒制备物，推定的相互作用蛋白 Seuss 的两个血浆 DNA 融合到 YFP 的 N 末端一半，缩写为 seus，NYFP 和 LU 同源物融合到 YFP 的 C 末端一半，缩写为 L-U-H-C-Y-F-P。

总量为每次制备 50 μg，每个小柱每 0.25 毫克金产生多达 50 个小柱，每 0.25 毫克金含有 1 μg DNA。每个墨盒用于一次射击。小柱制备后，测试小柱以了解金颗粒是否得到有效推进。

将一块方形的 paraform 包裹在培养皿周围。然后将氦气压力设置为 150 到 200 PSI 之间，并将新制作的墨盒发射到参数方格中。观察香水上微弱的金颗粒。

在不同的氦气压力下，不同数量的金颗粒可能会被推到香水上。但是，如果没有显著差异，请选择较低的轰炸压力。此测试还指示每次拍摄所覆盖的区域。

准备洋葱组织时，用干净锋利的剃须刀片从大黄洋葱上剥去外皮。切成 2 x 8 厘米的矩形区域，深 4 到 5 层。取出矩形洋葱纸巾，丢弃外层两层。

将洋葱的剩余层切成约 1.5 厘米见方的小块。将洋葱块放入装有 3 毫米滤纸圆圈的培养皿中。用无菌水润湿，盖上培养皿。

洋葱块已经准备好轰炸了。首先将小柱装入白色圆形小柱支架中，将包含不同质粒构建体的小柱装入不同的小柱支架中。每个墨盒支架最多可容纳 12 个墨盒，可进行 12 次拍摄。

这里加载了三种不同的支架。第一个支架的盒含有 35 个 S-G-F-P-A 强且组成型的启动子，这些启动子来自花椰菜花叶病毒。该质粒用作阳性对照。

第二个支架装有实验小柱，其中含有等量的 S-E-U-N-Y-F-P 和 L-U-H-C-Y-F-P。第三个卡套卡套装有卡套，其中含有冰球脊柱载体和 LUH 冰球香料的等摩尔混合物。这也用作阴性对照。

将电池和新鲜的枪管衬套插入 Helios 基因喷枪中。确保枪管衬套和枪都连接了各自的 O 形圈。接下来，将空卡套插入基因枪中，使卡套上的标记编号 12 面向枪的顶部。

将墨盒支架推进一次或两次，以确保其正确插入。然后将喷枪连接到氦气罐上，并将压力调节到 150 到 200 PS 之间。我戴上护耳装置，在扣动扳机的同时按住侧面按钮开枪几次。用空弹药筒支架射击喷枪，装填后清理喷枪腔并确保压力稳定。

在拍摄 DNA 之前，在这里拍摄一块洋葱可能是背景荧光的阴性对照。要拍摄 DNA 包被的金颗粒，请取下空的卡套，并插入包含阳性对照的第一个加载的卡套。推进弹药筒支架，使用于点火的弹药筒位于弹药筒支架的底部。

现在将洋葱块放在空培养皿的中间，洋葱的最内层朝上。将基因枪的枪管衬垫放在培养皿上并开枪。前进到下一个墨盒并射击不同的洋葱片。

重复此步骤，直到射出 4 到 5 片洋葱。每个洋葱片在射击后只能射击一次。将轰炸的洋葱片转移到装有潮湿的 3 毫米滤纸的培养皿中，以拍摄实验墨盒。

更换为盒式 Holden。第二，记得更换桶衬以防止污染。如刚才所示，为阳性对照拍摄四到五个洋葱片。

然后换成 Holden 墨盒。第三种，包含阴性对照 DNA。再一次，射出四到五块洋葱。

更换桶衬以防止污染。轰炸后。用盖子盖住装有洋葱块的培养皿。

用 Paraform 包裹它们以防止干燥。将洋葱片在室温下避光孵育 16 至 48 小时。轰炸完成后，关闭气体并释放压力，然后从氦气罐中拆下基因枪，拧下枪管衬垫并取下墨盒支架和用过的墨盒。

最后，将小柱支架和桶衬套浸入装有肥皂水的烧杯中，然后进行超声处理。20 分钟。然后，用水冲洗以去除所有肥皂残留物。

在 70% 乙醇中浸泡一小时，然后在纸巾上晾干。轰炸后 16 到 20 小时继续观察洋葱块。将轰炸的洋葱片在室温下孵育 16 至 20 小时后，使用平头镊子慢慢从洋葱内表皮上剥下单个细胞层。

这是轰炸期间直接面向火炮的层。将去皮的层放在带有盖玻片的载玻片盖上的一滴水上。但要小心尽量减少气泡。

使用荧光显微镜观察 GFP 或 YFP 荧光，例如 zes axio 观察器，此处显示的 Z 点在显微镜的明场下。首先检查细胞质流，以确保细胞是活的。要这样做。

将载玻片暴露在明场光下几分钟以加热洋葱组织，然后寻找移动的塑料细胞质流并不总是容易看到，因此如果它不清晰可见，请不要气馁。对于荧光检测，请使用 GFP 或 YFP 的适当激发和检测滤光片。还要检查阴性对照，即用非荧光质粒拍摄的洋葱片。

受伤的细胞、碎片和洋葱可能会出现微弱的黄色信号。另外，检查阳性对照。含有组成型表达荧光报告基因的质粒。

GFP 荧光见于部分细胞，但并非全部细胞中。气泡也可能产生背景荧光。来自洋葱表皮细胞的可见 GFP 信号表明弹药筒、洋葱组织和基因枪射击已正确准备和执行。

此处显示的是从 35 个 SGFP 阳性质粒中观察到的强荧光。在整个细胞中都可以看到强烈的荧光，包括细胞核和细胞质。明场图像允许人们看到细胞和细胞核的相应轮廓。

并非每个细胞都发生了转变。当实验组合 Seuss、NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 轰炸到洋葱细胞中时，在洋葱细胞核中检测到 YFP 荧光信号，表明 Seuss NYFP 和 L-U-H-C-Y-F-P 在体内相互作用。然而，这种相互作用介导的荧光明显弱于阳性对照中的 35 个 SGFP 介导的荧光。

此外，SEUS 和 LUH 转录因子位于细胞核中。因此，仅在细胞核中观察到 YFP 荧光。此外，荧光细胞的数量显著低于 35 个 SGFP 阳性对照。

这是因为 B FFC 仅在两个配对质粒都在同一洋葱细胞中表达时起作用。在洋葱中未检测到荧光信号，用含有冰刺、载体和 L-U-H-C-Y-F-P 混合物的 3 号墨盒支架轰击，如阴性对照所预期的那样。我们刚刚向您展示了如何使用 BioRad Helios 基因枪系统轰炸洋葱细胞以测试蛋白质蛋白质相互作用。

执行此程序时，请务必记住使用适当的阳性和阴性对照，并知道 BIFC 荧光的信号可能较弱，荧光细胞的数量较少。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。