在斑马鱼后脑细胞标记和成像
2010年7月25日
理解，塑造了早期胚胎的形态发生过程的关键是对高分辨率图像细胞的能力。我们在这里描述膜有针对性的绿色荧光蛋白标签在整个斑马鱼的胚胎细胞的单细胞或小群的技术。
以下实验的总体目标是以高分辨率对神经细胞进行成像 首先在斑马鱼胚胎中，将编码膜靶向绿色荧光蛋白的 DNA 注射到单细胞阶段的斑马鱼胚胎中，这导致马赛克遗传，从而能够增强散区细胞的成像。然后用抗 GFP 对胚胎进行免疫标记并切片，以便在固定制备中以高分辨率观察单细胞的形态。或者，可以使用延时视频显微镜检查活胚胎，以便对细胞动力学进行成像。
获得显示细胞形态或动力学的结果。在这里，斑马鱼后脑用共聚焦显微镜成像。大家好。
我是来自马里兰大学巴尔的摩县分校生物科学系 Rachel Brewster 博士实验室的 PR Chandran。今天，我们将向您展示一种以更高分辨率标记和成像斑马鱼胚胎中神经细胞的程序。我们通常在实验室中使用该程序在细胞水平上研究斑马鱼胚胎的神经关系机制。
那么让我们开始吧。湿润的地方。Kim 在 100 毫米培养皿的边缘擦拭。
小心地将玻璃显微注射针固定在加湿皿内的蜡条上。在解剖立体显微镜下，将针头对准刻度载玻片。要获得合适尺寸的尖端，请使用干净的剃须刀片轻轻敲击针头直径为 1 微米的位置。
将针头连接到显微注射装置上，将 0.5 微升酚红和水溶液移液到对口膜上，然后从液滴中预先填充针头。将显微注射压力设置为 7 千克帕斯卡，从 20 毫秒脉冲开始。计算分配所有液体所需的脉冲数。将时间变化在 10 到 30 毫秒之间，以便分配大约需要 250 个脉冲。
0.5 微升溶液。使用微量移液器将 0.5 至 1 微升 MG FPD NA 的水溶液回填针头，并与酚红混合以进行可视化。盖上加湿皿，以防止溶液在立体显微镜下从针头中蒸发出来。
将一个细胞阶段分离的鱼胚胎放置在装满胚胎的 60 毫米培养皿中。中等。使用细镊子轻轻夹住可丽耐并稳定胚胎。将装满 MGFP 和酚红的针头移动到目标区域进行注射。
对于大范围的 MGFP 表达，注射到卵黄或细胞质中。使用显微注射装置输送大约 2 纳升的 MGFP 溶液。观察酚红指示剂的位置以确认注射正确。
小心地从胚胎中取出针头。一次注射培养皿中的所有胚胎，最多 30 个胚胎。避免胚胎暴露在光线下，在 28.5 摄氏度下孵育，让胚胎在立体显微镜下发育到所需的阶段。
使用细镊子轻轻地将可丽耐从胚胎上剥下来。使用意大利面移液管从培养皿中取出空可丽耐，只留下涂有 dec 涂层的胚胎。使用火焰抛光意大利面移液器将注射的涂层胚胎转移到 1.5 毫升微量离心管中。
尽可能多地去除多余的培养基，然后加入 1 毫升 ative。在室温下洗涤胚胎 1 次 XPB S3，每次 5 分钟。在立体显微镜下将胚胎移至装有一个 XPBS 的培养皿中。
使用细镊子将胚胎固定在尾部区域附近。使用第二组镊子或扑克，尝试在不接触后框架区域的情况下尽可能多地去除 yo。在立体显微镜下观察，使用细镊子将胚胎从培养皿中提起，并放入充满 4% 低熔点的切片模具中。阿罗斯。
将胚胎定位在模具的一端。让 aros 在室温下凝固。用抹刀从模具中取出硬化的 aros 块，抬起刀片将块的底端均匀切下。
如果需要，使用一滴强力胶将块固定在颤音舞台切割面朝下。对齐舞台上的多个块。将舞台连接到颤音上。
确保刀片将整个胚胎切开，但不要完全切开块。用一个 XPBS 部分填充舞台。胚胎小心地切到一个 arou 块的背面，并将其转移到装满一个 XPBS 的培养皿中。
在立体显微镜下分离切片。使用细镊子将所需的切片放入装满一个 XPBS 的多孔培养皿中。为每个胚胎使用不同的孔。
用 DPI 对切片进行染色，用抗 GFP 进行免疫标记。如果没有，请在 48 小时内进行成像。每张载玻片最多可安装六个切片，并在切片顶部放置盖玻片以进行共聚焦成像。
将载玻片存放在黑暗中，以避免照片漂白。实时成像，MGFP 注射的胚胎必须避光。在胚胎达到所需的发育阶段前 30 分钟使用镊子对胚胎进行涂层。
将包被的胚胎转移到含有 0.01% Trica 的胚胎培养基的镇静溶液中，在室温下孵育 15 分钟。在 35 毫米玻璃底培养皿上，将 1% 常规的移液液滴加入水中，使其充满模具。让 agros 凝固。
在立体显微镜下，使用 90 毫米玻璃毛细管在 aros 液滴上打三个孔。检查孔底并用镊子去除任何残留的 aros。在立体显微镜下用胚胎培养基填充培养皿。
使用意大利面移液器将一个胚胎转移到 aros 的每个孔中。使用细镊子确定胚胎的方向，以便在这种情况下，感兴趣的区域（背头）靠在玻璃上。盖上盘子。
小心地将培养皿运送到共聚焦显微镜的载物台上。在整个成像过程中，使用空间加热器将胚胎保持在 28.5 摄氏度。这是穿过野生型胚胎后脑的切片，在 4 到 5 个体节处用膜靶向 GFP 双重标记，绿色为 GFP，蓝色为 D，只有一个细胞用膜结合 GFP 标记，允许对细胞形态和组织进行高分辨率成像。
这是 nardi din 突变体的后脑在 for 到 5 体节的类似图像。该图像显示，在神经揭示过程中，nardi 和突变体中的细胞未能正确地朝向中线。与用 MGFP 标记细胞的方法相反，使用一般的细胞表面标记物（如 β-catenin）标记后脑不允许可视化单个细胞的形态。
MG FP 标记胚胎后脑的延时成像显示，驱动斑马鱼神经关系的细胞行为非常动态，并且随着细胞迁移和相互排列，涉及膜突起的延伸。我们刚刚向您展示了如何制备固定和活的斑马鱼胚胎，以便以高分辨率进行单细胞成像。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本研究提出了一种使用针对膜的绿色荧光蛋白对斑马鱼胚胎中的神经细胞进行高分辨率成像的技术。该方法允许可视化单个细胞及其动态变化，提供了形态发生过程的见解。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 了解胚胎发育对发育生物学至关重要。
- 高分辨率成像技术对于研究细胞形态至关重要。
- 斑马鱼由于其透明的胚胎而被用作模式生物。
- 针对膜的荧光蛋白增强了成像能力。
研究目的
- 开发一种用于标记和成像斑马鱼胚胎中神经细胞的方法。
- 能够以高分辨率可视化细胞形态和动态。
- 促进早期发育过程中形态发生的研究。
使用的方法
- 将编码针对膜的绿色荧光蛋白的DNA注射到单细胞阶段的胚胎中。
- 镶嵌遗传允许对散布的细胞进行增强成像。
- 使用抗GFP进行免疫标记以固定制剂。
- 使用延时视频显微镜进行活体成像以观察细胞动态。
主要结果
- 成功可视化了斑马鱼胚胎中单个细胞的形态。
- 活体胚胎中神经细胞的动态成像。
- 使用共聚焦显微镜对斑马鱼后脑进行成像。
- 结果表明该成像技术的有效性。
结论
- 该技术为研究胚胎发育提供了一个强大的工具。
- 高分辨率成像可以揭示细胞动态的见解。
- 这种方法可以应用于发育生物学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution cellular imaging in zebrafish embryos enables precise visualization of neural cell morphology and dynamic behaviors during early development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research pipelines. The approach enhances predictive confidence for early-stage discovery and translational studies involving vertebrate neural systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neural morphogenesis at single-cell resolution for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by visualizing cell orientation and migration during neurulation.
- Facilitates functional target validation through direct observation of cellular behaviors in vivo.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream imaging-based assays.
- Standardizes cell labeling and imaging protocols for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable screening of genetic or pharmacological perturbations affecting neural development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling vertebrate neural tube formation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through live and fixed imaging outputs.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing cellular mechanisms underlying developmental phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in vertebrate neural development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of neural cell behaviors and morphogenetic processes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative studies.
- Analytics: Delivers high-content morphological and dynamic readouts for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neural development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse neurodevelopmental investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of cellular phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling and microinjection techniques.
- Needs access to confocal microscopy and immunolabeling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different developmental stages or genetic backgrounds.
- Photo-bleaching and mosaic expression are practical limitations to consider.
