Name: 白蜡窄吉丁的基因表达分析（ Agrilus planipennis）使用实时定量PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 了解实时定量PCR技术用于分析白蜡窄吉丁幼虫组织及不同发育阶段的基因表达模式。该方法有助于揭示入侵害虫的分子生物学机制，为害虫防治策略提供科学依据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心（OARDC，美国俄亥俄州伍斯特）昆虫学系的 Lourdes Delta Arrueta Antequera 在实验设计方面提供的帮助。感谢美国农业部林务局北方研究站（USDA, Forest Services, NRS）的 Therese Poland 博士提供 emerald ash borer（EAB）幼虫样本。感谢 Luis A Canas 博士和 Nuris M Acosta 在显微镜设备设置方面提供的协助。本项目经费由拨付给俄亥俄农业研究与发展中心及俄亥俄州立大学的州级和联邦资金提供支持。

包含不同步骤的完整方案如图1中的流程图所示。以下详细说明构成解剖、RNA提取、第一链cDNA合成和qRT-PCR的各个步骤。
一、幼虫解剖
<ol>
 <li>在开始本操作之前，将 Emerald ash borer（EAB）幼虫置于湿润的滤纸上，直至进行解剖。将新配制的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，以确保整个解剖过程中缓冲液保持低温。</li>
 <li>首先，用精细解剖针将 EAB 幼虫固定在解剖板上，然后向解剖板中加入低温的 1× PBS 缓冲液。</li>
 <li>第一步，使用精细解剖剪将幼虫头部剪除；随后去除幼虫的最后一个腹节。</li>
 <li>使用钟表匠镊子从幼虫尸体上轻轻提起表皮，然后用剪刀沿尸体纵轴剪开切口。操作时需注意避免切破肠道。</li>
 <li>小心地将中肠组织与其他组织（如脂肪体和结缔组织）分离。随后用新鲜的 1× PBS 缓冲液冲洗组织，确保无脂肪体残留。将分离出的中肠组织转移至含有 500 μL 预冷 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>接下来，用镊子分离脂肪体组织，并将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>最后，通过刮除附着的其他组织，从幼虫尸体上分离表皮组织，注意避免破坏组织完整性。用新鲜 PBS 缓冲液冲洗分离的表皮组织，然后将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>分离得到的脂肪体、表皮和中肠组织可在 -80 °C 下保存，直至进行 RNA 提取。</li>
 <li>为进行 RNA 提取，根据 EAB 样本的发育阶段进行分类。这些阶段包括 1 龄、2 龄、3 龄和 4 龄幼虫、前蛹期以及成虫期。</li>
</ol>
II. RNA 提取（按照 Trizol 试剂说明书操作）
匀浆
<ol>
	<li>开始RNA提取时，首先使用塑料研杵在含有1 mL Trizol的1.5 mL离心管中匀浆组织。匀浆后，用Trizol试剂将每个样品的总体积调至1 mL。</li>
	<li>对于发育阶段的样品，先在液氮中用研钵和研杵将整个动物组织匀浆，然后取匀浆液等分试样（50 μg）加入1 mL Trizol中。</li>
</ol>
相分离：
<ol start="3">
 <li>将样本管在室温下用 1 mL Trizol 孵育 15 分钟。</li>
 <li>孵育结束后，向每根管中加入 200 μL 氯仿。加入氯仿后立即剧烈振荡试管约 15 秒，随后在室温下再孵育 2–3 分钟。</li>
 <li>接着，在 2 °C 条件下以 12,000×g 离心 15 分钟。离心后，RNA 位于水相中，水相体积应为 600 μL，即 Trizol 总体积的 60%。</li>
</ol>
RNA 沉淀
<ol start="6">
 <li>小心地仅移取水相。若含有水相以下的物质，将导致提取的 RNA 被污染。然后，将水相转移至适当标记的 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>为使 RNA 从水相中沉淀析出，向每根离心管中加入 0.5 mL 异丙醇。样品于室温孵育 10 分钟。孵育结束后，在 2°C 条件下以 12,000×g 离心 10 分钟。</li>
</ol>
RNA 洗涤
<ol start="8">
 <li>离心后，弃去管中的上清液。RNA存在于试管底部形成的凝胶状沉淀中。用75%乙醇洗涤沉淀，每1 mL Trizol加入至少1 mL 75%乙醇。涡旋振荡混匀。然后，在2 °C下以7500×g离心5分钟。</li>
</ol>
RNA 洗脱
<ol start="9">
 <li>弃去各管中的上清液。将离心管再次放入小型台式离心机中，离心1分钟。用移液器小心吸除管中残留的过量上清液。打开管盖，使沉淀在空气中干燥5–10分钟。注意避免过度干燥沉淀，否则将显著降低其溶解度。</li>
 <li>空气干燥后，将沉淀重悬于 <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">焦碳酸二乙酯</a>，或经DEPC处理的水。用于重悬沉淀的水量取决于沉淀的大小。使用 50 μL 少量沉淀用DEPC处理水 100 μL 对于较大的沉淀物，通过反复上下移动移液器吸头，使沉淀物在经DEPC处理的水中完全溶解。 </li>
 <li>一旦沉淀溶解，将样品置于 55 °C 10分钟。 </li>
 <li>然后，使用 Nanodrop 分光光度计测量每个 RNA 样本的浓度（2 μL RNA 样本的 </li>
 <li>将RNA样品储存在-80°C 直至进一步使用。 </li>
</ol>
III. 第一链 cDNA 合成（按照 Invitrogen 公司 SuperScript 第一链合成试剂盒的说明书操作）
<ol>
	<li>对于每个RNA样本，在PCR管中加入以下成分：
	<table border="0">
 <tbody>
 <tr><td>RNA</td><td>x μl</td></tr>
 <tr><td>10 mM dNTP 混合液 M</td><td>1μl</td></tr>
 <tr><td>Oligo(dt)0.5 μg/ μl)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>DEPC 处理水</td><td>(8-x) μl</td></tr>
 	<tr><td>总体积：</td><td>10 μl</td></tr>
 <tr><td colspan="2">注意：x 是用于 cDNA 合成的 RNA 体积。根据 RNA 的浓度，2-3 μg 每次反应将使用指定量的 RNA，每个反应的总体积应为 10 μl.</td></tr>
	</tbody>
 </table>
 </li>
 <li>将上述反应混合物置于热循环仪中 65°C 4 分钟。</li>
	<li>从热循环仪中取出试管，立即置于冰上至少 2 分钟。</li>
 <li>通过添加以下成分来制备第一链主混合液：
	<table border="0">
 <tbody>
 <tr><td>10X RT缓冲液</td><td>2μl</td></tr>
 <tr><td>25 mM MgCl2</td><td>4 μl</td></tr>
 <tr><td>0.1 M DTT</td><td>2 μl</td></tr>
 <tr><td>RNase 去除剂</td><td>1 μl</td></tr>
 </tbody>
 </table>
	</li>
 <li>添加 9 μl 向含有RNA样本的各管中加入主混合液，用移液器吹打混匀，并短暂离心。</li>
 <li>将试管重新放回热循环仪中，在指定温度下孵育2分钟 42°C.</li>
 <li>暂停热循环仪并添加 1 μl 加入 Superscript II 逆转录酶（Invitrogen）至各管中。此步骤应迅速完成。</li>
 <li>将样品在指定条件下孵育 42°C 1.5 小时。</li>
 <li>终止反应于 70°C 15分钟。</li>
 <li>从热循环仪中取出试管，置于冰上。</li>
 <li>添加 1 μl 向每管中加入 RNase H，并将各管重新放回热循环仪中 37°C 20分钟。 </li>
 <li>从热循环仪中取出样本后，加入 20 μl 每管中加入无核酸酶水。此步骤中，每个样品的体积加倍。</li>
 <li>使用以下方法检测每个样品的浓度 2 μl 样品的浓度。取每个样品的等分试样，使其浓度为20 ng/μl 用于qRT-PCR。加水至样品浓度为20 ng/μL所需的水量μl 将取决于合成的 cDNA 的初始浓度。</li>
</ol>
IV. qRT-PCR：
引物设计与参考基因的确定
<ol>
 <li>设计引物，其熔解温度（Tm）为 60°C，扩增产物大小约为 100 bp。</li>
 <li>本实验以 AP-PERI1 作为目的基因。后续数据分析与归一化需使用参考基因或内参基因。本实验采用核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为参考基因。</li>
 <li>配制所用引物（包括参考基因引物）的 5 µM 工作液。</li>
</ol>
标准品的制备
<ol start="4">
 <li>为计算所用引物的扩增效率，应制备标准品。</li>
 <li>将待检测的不同样品的 cDNA 混合。</li>
 <li>对标准曲线中每个设定的检测点进行 5 倍系列稀释。通常四个稀释点已足够，但强烈推荐使用五个稀释点。</li>
 <li>所需体积取决于检测点数量和技术重复次数。应确保有足够的体积为每个待测基因（包括参照基因）制备标准品。</li>
</ol>
培养板模板
<ol start="8">
 <li>为qRT-PCR板中的每个孔设计一个标明样品名称的模板。请记得为每个基因设置标准品，并为每个样品设置至少两个技术重复。</li>
</ol>
设置循环参数
<ol start="9">
 <li>打开定量反转录 PCR 仪并输入循环参数。本实验的循环参数如下：
 步骤 1：
 <ul>
 	<li>1 个循环：95°C 3 分钟</li>
 </ul>
 步骤 2：
 <ul>
 <li>40 个循环：95°C 15 秒，随后 60°C 30 秒 （可选：如需测定熔解曲线，请包含以下步骤）</li>
 </ul>
	步骤 3：
	<ul>
 <li>1 个循环：95°C 1 分钟</li>
 </ul>
	步骤 4：
	<ul>
	<li>1 个循环：55°C 1 分钟</li>
 </ul>
	步骤 5：
	<ul>
 <li>81 个循环：55°C 30 秒</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
	CFX96（BioRad）仪器的板设置
<ol start="11">
<li>为每个基因（包括内参基因）在单独的离心管中配制预混液。每孔的预混液体积组成如下：
	<table border="0">
 <tbody>
 <tr><td>无核酸酶水</td><td>2μl</td></tr>
 <tr><td>2.5 X SYBR green</td><td>4 μl</td></tr>
 <tr><td>上游引物</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>下游引物</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>总体积</td><td>8 μl</td></tr>
	</tbody>
 </table>
 </li>
 <li>配制预混液时，应额外增加1-2个反应量，以补偿移液过程中的误差。</li>
 <li>根据预先设计的模板，向每个孔中加入2 μL（20 ng/μL）的cDNA。然后向每孔加入8 μL预混液，使每个反应的总体积达到10 μL。</li>
 <li>上下吹打2-3次，确保样品充分混匀。检查移液枪尖端无残留液体。为避免交叉污染，每个样品必须使用新的枪头。</li>
 <li>待整块板加样完成后，用光学封板膜密封。避免用手接触封板膜，以免油脂影响检测结果。随后将板在500 rpm条件下离心1分钟，确保各孔中的反应液全部沉降至孔底。</li>
 <li>离心后，检查板底部是否无冰或水珠。最后将板放入qRT-PCR仪中，运行PCR程序。</li>
</ol>
五、实验示意图
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="RNA提取与qRT-PCR流程图，包含幼虫组织、cDNA合成及结果图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：展示基因表达研究各步骤顺序的流程图。
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="真菌菌丝生长的显微图像；标本检查、生物学研究、显微镜观察。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：A）幼虫EAB解剖图，显示中肠位于中央。B）分离的幼虫EAB中肠
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="分析Cu、MG、FB中平均REV及相对倍数变化的图表；实验数据比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3： A) 围食膜蛋白基因（AP-PERI1）在不同幼虫组织（包括表皮（Cu）、中肠（MG）和脂肪体（FB））中的平均相对表达值（REVs）。以一种专属于翡翠灰螟的核糖体蛋白（本文命名为AP-RP1）作为内参，用于标准化目标基因AP-PERI1的表达数据。B) AP-PERI1在幼虫组织中的相对倍数变化。表皮组织的表达量最低，因此被选作校准样本（1X）（Pfaffl, 2001）。
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="显示不同条件下平均相对表达值（REV）和相对倍数变化的折线图与柱状图，用于数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 图 4：A) 不同发育阶段的翡翠灰螟（EAB）中一个围食膜蛋白基因（AP-PERI1）的平均相对表达值（REVs），包括幼虫各龄期（1龄、2龄、3龄和4龄）、前蛹（PP）及成虫（A）。使用EAB特异性的核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为内参，对目标基因 AP-PERI1 的数据进行标准化。B) AP-PERI1 在不同发育阶段的相对倍数变化。前蛹（PP）样本的mRNA水平最低，因此被选为校准样本（1X样本）。
六、结论
定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织及发育阶段mRNA水平的工具。此外，qRT-PCR也一直是验证高通量基因表达分析（如微阵列和新一代RNA-Seq）所产生数据的关键方法。

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

通过qRT-PCR板获得每个样本的循环阈值（Ct）值。为绘制标准曲线，将各稀释度所获得的Ct值对其浓度的对数作图。然后将实验样本的Ct值投射到该稀释系列的标准曲线上。目标物的量值通过为每次实验（即组织表达和发育阶段表达）单独生成的标准曲线计算得出。相对表达值（REVs）通过将目标序列（本例中为AP-PERI1）的量除以内参基因（AP-RP1）的量得到。为进行显著性分析，采用SAS软件（SAS Institute Inc. SAS/STAT 用户指南，版本9.1）中的PROC MIXED过程，对每个基因的REV对数值进行方差分析（ANOVA）。表达水平的显著性定义为p &lt; 0.05。&nbsp;在组织表达分析中，相对倍数变化以表皮样本作为校准样本（1X样本，Pfaffl, 2001），因此中肠和脂肪体中的表达水平均相对于表皮进行计算。在发育表达分析中，以预蛹样本作为校准样本。两项研究均使用了两个生物学重复和三个技术重复。
我们的实验显示，与所检测的其他组织相比，中肠组织中的AP-PERI1转录本水平显著更...

利用实时荧光定量pcr分析翡翠灰螟（agrilus planipennis）中的基因表达

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

翡翠灰粉甲虫（EAB，Agrilus planipennis) 是一种外来入侵性害虫，已导致数百万棵白蜡树（Fraxinusspp）在北美洲。 EAB 仍在迅速扩散，攻击从幼苗到成熟树木等不同年龄的 ash 树。然而，迄今为止，关于 EAB 的分子层面知识极为有限或几乎空白。我们致力于解析在组织水平上支持 EAB 成功定殖 ash 树的基于分子的生理过程。在本报告中，我们展示了利用定量实时 PCR（qRT-PCR）有效测定不同幼虫组织（包括中肠、脂肪体和表皮）以及不同发育阶段（包括 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-龄幼虫、蛹前期和成虫）的EAB。例如，一个围食膜蛋白基因（本文命名为，AP-PERI1) 以目的基因为例，核糖体蛋白（AP-RP1) 作为内参对照。围食膜蛋白（Peritrophins）是围食膜/基质（peritrophic membrane/matrix, PM）的重要组成成分，而围食膜是昆虫肠道的内衬结构。PM 具有多种功能，包括参与消化过程以及为中肠上皮提供机械保护。

定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织和发育阶段mRNA水平的工具。本报告展示了利用qRT-PCR测定入侵性昆虫物种翡翠 ash 蛀虫（emerald ash borer）不同幼虫组织和发育阶段mRNA水平的方法。

利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

翡翠灰螟（EAB，Agrilus planipennis）是一种外来入侵性害虫，已在北美导致数百万株白蜡树（Fraxinus spp）死亡。EAB ...

以下实验的总体目标是利用定量PCR分析翡翠灰蛾幼虫不同组织及发育阶段的基因表达。该目标通过解剖幼虫组织并对其发育阶段进行分类来实现。第二步，使用Triol试剂从组织和不同发育阶段提取RNA，并以此RNA为模板合成第一条链cDNA，随后进行定量反转录PCR（qRT-PCR）分析。根据从循环阈值获得的完整变化数据，在定量逆转录聚合酶链式反应扩增后，结果显示目标基因在不同幼虫组织和发育阶段中存在差异表达。大家好，我是普拉卡什·米，俄亥俄州立大学昆虫学系本实验室的课题负责人。我的实验室主要研究 emal、lash、burer 和 ash 相互作用的基因组或分子层面。emal、lash Burer（EAB）是一种源自中国的外来入侵性害虫，威胁着北美地区整个 ash 种群的生存。今天，我们将向您展示一种利用 QPCR（即定量实时 PCR）在 EAP 中进行基因表达分析的实验方案。参与本实验方案的实验室成员包括 Swapna Priou，她将进行果蝇解剖，随后 Bin Bandari 将演示 RNA 提取过程。最后，Lauren Rivera Vega 将负责进行 QPCR 分析。我们实验室也使用该实验流程来研究 ash 基因的表达情况。那么我们开始吧。在开始此操作之前，将翡翠灰螟（emerald ash B 或 EAD）幼虫置于湿润的纸巾上。在进行解剖之前，将新配制的1×磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上保持低温，以确保整个解剖过程中缓冲液始终处于冷却状态。首先，用精细的解剖针将EAB幼虫固定在解剖板上，然后向解剖板中加入冷的1×PBS。先用精细的解剖剪剪去幼虫头部。随后，使用钟表匠镊子去除幼虫的最后一个腹部节段。从幼虫尸体上提起表皮，然后用剪刀沿尸体长度方向做一切口。注意不要刺破肠道。进行切口时，小心地将中肠组织与其他组织（如脂肪体和结缔组织）分离。然后用新鲜的1×PBS缓冲液冲洗组织，以确保无脂肪体污染。将中肠转移至1.5毫升离心管中，管内含有500微升预冷的Trizol试剂。接下来，使用镊子分离脂肪体组织，并将其转移至含有500微升预冷Trizol试剂的1.5毫升离心管中。最后，通过刮除附着的组织，从幼虫尸体上分离表皮组织，注意避免破坏组织完整性。用新鲜的PBS缓冲液冲洗分离的表皮组织，并将其转移至含有500微升预冷三唑试剂的1.5毫升离心管中。分离的脂肪体、表皮和中肠组织可于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。在准备RNA提取前，根据发育阶段对各种EAB样品进行分类。这些阶段包括星虫、PrepU 以及成体中的第一、第二、第三和第四阶段。开始 RNA 提取时，首先使用塑料研磨棒在含有 1.5 毫升 triol 的 einor 管中对组织进行匀浆。匀浆后，用 triol 试剂将每个样本的总体积调至 1 毫升。对于发育阶段的样品，将整个动物组织在液氮中用研钵和研杵充分匀浆。然后取一份匀浆液加入1毫升Trizol中。将样品管与1毫升Trizol在室温下孵育15分钟。孵育后，立即在每支试管中加入200 µL氯仿。剧烈振荡试管约15秒。然后在室温下再孵育2至3分钟。接下来，在2°C条件下，以12,000 ×g离心样品15分钟。离心后，RNA将位于水相中。水相体积应为600 µL，或占总三相溶液体积的60%。小心地仅移除水相。若水相下方的物质被移取，将导致提取的RNA受到污染。然后将水相转移至适当标记的1.5毫升离心管中。为了从水相中沉淀RNA，向每个试管中加入0.5毫升异丙醇。将样品在室温下孵育10分钟。孵育结束后，在2°C条件下以12,000 ×g离心10分钟。离心后，弃去试管中的上清液。RNA存在于试管底部形成的凝胶状沉淀中。用75%乙醇洗涤沉淀，每1毫升样品加入至少1毫升75%乙醇，并通过涡旋充分混匀。然后在2°C条件下以7,500 ×g离心5分钟。弃去各管中的上清液。将各管再次在小型台式离心机中离心一分钟。用移液器小心吸除管中残留的多余上清液。将离心管保持打开状态，让沉淀在空气中干燥5到10分钟。注意不要将沉淀过度干燥，因为这会显著降低其在空气干燥后的溶解度。将沉淀重悬于二甲基亚砜或去离子处理过的水中。重悬沉淀物所需的水量取决于沉淀物的大小。对于较小的沉淀物，使用50微升去蛋白海水处理水；对于较大的沉淀物，则使用100微升。通过反复上下移动移液器枪头，使沉淀物在去蛋白海水处理水中完全溶解。待沉淀溶解后，将样品置于 55 °C 下孵育 10 分钟。随后使用 NanoDrop 分光光度计测定各 RNA 样品的浓度。最后，采用 Invitrogen Superscript 第一链 cDNA 合成系统进行各 RNA 样品的逆转录 PCR（RT-PCR）第一链 cDNA 合成。该步骤可在本实验方案的书面部分找到。开始定量实时 PCR（Q-R-T-P-C-R）时，设计每对引物使其熔解温度为 60 摄氏度，产物大小约为 100 个碱基对。本实验中以 AP par one 作为目的基因。后续数据分析和数据归一化需要使用参考基因或内参对照。此处使用核糖体蛋白 a P RRP1 作为参考基因。接下来，设计一个模板，标明每个孔的样品名称以及 qRT-PCR 板的二维码。请记得为每个基因设置标准品，并且每个样本至少设置两个技术重复。然后打开定量反转录 PCR 仪，输入循环参数，以设置 CFX 96 仪器的反应板。首先，为每个基因分别在独立的离心管中配制每孔所需的主混合液。混合液包含两微升无核酸酶水、四微升2.5倍浓度的SYBR Green、一微升正向引物和一微升反向引物，总体积为八微升。根据先前设计的模板，向每个反应孔中加入两微升cDNA，然后向每个孔中加入八微升混合液，使每个反应的总体积达到十微升，上下吹打混匀，确保样品充分混合。检查吸头尖端是否残留液体。为避免交叉污染，每个样本均需使用新的吸头。待整块板设置完毕后，用光学膜密封板。 避免触碰胶带，因为油脂的存在可能会影响读数。随后以500 RPM离心微孔板1分钟，以确保离心后所有孔中的液体均位于微孔板底部。检查微孔板底部是否有冰或水。最后，将 PCR 板放入定量反转录 PCR 仪中，运行针对幼虫期翡翠灰螟（EAB）的 PCR 程序。本文展示了翡翠灰螟的解剖及定量反转录 PCR 检测结果。翡翠灰螟幼虫解剖应暴露出位于幼虫体中部的中肠。此处展示了幼虫EAB中肠的分离结果，以及不同幼虫组织（包括表皮、中肠和脂肪体）中副营养素基因AP par1的平均相对表达值（RAVs）。实验中使用EAB特异性的核糖体蛋白ARP1作为内参，用于对目标基因的表达数据进行标准化。提取了不同幼虫组织中AP AP par one的相对倍数变化。表皮组织的表达量最低，因此被用作AP Perry的校准样本均值RVs，用于比较EAB不同发育阶段（包括一龄、二龄、三龄和四龄幼虫）中的表达水平。使用aprp one作为内参对照对数据进行标准化，以确定PrepU和成体中的基因表达水平。计算了AP Perry one在不同发育阶段的相对倍数变化。其中，PrepU样本的mRNA水平最低，因此被选为校准样本。我们刚刚向您展示了如何进行侧部解剖，并利用侧部以及翡翠蛾不同发育阶段的样品，通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行基因表达分析。在解剖过程中，您应小心操作，避免组织样本之间的交叉污染。同时，在进行qRT-PCR时也需格外注意，确保将相应的样本加入对应的PCR反应孔中。以上就是全部内容。感谢观看我们的视频，祝您的实验顺利成功。

analysis-gene-expression-emerald-ash-borer-agrilus-planipennis-using

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

白蜡窄吉丁的基因表达分析（ Agrilus planipennis）使用实时定量PCR

采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C.

使用微阵列和实时 PCR 确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱

我们描述了一种利用 C. elegans 和RNAi饲喂文库的实验方案，可对群体中单个线虫的荧光强度、体型大小和不透光度等多个参数进行自动化测量。我们以一个筛选参与C.

C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes...

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

本方案描述了一种用于检验以下假设的方法：有效地磁场（GMF）的逆转会诱导拟南芥（Arabidopsis...

地磁场（Gmf）与植物进化：研究地磁场反转对Arabidopsis thaliana发育和基因表达的影响

有效诱捕和捕捉 Emerald Ash Borer（EAB）的陷阱是监测和管理这种入侵性害虫的关键环节。双层陷阱应放置在靠近白蜡树的阳光充足处，利用视觉和嗅觉线索，在野外试验中比其他类型的陷阱更易捕获到...

构建双层诱捕器以早期检测 Emerald Ash Borer

本方案介绍了一种从斑马鱼胚胎、幼体或分选细胞中进行全转录组分析的方法。我们包括了RNA的分离、RNA测序数据的通路分析，以及基于qRT-PCR的基因表达变化验证。...

斑马鱼RNA测序基因表达数据的样本制备与分析

本文介绍了一种改进的实验方案，用于在基因枪轰击后测定大麦糊粉层细胞中报告基因构建体的瞬时表达。通过将自动化谷物研磨与96孔板酶活性检测相结合，显著提高了该方法的通量。...

提高通量的基因枪轰击大麦糊粉层基因表达检测

蚜虫Aphis nerii定殖于夹竹桃科（Apocynaceae）这类具有高度防御能力的植物上，为研究植物与昆虫之间的相互作用提供了丰富的研究机会。本文中，我们介绍了一系列用于维持植物和蚜虫培养物，以及生成和分析A.

维持 Aphis nerii 的生物培养及基因表达检测：植物-昆虫互作研究中的非模式系统

我们描述了一种用于定位和定量昆虫组织中双生病毒的免疫荧光与定量PCR方法。该免疫荧光方案可用于病毒蛋白与媒介蛋白的共定位分析。定量PCR方案可进一步扩展用于整只烟粉虱个体以及病毒感染植物中病毒的定量分析。...

通过免疫荧光和定量PCR对烟粉虱组织中双生病毒的定位与定量

本文介绍了一种高通量、快速且可靠的基因表达水平检测方法，适用于单个或批量的 C. elegans...

利用纳米流体技术在单个及批量 C. elegans 样本中进行高通量定量 RT-PCR

了解实时定量PCR技术用于分析白蜡窄吉丁幼虫组织及不同发育阶段的基因表达模式。该方法有助于揭示入侵害虫的分子生物学机制，为害虫防治策略提供科学依据。

利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

探索更多视频