Name: 闪存冻结和Cryosectioning E12.5小鼠脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 32 s
Description: 学习使用OCT包埋和液氮速冻技术对小鼠E12.5胚胎脑组织进行冷冻切片的方法。本视频演示了冷冻切片机的操作技巧，包括如何避免组织裂纹和变形，确保获得高质量的神经组织切片用于后续分析。

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<ol>
<li>用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定组织，时间根据需要而定。</li>
<li>蔗糖浸渍组织（冷冻保护） <ol>
<li>在 2059 管中配制 30% 蔗糖溶液（w/v，溶于 PBS）。</li>
<li>用 PBS 清洗组织 3 次（每次约 5 分钟，摇床上操作）。</li>
<li>将组织放入 30% 蔗糖溶液中。&nbsp; 组织不会下沉。</li>
<li>将组织置于 4°C 过夜，或直至其下沉。</li>
</ol></li>
<li>用适当大小的冷冻模具，并标注信息和方向。</li>
<li>用 O.C.T. 填充冷冻模具（避免产生气泡）。</li>
<li>将组织转移至 O.C.T. 浴中，并用 O.C.T. 包裹组织。</li>
<li>将组织转移至冷冻模具中的 O.C.T. 内。</li>
<li>在显微镜下调整组织的方向。</li>
<li>将液氮倒入塑料培养皿中。</li>
<li>迅速而小心地将带有组织的冷冻模具放入液氮中（不要淹没模具顶部）。</li>
<li>当 O.C.T. 变为完全不透明的白色时，将冷冻组织放入 -80°C 冰箱中保存。</li>
<li>切片前，将组织在约 20°C 条件下平衡至少 30 分钟。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>组织学冷冻模具（Tissue-Tek Cryomold）</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td></td><td></td><td>30% 蔗糖溶液（溶于 PBS，w/v）</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td>4% 多聚甲醛（溶于 PBS）</td></tr></tbody></table>

e12.5小鼠脑组织的快速冷冻与冷冻切片

关键词：快速冷冻，冷冻切片，e12.5小鼠脑，胚胎脑，组织处理，低温切片，神经发育

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

本视频演示了对小鼠胚胎脑组织进行速冻和切片的技术。提供了使用冷冻切片机的实用技巧，包括在切片过程中可采用的故障排除方法，以确保所得组织切片无裂纹及其他变形。

E12.5小鼠脑组织的快速冷冻与冷冻切片

关键词：快速冷冻，冷冻切片，E12.5小鼠脑，胚胎脑，组织处理，低温切片，神经发育

大家好，我是来自加利福尼亚大学欧文分校Ed Maki实验室的Spencer Curley，我将演示如何进行冷冻切片。为此，我首先使用以下几种常用的试剂。我所用的包埋剂或包埋介质称为OCT（最佳切割温度介质）。它是一种透明的溶液，非常浓稠且具有高黏性，能在你调整组织方向时很好地固定组织，随后迅速冷冻。最终，它可溶于水，因此在任何染色步骤中都可以轻松去除。我将组织包埋在模具中。这些冷冻模具活检容器有多种尺寸。我将使用这个较小的模具，因为我处理的是小鼠的胚胎组织。我们会将组织在液氮中进行速冻。因此，首先我将从储罐中向这个保护性真空瓶内注入液氮。在对组织进行速冻之前，必须先对组织进行所谓的“冷冻保护”，否则冷冻过程本身会破坏组织。具体操作是将组织浸入30%蔗糖溶液中过夜。如果所需时间更长，也没有关系，只要组织完全沉底即可。如您所见，胚胎发育第12.5天的小鼠头部已完全沉入蔗糖溶液中，说明它们已准备好进行冷冻。接下来，我将把处于蔗糖溶液中的组织倒入一个较大的培养皿中，以便于操作。然后取适量OCT包埋剂，倒入一个直径为35毫米的培养皿中，该培养皿此时正倒扣在盖子上，以便获得合适的角度。因此，OCT 会沿着边缘积聚形成深度。我使用了一对较旧的钝头镊子，因为并不需要锋利的镊子，而且也不希望损坏另一对镊子。我用镊子轻轻夹起其中一个组织头，放入第一个 OCT 浴中。我只想用OCT包埋胚胎，这有助于组织更充分、更均匀地冷冻。组织周围不应残留任何蔗糖或气泡。务必避免产生气泡。因此，我只是轻轻地搅拌OCT，使其在样本周围和下方流动，同时将样本在OCT中移动，并静置几秒钟，与此同时我来填充冷冻模具。现在，我将用OCT填充冷冻模具，同样要避免气泡。我将把它填充到模具的顶部。正如您所注意到的，我已经对模具进行了标记，这样在样品冷冻后，我仍能清楚地辨识其方向。当OCT冻结时，它会变白，此时就无法再看到组织。因此，一定要用永久性记号笔标记冷冻模具。实际上我在OCT中确实产生了一个气泡，所以我要用镊子把它从边缘轻轻推出去。你不希望气泡影响到组织的冷冻效果。现在，我要将头部样本从这个培养皿转移到模具中的OCT包埋剂里。我将轻轻地把它从培养皿中取出，然后非常轻柔地放入模具中。接着，我会将模具放到显微镜下，以调整组织的方向。现在组织已经放在我的冷冻模具中了，我将通过显微镜观察，以便正确地定位组织。我将对这只小鼠头部进行冠状切片。因此，我需要调整其方向，以便将其放置在冰冻切片机中进行冠状切片。同样，我使用这些旧的钝头镊子，如您所见，这里有一些气泡，我将尽力将其排除。但这些较小的气泡并无问题，我并未注意到这些较小气泡带来任何影响。只需避免出现大气泡即可。因此，我将尽可能地把它们移开，并且一定要经常擦拭镊子，这样能更好地避免产生气泡。现在，如果你们能看到我的标记，上方标有一个“t”，左侧标有一个“f”。这提示我胚胎的头部朝上，而前方或面部朝向我的左侧。这样我就知道制作冠状面切片时应从哪个表面进行切面，我只是轻轻移动组织。同样，有时这会引入气泡，因此需要将气泡推出，以免它们与组织一同冻结。因此，存在气泡是不利的，主要是因为在冷冻过程中，气泡可能导致组织冷冻不均匀。快速冷冻的目的是使所有物质瞬间冻结。此外，当在切片过程中使用冰冻切片机切割组织时，如果刀片穿过气泡而非OCT包埋剂或组织本身，可能会导致卡顿或撕裂，从而破坏甚至损毁组织。因此，必须不惜一切代价避免产生此类气泡。尤其是较大的那些。所以我在这里仍然在调整它的方向。该组织已固定 24 小时，因此在操作时相当坚固。其他组织可能稍软一些，因此操作时需格外轻柔。当我在显微镜下将组织放置好，使其面部朝左、头顶部朝上后，还需确保其在其他方向平面上的位置也正确。因此，我将提起组织并透过立方体的各个面进行观察，以确认其方位无误。我看到它略微向下倾斜，所以我需要用镊子轻轻提起。好吗？这确实需要大量练习。好的，看起来不错。现在我要走到这边，用液氮将其冷冻。好的，现在组织已在冷冻模具中正确放置，我将把液氮倒入这个培养皿中。这只是一个普通的组织培养用塑料培养皿，液氮加至接近顶部即可。它蒸发得相当快。我将用镊子把冷冻模具放下去。正如您所见，我实际上已经把模具的下边缘弯折了。这确实有助于更好地操作。我将对其进行冷冻。随着组织和OCT一同冷冻，颜色会变为坚实的白色。待其完全凝固后，整个样本将变为白色。随后，我需要迅速将冷冻的组织放入 -80 °C 超低温冰箱中保存。操作时应小心持握，确保组织不被浸没。因此，你必须非常小心，仅将其置于液氮的液面顶部。好的，现在它已经冻结了。在放入-80℃冰箱之前，再在液氮中多保持几秒钟。好的，现在我将样本转移至-80°C冰箱。我已经从-80°C冰箱中取出我的组织，并将其放入此处的冷冻切片机中。切片机腔室的实际温度已降至-24°C。现在，您必须让组织平衡约半小时到一小时，然后才能开始切片；否则组织会太脆。尽管每台冷冻切片机都有所不同，我将仅针对这台设备指出一些基本事项。因此我们使用 Leica CM 3050 S。这是一台性能良好的仪器，因为它配有独立的样本冷却装置，这是一个很好的附加优势。您可以设定样本的温度，而不同组织在切片时需要不同的温度。因此，当你首次装载组织时，需要进行几项调整。这些调整在所有冷冻切片机上都类似。这些设备包含电子部件，其中一些为手动操作。例如，您需要缩回冷冻切片机的臂或向前推进，以将其调整至距离刀片更远或更近的位置。您可以快速或缓慢地进行操作。还可以通过此处的加号或减号来设置切片的厚度。接下来，您需要在修剪或切片厚度之间进行选择，该选项由此处中间的按钮指示。您可以通过按下此按钮并使用上方或下方的箭头，根据此数字显示屏上的读数来设定切片室或样本本身的温度。对我们而言，在进行冷冻切片时，会使用这些 Fisherbrand SuperFrost Plus 显微镜载玻片。它们表面涂有某种黏合剂，以确保组织在处理过程中不会脱落。有时在切片过程中，您会发现组织显得略微偏软，其迹象表现为组织接触刀片时发生堆积。此时，可使用这种Fisher品牌的超友好冷冻剂来解决该问题。它能快速冷冻组织，你只需将它对准组织，按下扳机，如果组织太软，它就能迅速将其重新冻结。在将组织安装到切片夹头上进行切片之前，我想带您快速了解一下这台设备的一些部件。这里就是安装刀片的位置，刀片通过这块金属板固定。通过抬起此臂，可根据需要拆卸和更换刀片。请确保安装牢固，但不要过度紧固刀片，否则刀片实际上会发生变形。你会注意到在切片过程中，组织的厚度并不一致。因此操作时，不要将这个臂完全压到底，只需将其下压至与刀片本身基本齐平的位置即可。在切片过程中，您可能还需要调整另一个部件，称为防滚板。它是一块玻璃，可插入此处的支架中，并可通过这个带弹簧的螺丝进行调节。基本上可以前后移动它，从而保持组织或切片的平整，以便将其贴附到载玻片上。在切片过程中，另一个可能需要调整的是刀片上实际进行切割的位置。那么如何进行调整呢？只需抬起这个杠杆，即可将整个装置向左或向右滑动。只有在发现组织被刀片的某个特定部位挂住，或为了节省刀片（因为刀片相对昂贵）时，才需要使用此功能。通过前后移动，即可找到一个干净的切割区域。另一个可调节的参数是切割角度。现在在这个侧面（您将无法看到的位置）有三个不同的档位。我们通常使用中间档位，通过抬起这个杠杆来进行调节。而且，这个装置可以上下移动。我们通常将其保持在中间位置，所以现在我就先保持在这个位置。因此，这后面部分是冷冻切片机的头部，用于在切片过程中固定冷冻的组织样本。它可以上下摆动，并向刀片方向推进。基本上，您需要将组织样本安装到此处的样品台（chuck）上，然后将样品台放入切片头中并拧紧固定，再通过后方的旋钮调节角度，以获得更平直的切面。现在，我将把组织样本安装到样品台上。您需要保持样品台处于室温状态，因为首先需要添加一层OCT包埋剂，而您不希望它立即冻结，以便形成均匀平整的一层。我们将使用这里的这个装置，它被称为热提取器。实际上，它将在OCT冻结时用于将其压平。因此，我首先取出室温下的样本，并将其放入这个支架中。取一些我的OCT包埋剂气泡。这里不需要太在意，因为它们会被挤出去。只需加一点，不需要太多。取下热提取装置，将其直接放置在下方。等待几秒钟，此时可以看到OCT已变得平整良好。现在我已拿到组织样本，需要在OCT包埋剂上标记实际位置。好的，我将在OCT上做一个标记，以指示其方位。看，我已用一个蓝色圆点标记了顶部。现在，我将把组织块从模具中取出，方法是轻轻向其背面施加压力。我会轻柔地从背面推动，使组织块落入手中，但同样需要注意不能让其解冻。因此，取出后我会立即将其放回。现在你可以看到这块组织，上面有我标记的蓝色记号，我知道这是胚胎头部的顶端。我想对脸部进行切片，因为这些是冠状切片。现在，我将再加入一滴OCT，一大滴，而且我必须迅速操作，因为所有东西都是冷的。接着，我会取我的组织样本，将其准确地放在中央，确保它紧贴之前已制备好的OCT基底。接下来我只需让其冷冻，大约需要一到两分钟。现在冷冻已经完成。接下来，我将把固定在样品夹上的组织放入切片头中，尽量将其放正，然后拧紧。这样就固定得很牢固了。我将把它放在刀片前方，然后向前推进，这个过程可能需要几秒钟。好的，现在我将使用刀片的平边对组织进行精细定位。因此，我只需观察边缘，并上下摆动组织，以确保边缘对齐。如果它们没有对齐，你知道的，可能会看起来像这样。我显然夸张了，但你可以看到这里它没有紧贴刀片，不是直的。因此我只需不断进行调整，直到感觉它已经尽可能直为止。我认为这已经相当不错了。我会从各个角度检查，以确保组织能与刀片垂直切割，并利用刀片的边缘来判断这一点。因此，我从上方观察，也从侧面观察，发现组织的摆放位置实际上相当理想。我不需要做太多调整，但如果需要的话，我可以使用头部后方的旋钮。通过向左或向右旋转这些旋钮，就可以进行精细调节。不过目前看起来已经相当不错了。现在，我正在推进组织，但尚未开始切割，因为组织还未接触到刀片。组织已深嵌在OCT包埋剂中。因此，到达组织可能需要几分钟时间。操作时不能太快，否则可能会卡住，导致OCT包埋剂和组织开裂；但也不能太慢，否则将耗费极长时间。这台仪器有一个很好的功能，就是可以先以较厚的切片进行修块，这样就能加快进程。现在我正在切割OCT包埋剂，因此我会稍微放慢速度。此时我尚未切到组织，但需要评估切片的进展情况。许多变量都可能影响组织切片的效果，导致切片结果非常好或非常差。使用这台冷冻切片机时，我发现最常出现的情况是组织实际上有点过冷。我已经降低了温度，但似乎仍然偏冷。结果就是刀片在穿过组织和OCT包埋剂时会产生颤振。因此，你会在OCT中看到这些细小的、呈水平走向的线条。我的做法是用拇指轻轻加热边缘，通过轻触并滑动拇指来预热OCT，时间不宜过长。当我随后进行切片时，发现切片效果明显改善，震颤现象也已消失。因此，在处理组织之前，我会先评估这些情况。我注意到，当刀片切过组织时，OCT 中实际上出现了刮擦或裂纹。因此，我首先要做的就是更换刀片。我不确定这把刀片已经安装了多久，也不知道之前是谁使用过，所以我准备换一把新的刀片。这些刀片显然非常锋利，因此必须小心操作。接下来我将调整防滚动板，底部有一个带弹簧的螺丝，只需从下方伸入即可将其向内或向外调节。我已经切进组织内部，推进并切片足够多的层次。不幸的是，OCT 包埋块上出现了一道裂纹，这种情况经常发生，而且很遗憾无法完全避免，但你可以采取一些措施来修复。如果裂纹贯穿了组织本身，那么你只能丢弃该样本，或者尽量抢救尚可利用的部分。在这种情况下，切口似乎位于组织上方。因此，我将取一把已放入冷冻切片机中的剃刀刀片，它已经冷却。接下来，我将尝试切除 OCT 包埋块顶部的裂纹部分。因此，我将再次用拇指加热 OCT 包埋块的表面，然后进行切片。如您在此处所见，该区域存在裂纹。因此，我先取下带有组织的切片部分，然后将剩余的 OCT 包埋剂直接甩掉，这部分是已经裂开的。接下来，我将尝试使用预冷的剃须刀片切除这个裂开的部分。操作时必须切得非常平直，并且要用双手操作，均匀地向刀片施加压力。我将把刀片在 OCT 包埋剂中来回 rocking（摇动），从而缓慢地切割进入 OCT。通过来回摇动，缓慢切割，希望可以去除开裂的部分。好的，我将通过切除多余的OCT来修整。好的，看起来不错。接下来我会稍微回缩一下样本头部，因为我已经制造出一些可能卡住刀片的边缘，如果发生这种情况，实际上可能会导致OCT和组织断裂，从而破坏我的样本。所以我已经回撤了，需要再向前推进一点以重新进入组织，希望我已经纠正了裂隙。好的，现在我重新进入了组织。好的，看起来我已经纠正了这个问题。因此，OCT包埋剂中已不再有任何裂纹，这将使切片的获取变得更加容易。现在，我将推进到我感兴趣的组织区域。目前，我刚刚到达表面，接下来需要进入该胚胎的脑组织内部。这些刷子足够大，使我能够清楚地看到我感兴趣的结构。我之前忘记提到，我会使用这些刷子在每次采集切片之间清洁刀片。这个较大的刷子仅用于清洁区域并去除多余的OCT包埋剂。我还会使用这些更精细的刷子，在将组织切片转移到切片上时，借助此处的冷板对其进行操控和定位。同样，这些刷子需保持低温，以防止OCT融化并粘附在刷子上。因此，在获取组织时，我将首先用拇指加热OCT和组织。我将取一张我已经标记好的载玻片。我将其倒置，每个人的操作方式可能不同。但我的做法是：当载玻片朝下时，用右手捏住其右上角。然后用我的左手拇指作为支点，以便能够垂直向下压向载玻片，从而捕获切片。OCT 包埋剂和组织实际上会融化并粘附在载玻片上，实现自动贴附。因此，我首先用拇指缓慢加热组织，完成切片后，取来载玻片，用右手握住其右角，移动样品板，将其垂直放下，让组织自然融化贴附。我将检查组织，确保没有褶皱或气泡，且外观良好。我将继续此操作，直至完成整个脑组织的切片。现在我正在解剖显微镜下观察切片，以确保其质量良好，确实如此，可以看到切片顶部的前脑结构，所有切片看起来都非常理想。这些冷冻切片可用于原位杂交等实验。我们有时也会进行基础组织学检测，如苏木精-伊红染色。此外，还可用于免疫荧光以及其他多种类似检测。对我来说，这些组织样本已固定并进行原位杂交处理，因此接下来我将进行这一步骤。

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科研

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生物学

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