利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

以下实验的总体目标是利用定量PCR分析翡翠灰蛾幼虫不同组织及发育阶段的基因表达。该目标通过解剖幼虫组织并对其发育阶段进行分类来实现。第二步，使用Triol试剂从组织和不同发育阶段提取RNA，并以此RNA为模板合成第一条链cDNA，随后进行定量反转录PCR（qRT-PCR）分析。

根据从循环阈值获得的完整变化数据，在定量逆转录聚合酶链式反应扩增后，结果显示目标基因在不同幼虫组织和发育阶段中存在差异表达。大家好，我是普拉卡什·米，俄亥俄州立大学昆虫学系本实验室的课题负责人。

我的实验室主要研究 emal、lash、burer 和 ash 相互作用的基因组或分子层面。emal、lash Burer（EAB）是一种源自中国的外来入侵性害虫，威胁着北美地区整个 ash 种群的生存。今天，我们将向您展示一种利用 QPCR（即定量实时 PCR）在 EAP 中进行基因表达分析的实验方案。

参与本实验方案的实验室成员包括 Swapna Priou，她将进行果蝇解剖，随后 Bin Bandari 将演示 RNA 提取过程。最后，Lauren Rivera Vega 将负责进行 QPCR 分析。我们实验室也使用该实验流程来研究 ash 基因的表达情况。

那么我们开始吧。在开始此操作之前，将翡翠灰螟（emerald ash B 或 EAD）幼虫置于湿润的纸巾上。在进行解剖之前，将新配制的1×磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上保持低温，以确保整个解剖过程中缓冲液始终处于冷却状态。

首先，用精细的解剖针将EAB幼虫固定在解剖板上，然后向解剖板中加入冷的1×PBS。先用精细的解剖剪剪去幼虫头部。

随后，使用钟表匠镊子去除幼虫的最后一个腹部节段。从幼虫尸体上提起表皮，然后用剪刀沿尸体长度方向做一切口。注意不要刺破肠道。

进行切口时，小心地将中肠组织与其他组织（如脂肪体和结缔组织）分离。然后用新鲜的1×PBS缓冲液冲洗组织，以确保无脂肪体污染。将中肠转移至1.5毫升离心管中，管内含有500微升预冷的Trizol试剂。

接下来，使用镊子分离脂肪体组织，并将其转移至含有500微升预冷Trizol试剂的1.5毫升离心管中。最后，通过刮除附着的组织，从幼虫尸体上分离表皮组织，注意避免破坏组织完整性。

用新鲜的PBS缓冲液冲洗分离的表皮组织，并将其转移至含有500微升预冷三唑试剂的1.5毫升离心管中。分离的脂肪体、表皮和中肠组织可于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。在准备RNA提取前，根据发育阶段对各种EAB样品进行分类。

这些阶段包括星虫、PrepU 以及成体中的第一、第二、第三和第四阶段。开始 RNA 提取时，首先使用塑料研磨棒在含有 1.5 毫升 triol 的 einor 管中对组织进行匀浆。匀浆后，用 triol 试剂将每个样本的总体积调至 1 毫升。

对于发育阶段的样品，将整个动物组织在液氮中用研钵和研杵充分匀浆。然后取一份匀浆液加入1毫升Trizol中。将样品管与1毫升Trizol在室温下孵育15分钟。

孵育后，立即在每支试管中加入200 µL氯仿。剧烈振荡试管约15秒。然后在室温下再孵育2至3分钟。

接下来，在2°C条件下，以12,000 ×g离心样品15分钟。离心后，RNA将位于水相中。水相体积应为600 µL，或占总三相溶液体积的60%。

小心地仅移除水相。若水相下方的物质被移取，将导致提取的RNA受到污染。然后将水相转移至适当标记的1.5毫升离心管中。

为了从水相中沉淀RNA，向每个试管中加入0.5毫升异丙醇。将样品在室温下孵育10分钟。孵育结束后，在2°C条件下以12,000 ×g离心10分钟。离心后，弃去试管中的上清液。

RNA存在于试管底部形成的凝胶状沉淀中。用75%乙醇洗涤沉淀，每1毫升样品加入至少1毫升75%乙醇，并通过涡旋充分混匀。然后在2°C条件下以7,500 ×g离心5分钟。

弃去各管中的上清液。将各管再次在小型台式离心机中离心一分钟。用移液器小心吸除管中残留的多余上清液。

将离心管保持打开状态，让沉淀在空气中干燥5到10分钟。注意不要将沉淀过度干燥，因为这会显著降低其在空气干燥后的溶解度。将沉淀重悬于二甲基亚砜或去离子处理过的水中。

重悬沉淀物所需的水量取决于沉淀物的大小。对于较小的沉淀物，使用50微升去蛋白海水处理水；对于较大的沉淀物，则使用100微升。通过反复上下移动移液器枪头，使沉淀物在去蛋白海水处理水中完全溶解。

待沉淀溶解后，将样品置于 55 °C 下孵育 10 分钟。随后使用 NanoDrop 分光光度计测定各 RNA 样品的浓度。最后，采用 Invitrogen Superscript 第一链 cDNA 合成系统进行各 RNA 样品的逆转录 PCR（RT-PCR）第一链 cDNA 合成。

该步骤可在本实验方案的书面部分找到。开始定量实时 PCR（Q-R-T-P-C-R）时，设计每对引物使其熔解温度为 60 摄氏度，产物大小约为 100 个碱基对。本实验中以 AP par one 作为目的基因。

后续数据分析和数据归一化需要使用参考基因或内参对照。此处使用核糖体蛋白 a P RRP1 作为参考基因。接下来，设计一个模板，标明每个孔的样品名称以及 qRT-PCR 板的二维码。

请记得为每个基因设置标准品，并且每个样本至少设置两个技术重复。然后打开定量反转录 PCR 仪，输入循环参数，以设置 CFX 96 仪器的反应板。首先，为每个基因分别在独立的离心管中配制每孔所需的主混合液。

混合液包含两微升无核酸酶水、四微升2.5倍浓度的SYBR Green、一微升正向引物和一微升反向引物，总体积为八微升。根据先前设计的模板，向每个反应孔中加入两微升cDNA，然后向每个孔中加入八微升混合液，使每个反应的总体积达到十微升，上下吹打混匀，确保样品充分混合。

检查吸头尖端是否残留液体。为避免交叉污染，每个样本均需使用新的吸头。待整块板设置完毕后，用光学膜密封板。

避免触碰胶带，因为油脂的存在可能会影响读数。随后以500 RPM离心微孔板1分钟，以确保离心后所有孔中的液体均位于微孔板底部。检查微孔板底部是否有冰或水。

最后，将 PCR 板放入定量反转录 PCR 仪中，运行针对幼虫期翡翠灰螟（EAB）的 PCR 程序。本文展示了翡翠灰螟的解剖及定量反转录 PCR 检测结果。翡翠灰螟幼虫解剖应暴露出位于幼虫体中部的中肠。

此处展示了幼虫EAB中肠的分离结果，以及不同幼虫组织（包括表皮、中肠和脂肪体）中副营养素基因AP par1的平均相对表达值（RAVs）。实验中使用EAB特异性的核糖体蛋白ARP1作为内参，用于对目标基因的表达数据进行标准化。

提取了不同幼虫组织中AP AP par one的相对倍数变化。表皮组织的表达量最低，因此被用作AP Perry的校准样本均值RVs，用于比较EAB不同发育阶段（包括一龄、二龄、三龄和四龄幼虫）中的表达水平。

使用aprp one作为内参对照对数据进行标准化，以确定PrepU和成体中的基因表达水平。计算了AP Perry one在不同发育阶段的相对倍数变化。其中，PrepU样本的mRNA水平最低，因此被选为校准样本。

我们刚刚向您展示了如何进行侧部解剖，并利用侧部以及翡翠蛾不同发育阶段的样品，通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行基因表达分析。在解剖过程中，您应小心操作，避免组织样本之间的交叉污染。同时，在进行qRT-PCR时也需格外注意，确保将相应的样本加入对应的PCR反应孔中。

以上就是全部内容。感谢观看我们的视频，祝您的实验顺利成功。