Name: 焦距脑缺血模型大鼠大脑中动脉的血管内缝合闭塞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-05T17:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学习大鼠大脑中动脉血管内缝合闭塞技术，建立局灶性脑缺血模型。该方法通过硅胶头尼龙线阻断MCA血流，结合MRI和组织学染色评估梗死范围，为中风机制研究与治疗策略开发提供可靠的动物实验平台。

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感谢 Beth Rauch 和威斯康星大学小型动物影像中心提供的磁共振成像支持。本研究由威斯康星大学麦迪逊分校神经外科系提供资金支持。

MCAO 大鼠模型
术前准备
所有存活手术操作均应采用无菌技术。使用商用消毒剂对手术工作台面进行消毒，并通过高压灭菌法准备无菌手术器械包，内含手术器械、手术巾、纱布、棉拭子、缝线和手术刀片。操作者应佩戴外科口罩、头帽及无菌手套。若在同一手术时段内需进行多只大鼠的手术操作，可使用Germinator干珠灭菌器在每次操作间对手术器械进行再次灭菌。术前应预热循环水浴式恒温毯，并将其置于吸水垫下方，以防止大鼠在手术过程中发生低体温。
<ol>
	<li>将自发性高血压大鼠（或其他选定品系大鼠）放入诱导室，使用5%异氟烷诱导麻醉（麻醉机应设置为氧气流量1.0 L/min）2 和 1.0 L/min N2将异氟烷浓度降至1-2%以维持麻醉。</li>
	<li>双眼涂抹人工泪液软膏。</li>
	<li>使用电推剪（Oster A5，配#10刀头）剃除喉部及左侧颈部拟切口区域以外的毛发。</li>
	<li>使用浸有碘伏的纱布垫从手术区域中心开始向外螺旋式消毒皮肤。随后用含有70%乙醇的无菌纱布垫以相同方式擦拭冲洗。上述步骤重复三次，共完成三个循环。</li>
	<li>沿预期切口部位皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因。</li>
	<li>将大鼠置于无菌网状袜套内，或用无菌手术单覆盖。</li>
</ol>
大脑中动脉的短暂阻塞
<ol start="7">
 <li>在手术显微镜下，行腹侧正中切口，并解剖浅筋膜。</li>
 <li>在浅筋膜下方，左侧存在腺体组织，以及构成三角形的三块肌肉：位于气管上方正中线的胸骨舌骨肌；具有明显白色光泽腱性部分、易于辨认的二腹肌；以及最后的胸锁乳突肌。</li>
 <li>在该三角区域内进行精细的锐性与钝性分离，以识别颈总动脉（部分操作者可能更倾向于仅使用钝性分离，以尽量减少意外组织损伤）。暴露颈外动脉、颈内动脉和颈总动脉（ECA、ICA、CCA）。颈总动脉较粗大，可见搏动。迷走神经沿颈总动脉和颈内动脉的外侧走行，需用锐性分离将其从颈总动脉和颈内动脉表面剥离。</li>
 <li>随后锐性分离颈外动脉的两个分支，第一个分支向内侧走行，第二个分支向外侧走行。将这两个分支均电凝并切断，以便更方便地游离较大的血管。</li>
 <li>进一步向头侧游离颈外动脉。可能会遇到舌骨，这将限制头侧解剖的范围。尽可能远端地用6-0丝线结扎颈外动脉。</li>
 <li>在颈外动脉靠近与颈内动脉分叉处，再放置一根6-0丝线，但应松松环绕，避免闭塞血管，因为后续用于阻塞的血管内缝线将从此处穿入。</li>
 <li>在颈总动脉和颈内动脉靠近分叉处放置显微外科夹。</li>
 <li>在颈外动脉上两根丝线结扎线之间做初始的部分动脉切开。</li>
 <li>将一段长度为2.2–3.0 cm的4-0单股尼龙缝线（其圆钝、硅胶包被的尖端近端2.0 cm处有一弯曲）经颈外动脉腔插入，沿颈总动脉方向推进至显微外科夹所在位置。此类缝线为商业化产品（Doccol Corp., Redlands, CA, USA）。在部分动脉切开处切断剩余的颈外动脉，游离残端，并将其置于颈外动脉与颈内动脉分叉下方，以便血管内缝线更顺利地滑入颈内动脉。</li>
 <li>收紧环绕颈外动脉残端的丝线，以固定血管内尼龙缝线并防止出血，随后移除颈内动脉上的显微血管夹。在移除前应缓慢打开血管夹，检查是否有出血。</li>
 <li>继续将尼龙缝线从颈外动脉经颈内动脉推进至大脑中动脉（MCA）。该距离通常为18–20 mm，因此在插入前需在缝线上设置弯曲。当插入一定长度的尼龙缝线后，可能会遇到阻力。若此时仍有大量缝线位于血管外，则提示缝线可能已误入翼腭动脉（见下文注释）。此时应后撤并轻微弯曲缝线，使其继续沿更偏内侧走行的颈内动脉前进。此外，可对翼腭动脉起始部进行解剖，以更清晰地观察血管内丝线的行进路径。持续推进尼龙缝线，直至在2 cm弯曲位置处及其之后感受到阻力。此时，血管内缝线已阻塞大脑中动脉起始部。可通过激光多普勒血流仪监测局部脑血流量的下降来确认大脑中动脉阻塞（参见材料表中一种设备来源）。另需注意，如有需要，可直接结扎起源于颈内动脉的翼腭动脉，以避免血管内缝线误入该血管。</li>
 <li>启动计时器，并记录阻塞开始时间。</li>
 <li>移除颈总动脉上的微血管夹。</li>
 <li>用3-0丝线快速缝合切口（包括真皮层、肉膜层及皮下组织层）（采用简单的连续缝合方式有助于后续重新打开以实现再灌注），然后小心地将大鼠放置于恢复笼中。检查笼底鼻部和口周区域无垫料残留，并密切监测麻醉恢复情况。</li>
</ol>
恢复大脑中动脉血流（再灌注）
<ol start="21">
 <li>在即将结束阻塞期前，重新麻醉大鼠，用聚维酮碘和70%乙醇对切口部位进行消毒（重复3次，方法同前），并拆除缝线以重新打开切口。</li>
 <li>在颈总动脉（CCA）上放置微型夹，操作同前。</li>
 <li>将阻塞缝线从颈内动脉（ICA）中部分撤出，直至缝线末端在颈内动脉内可见。切勿将缝线完全从颈内动脉/颈外动脉（ICA/ECA）中取出！</li>
 <li>在腔内缝线末端上方的颈内动脉（ICA）处放置一个微型夹。</li>
 <li>完全移除阻塞缝线，并牢固结扎颈外动脉（ECA）残端。记录阻塞结束（再灌注开始）时间。</li>
 <li>移除颈内动脉（ICA）上的微型夹。</li>
 <li>移除颈总动脉（CCA）上的微型夹。</li>
 <li>用数滴无菌生理盐水润湿手术区域，并使用3-0丝线以间断缝合方式逐层关闭切口（真皮层、肉膜层、皮下组织）。</li>
 <li>向腹腔内注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡（或根据机构指南选用其他合适的术后镇痛药）。</li>
 <li>腹腔注射5 mL预热的生理盐水，以在恢复期间提供水合作用。</li>
 <li>监测大鼠从麻醉中的恢复情况。</li>
 <li>待大鼠恢复后，通过尾部悬吊法观察其是否能向两侧自由转身，以检测脑梗死的行为学表现。通常仅向一侧卷曲。可采用简单的评分量表记录梗死后初期的行为功能（见讨论部分）。</li>
 <li>应每6至8小时追加一次丁丙诺啡注射（剂量同上），以维持24小时的镇痛效果。若动物表现出不适迹象，应延长镇痛时间。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig1.jpg" alt="大脑Willis环示意图，脑动脉标注，解剖图谱，血流路径。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 图1. 通过血管内缝线阻塞大脑中动脉。 示意图为大鼠颅内循环系统的简化图，图中可见一条涂覆硅胶的血管内缝线阻塞了大脑中动脉（MCA）的起始部。左侧颈外动脉（ECA）的枕动脉（OA）和甲状腺上动脉（ST）分支已被结扎，ECA残端周围的缝线结扎固定血管内缝线的位置。ACA，大脑前动脉；BA，基底动脉；CCA，颈总动脉；ECA，颈外动脉；ICA，颈内动脉；MCA，大脑中动脉；OA，枕动脉；PCA，大脑后动脉；PComA，后交通动脉；PPA，翼腭动脉；ST，甲状腺上动脉。本图改编自Sasaki et al.4 和 Lee3。
<img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig2.jpg" alt="MRI脑部扫描；轴向切片示意图；神经科学研究；解剖学差异；医学分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 图2. 大鼠脑冠状切面在短暂性大脑中动脉阻塞（MCAO）1小时后24小时的代表性磁共振成像。 伴随局灶性缺血的脑水肿可在T2加权MRI图像中观察到。梗死区域在T2图像上呈高信号（明亮）。更先进的MRI技术，如扩散加权成像和表观扩散系数图，也可观察到类似的梗死模式5。
<img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig3.jpg" alt="脑切片实验结果，染色横截面，组织学研究，解剖学分析" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 图3. 大鼠大脑冠状切片的代表性图像，于短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）1小时后24小时进行TTC染色。 TTC染色显示了与图2中同一只大鼠的脑皮层和纹状体中的白色（未染色）梗死区域。需要注意的是，局灶性缺血性病灶的整体模式与T2加权MRI图像中观察到的相似，尽管组织学确定的最终梗死面积可能略小于T2病灶面积。

<ol><li>van Gijn, J., Dennis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+and+answers+in+stroke+care%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Issues and answers in stroke care.</a> Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).</li>
<li>Macrae, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+models+of+focal+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">New models of focal cerebral ischaemia.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).</li>
<li>Lee, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Morphology of cerebral arteries.</a> Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).</li>
<li>Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model+and+intravenous+cellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery.</a> Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).</li>
<li>Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+lesion+volume+determination+on+diffusion+weighted+images+vs.+apparent+diffusion+coefficient+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps.</a> Brain Res. 1279, 182-188 (2009).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li>
<li>Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+Spontaneously+Hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats.</a> Neurol Res. 20, 265-270 (1998).</li>
<li>Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+infarction+following+bilateral+carotid+artery+ligation+in+normotensive+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+a+pathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study.</a> Stroke. 7, 54-60 (1976).</li>
<li>Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+brain+ischemia+in+the+rat%3A+methods+for+reproducible+neocortical+infarction+using+tandem+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+and+ipsilateral+common+carotid+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).</li>
<li>Duverger, D., MacKenzie, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+cerebral+infarction+following+focal+ischemia+in+the+rat%3A+influence+of+strain%2C+arterial+pressure%2C+blood+glucose+concentration%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+susceptibilities+to+cerebral+infarction+in+spontaneously+hypertensive+%28SHR%29+and+normotensive+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats.</a> Stroke. 17, 520-525 (1986).</li>
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<li>Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+silicon-coated+nylon+suture+to+plain+nylon+suture+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+cortical+ischemia+versus+striatal+ischemia.+Circulatory%2C+metabolic%2C+and+neuropathologic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+neurology%22%5BJournal%5D)">Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences.</a> Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).</li>
<li>Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion%3A+evaluation+of+the+model+and+development+of+a+neurologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination.</a> Stroke. 17, 472-476 (1986).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突需要披露。 本方案已获威斯康星大学麦迪逊分校医学院与公共卫生学院机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。

脑缺血的啮齿类动物模型可分为全局性或局灶性，以及可逆性或不可逆性。我们采用可逆性局灶性缺血模型，以模拟人类脑卒中患者血管再通后可能发生的再灌注损伤。尽管大鼠的颅内血液循环与人类相似，但由于 Willis 环和软脑膜吻合支形成的广泛颅内侧支循环，导致梗死体积存在不一致性6。我们选用自发性高血压大鼠（SHR）品系，因为在局灶性脑缺血条件下，SHR 的梗死面积大于正常血压大鼠7-10。此外，SHR 品系中脑卒中的诱导更为稳定，且相比其他常用品系可能具有更低的死亡率11。另外，在手术过程中应持续监测生理参数，因为这些参数的波动会增加梗死体积的变异性；相关参数包括血压、动脉血 O2 和 CO2 水平、低体温和高血糖，这些因素均可加重缺血性损伤2,12。其中低体温尤需关注，因其可减轻神经元缺血性损伤程度，因此在手术期间将大鼠置于温控加热垫上至关重要。
本实验采用市售的硅胶涂层缝合线，以期提高梗死体积的一致性13-15。传统上，用于阻塞大脑中动脉（MCA）的血管内缝合线是通过火焰烧圆3-0尼龙缝合线的尖端，或使用热熔胶枪在缝合线尖端涂覆一小滴胶体来制备16。这些方法制得的缝合线尖端直径存在差异，因此在找到与特定大鼠血管直径匹配的缝合线之前，可能需要多次尝试阻塞操作。本视频所述大脑中动脉闭塞（MCAO）方法的其他变异包括更远端的闭塞，以保留豆纹动脉分支，从而产生纯粹的皮质梗死17，以及同时闭塞大脑中动脉和同侧颈总动脉，以减少侧支血流6,9。
中风的功能性影响可通过多种行为学测试进行评估，其中特定任务中的功能缺陷通过简单的评分量表来反映。例如，Bederson 等18 建立了一种神经功能评分系统，根据大鼠在抬高体位时前肢屈曲程度、对侧向推力的不对称抵抗以及开阔场地中的转圈行为对大鼠进行分级。当大鼠被抬高时双侧前肢均伸向地面且无其他神经功能缺损者评为“正常（0）”；仅出现对侧前肢屈曲的大鼠归类为“中度缺损（1）”。“重度2级”大鼠表现为对侧肢体对侧向作用力的抵抗能力下降，而“重度3级”大鼠 additionally 出现转圈行为。较低等级的行为缺陷始终存在于更高等级中（例如，2级和3级大鼠也均表现出前肢屈曲），且这些评分可预测脑梗死体积的差异。18因此，这种简单的评分系统可实现对中风所致功能缺损的快速、一致的半定量评估。
脑梗死范围的测量通常通过组织学染色来评估组织损伤，常用的染色方法包括TTC染色、焦油紫（尼氏染色）以及苏木精-伊红染色。磁共振成像技术，包括弥散加权MRI，可在血管闭塞后的早期时间点显示梗死区域，从而能够在不牺牲动物的情况下确定每只大鼠的梗死体积。这一方法在旨在评估中风后神经保护治疗效果的研究中尤为有价值；在大脑中动脉闭塞（MCAO）后、治疗实施前对大鼠进行成像，可使研究者确信所有实验组和对照组动物起始时经历的中风程度相似，从而减少因中风诱导差异带来的混杂效应。

<table><tbody><tr><td> 4-0 尼龙缝合线</td><td>Doccol Corporation</td><td></td><td>2-3 mm 硅胶涂层长度，0.39 mm 尖端直径</td></tr><tr><td>自发性高血压大鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>290-300 g，雄性</td></tr><tr><td>Gaymar T/Pump 温度调节泵及垫片</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetroson V-10 双极电外科设备</td><td>Summit Hill Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 玻璃珠灭菌器</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vasamedics Bpm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;Laserflo 激光血流灌注监测仪</td><td>TSI Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠大脑中动脉线栓法内血管闭塞局灶性脑缺血模型

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

脑卒中是全球成人致残的首要原因和死亡的第三大原因1。人类脑卒中的临床表现具有高度变异性；然而，在建立局灶性缺血动物模型时，实验诱导梗死体积的可重复性至关重要。大鼠是脑卒中研究中广泛使用的动物模型，因其饲养成本相对较低，且颅内血液循环与人类相似2,3。在人类中，大脑中动脉（MCA）是脑卒中综合征最常受累的血管，已有多种MCA阻塞（MCAO）方法被描述，用于在动物模型中模拟这一临床综合征。由于人类急性脑卒中后常发生再通，因此许多模型均包含了阻塞一段时间后的再灌注过程。在本视频中，我们演示了自发性高血压大鼠（SHR）的短暂性血管内缝线MCAO模型。将带有硅胶涂层头端的尼龙线经血管内插入至MCA起始部，阻塞60分钟，随后进行再灌注。需注意，最佳阻塞时间可能因其他大鼠品系（如Wistar或Sprague-Dawley大鼠）而异。视频中展示了大鼠脑卒中的多种行为学指标。通过MCAO后24小时的T2加权磁共振成像以及脑组织切片的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色，确认局灶性缺血的发生。

在大鼠中通过手术诱导缺血性脑损伤是卒中研究中广泛应用的模型。本文展示了通过阻断大脑中动脉诱导局灶性脑缺血的方法。同时展示了通过组织学染色和磁共振成像对所形成的梗死区域进行可视化。

脑卒中是全球成年人致残的首要原因，也是致死的第三大原因1。在人类脑卒中病例中，存在高度可变的……

在本视频中，我们将演示一种通过血管内闭塞大鼠中动脉来诱导脑梗死的方法。该方法是卒中研究中广泛使用的动物模型，可导致大脑皮层以及包括基底节和下丘脑在内的皮层下结构发生缺血。此模型可产生永久性或短暂性脑缺血。根据管腔内缝线是保留在原位还是在特定时间后移除，脑缺血会形成一个细胞死亡发生的梗死核心，以及一个称为半暗带的周边缺血区域，在该区域内部分细胞功能可能恢复。在开始之前，让我们花一点时间描述一下我们将要遵循的步骤。此处展示的是大鼠颅脑循环系统的简化示意图。在本手术中，我们将暴露左侧颈总动脉（CCA）分叉处附近的颈总动脉，该分叉处分为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。ECA的两个小分支，即枕动脉和甲状腺上动脉，将使用双极电凝进行结扎，ECA则在这两个分支的远端用丝线结扎。随后，将使用微血管夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。随后将一根带有硅胶涂层尖端的尼龙单丝缝合线通过颈外动脉（ECA）的切口插入，并经颈内动脉（ICA）向上引导。在松开ICA上的微型夹之前，先用丝线在ECA周围将该管腔内缝合线轻轻打结固定。然后将管腔内尼龙缝合线向前推进约两厘米，直至其硅胶尖端阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部。从颈总动脉（CCA）上移除第二个微型夹，并开始计时阻断持续的时间。现在我们已经了解了该操作的总体流程，接下来开始手术。按照贵机构的动物护理指南，像进行任何外科手术一样准备大鼠。我们使用5%异氟烷（isoflurane）进行诱导麻醉，氧气流速为每分钟1升，一氧化二氮流速也为每分钟1升；随后将异氟烷浓度降低至1%～2%以维持麻醉状态。当达到麻醉平面后，我们在两只眼睛上涂抹人工泪液软膏，并使用电推剪剃除颈部毛发。随后用聚维酮碘溶液对该区域进行消毒，再用70%乙醇擦拭。此过程应重复进行，共完成三轮聚维酮碘和70%乙醇的冲洗。将小鼠放入无菌袜子中，并置于温控毯上，以预防低体温。可在小鼠头部下方垫入一支15 ml锥形管，略微抬高颈部，有助于操作。这将有助于后续暴露颈动脉。最后，在手术显微镜下，沿预计切口部位皮下注射0.2 ml的0.5%布比卡因溶液，以提供术后镇痛。使用10号刀片做正中切口。接下来的解剖操作将在动物中线的左侧进行。从浅筋膜开始解剖，需结合钝性分离与锐性分离技术进行。可见广泛的腺体组织位于外侧，而较大的胸骨舌骨肌位于中线位置。使用棉签轻轻分离外侧的腺体组织和内侧的胸骨舌骨肌。在腺体组织下方，可见二腹肌和胸锁乳突肌，这些肌肉与中线处的胸骨舌骨肌共同构成一个肌性三角，其顶点已用圆圈标出。解剖操作将在该三角区内继续深入至颈动脉。使用显微剪刀剪开覆盖在肌肉表面的筋膜，以便将肌肉牵开，从而暴露其下方的血管结构。棉签可用于牵拉肌肉，以暴露常见的拥挤的颈外动脉、外侧拥挤动脉、拥挤的颈内动脉。继续操作以暴露颈外动脉（ECA）的分支，这需要对血管进行精细的锐性分离。这些步骤的目的是将颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）从其下方的结缔组织中游离出来。继续沿颈外动脉进行解剖。需要注意的是，可能会遇到下颌下骨（HI hide bone），这将限制向头侧解剖的范围。迷走神经呈白色，沿两侧颈总动脉和颈内动脉的外侧走行，我们将其与颈总动脉和颈内动脉锐性分离。来自颈外动脉的两个分支也被锐性分离。第一个向外侧走行的分支是枕动脉，第二个向内侧走行的分支是甲状腺上动脉。电凝并切断颈外动脉（ECA）的第1和第2分支。切断这些分支有助于更方便地游离血管。在后续操作中，使用丝线缝合尽可能向远端牢固结扎ECA。在颈总动脉分叉近端的 ECA 周围再放置一根丝线缝线，松松结扎。注意不要用此结扎线阻断血管，因为用于大脑中动脉闭塞的血管内缝线将通过 ECA 的这一段。随后将在颈总动脉和颈内动脉上放置微血管夹。该位置位于颈外动脉（ECA）起始处稍远端。接下来，在ECA的两根丝线结扎线之间做一个部分动脉切开。可能会有少量残留血液流出，但大量出血则可能提示使用微血管夹夹闭不当。此时，务必确保没有深层组织被夹住而妨碍夹子完全闭合。下一步是将一段三厘米长的单丝尼龙缝线插入颈外动脉（ECA）。在缝线的硅胶涂层尖端两厘米处做一标记会有所帮助。这些缝线可直接从商业渠道获得，硅胶涂层的尖端直径和长度可根据您所使用大鼠的年龄和体重按需定制。对于300克重的大鼠，我们采用尖端直径为0.39毫米、硅胶涂层长度为2至3毫米的4-0尼龙缝线。将阻塞用尼龙缝线插入颈外动脉管腔，向颈总动脉方向推进。收紧丝线缝合线，将其结扎在颈外动脉残端上，以固定血管内尼龙线并防止出血。剪除剩余的颈外动脉部分，使残端游离，并将颈外动脉残端置于分叉点下方，大致与颈内动脉成一直线。这样可更顺利地将血管内缝合线滑入颈内动脉。移除颈内动脉上的微血管夹。注意在完全移除前应缓慢打开夹子，以检查是否有出血。继续将尼龙缝合线沿颈内动脉管腔向前推进，直至到达大脑中动脉。该长度通常约为两厘米，因此在插入缝线前需在缝线上做标记。当插入一段长度不一的尼龙缝线后，若仍有较多尼龙缝线位于血管外时即感到阻力，则很可能提示缝线正在进入蝶腭动脉。此时应后撤缝线，并将其略微弯曲，以继续沿颈内动脉（ICA）更直接地行进。请注意在这两张对比图像中，缝线在颈内动脉（ICA）管腔内位置的变化。继续将缝线向前推进，穿过颈内动脉，直至大部分缝线已插入，并在此处再次感受到阻力。此时，管腔内缝线已阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部。启动计时器并记录阻断开始时间。移除颈总动脉上的另一枚微血管夹，迅速而仔细地关闭切口。将大鼠放入恢复笼中。在阻断期即将结束前，检查笼底鼻部和口周区域无垫料。麻醉大鼠，拆除缝合线以重新打开切口。如前所述，在颈总动脉（CCA）上放置一个微型夹。将阻塞缝线从颈内动脉（ICA）中部分撤出，直至缝线末端在颈内动脉内可见。此时暂不完全移除缝线。随后，在颈内动脉上位于腔内缝线位置的上方放置另一个微型夹，完全移除阻塞缝线，并结扎颈外动脉（ECA）残端。记录再灌注开始时间。移除颈内动脉和颈总动脉上的微型夹子，并用数滴无菌生理盐水润湿该区域，随后缝合切口。我们以每公斤体重0.05毫克的剂量注射布托啡诺，以提供额外的术后镇痛。我们还通过腹腔注射5毫升生理盐水，以在恢复阶段提供水合作用。待大鼠从麻醉中恢复后，通过尾部悬吊进行行为学检测，观察其在抬高体位摆动测试中是否仅向一侧扭转，以评估脑梗死的行为学表现。出现中风症状的大鼠在开放场地活动中也可能表现为单侧转圈行为。本研究展示了自发性高血压大鼠大脑中动脉闭塞60分钟后的实验结果。在MCAO术后24小时进行磁共振成像，图中显示T2加权图像。该大鼠出现大面积梗死，累及皮质和纹状体区域。在MRI上，高信号区域以黄色标出，尽管我们在此未展示结果。通过MRI可视化的梗死区域可进一步采用弥散加权成像及表观扩散系数图进行分析。梗死区域还可通过新鲜分离的脑切片组织学染色加以确认，使用三苯基四氮唑氯化物（TTC）进行染色时，活组织中的脱氢酶可将底物转化为不溶性红色染料。因此，梗死区域未被染色而呈白色。需要注意的是，梗死面积可能受多种因素影响，包括大鼠品系和动物体型。我们采用自发性高血压大鼠，因为与其他常用品系（如frogg、dolly或wistar大鼠）相比，其产生的梗死面积更为一致。同时，采用目标大鼠体重进行标准化也很重要，以减少血管直径的差异，从而降低MCAA闭塞效果的变异性。希望本视频对您在自己实验室中开展MCA闭塞技术有所帮助。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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来源：Larpthaveesarp, A.，等．P10大鼠新生期卒中短暂性大脑中动脉闭塞模型．J. Vis. Exp.

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大鼠大脑中动脉线栓法内血管闭塞局灶性脑缺血模型

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