Name: 闪存冻结和Cryosectioning E12.5小鼠脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 32 s
Description: 学习使用OCT包埋和液氮速冻技术对小鼠E12.5胚胎脑组织进行冷冻切片的方法。本视频演示了冷冻切片机的操作技巧，包括如何避免组织裂纹和变形，确保获得高质量的神经组织切片用于后续分析。

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<ol>
<li>用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定组织，时间根据需要而定。</li>
<li>蔗糖浸渍组织（冷冻保护） <ol>
<li>在 2059 管中配制 30% 蔗糖溶液（w/v，溶于 PBS）。</li>
<li>用 PBS 清洗组织 3 次（每次约 5 分钟，摇床上操作）。</li>
<li>将组织放入 30% 蔗糖溶液中。&nbsp; 组织不会下沉。</li>
<li>将组织置于 4°C 过夜，或直至其下沉。</li>
</ol></li>
<li>用适当大小的冷冻模具，并标注信息和方向。</li>
<li>用 O.C.T. 填充冷冻模具（避免产生气泡）。</li>
<li>将组织转移至 O.C.T. 浴中，并用 O.C.T. 包裹组织。</li>
<li>将组织转移至冷冻模具中的 O.C.T. 内。</li>
<li>在显微镜下调整组织的方向。</li>
<li>将液氮倒入塑料培养皿中。</li>
<li>迅速而小心地将带有组织的冷冻模具放入液氮中（不要淹没模具顶部）。</li>
<li>当 O.C.T. 变为完全不透明的白色时，将冷冻组织放入 -80°C 冰箱中保存。</li>
<li>切片前，将组织在约 20°C 条件下平衡至少 30 分钟。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>组织学冷冻模具（Tissue-Tek Cryomold）</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td></td><td></td><td>30% 蔗糖溶液（溶于 PBS，w/v）</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td>4% 多聚甲醛（溶于 PBS）</td></tr></tbody></table>

e12.5小鼠脑组织的快速冷冻与冷冻切片

关键词：快速冷冻，冷冻切片，e12.5小鼠脑，胚胎脑，组织处理，低温切片，神经发育

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

本视频演示了对小鼠胚胎脑组织进行速冻和切片的技术。提供了使用冷冻切片机的实用技巧，包括在切片过程中可采用的故障排除方法，以确保所得组织切片无裂纹及其他变形。

E12.5小鼠脑组织的快速冷冻与冷冻切片

关键词：快速冷冻，冷冻切片，E12.5小鼠脑，胚胎脑，组织处理，低温切片，神经发育

大家好，我是来自加利福尼亚大学欧文分校Ed Maki实验室的Spencer Curley，我将演示如何进行冷冻切片。为此，我首先使用以下几种常用的试剂。我所用的包埋剂或包埋介质称为OCT（最佳切割温度介质）。它是一种透明的溶液，非常浓稠且具有高黏性，能在你调整组织方向时很好地固定组织，随后迅速冷冻。最终，它可溶于水，因此在任何染色步骤中都可以轻松去除。我将组织包埋在模具中。这些冷冻模具活检容器有多种尺寸。我将使用这个较小的模具，因为我处理的是小鼠的胚胎组织。我们会将组织在液氮中进行速冻。因此，首先我将从储罐中向这个保护性真空瓶内注入液氮。在对组织进行速冻之前，必须先对组织进行所谓的“冷冻保护”，否则冷冻过程本身会破坏组织。具体操作是将组织浸入30%蔗糖溶液中过夜。如果所需时间更长，也没有关系，只要组织完全沉底即可。如您所见，胚胎发育第12.5天的小鼠头部已完全沉入蔗糖溶液中，说明它们已准备好进行冷冻。接下来，我将把处于蔗糖溶液中的组织倒入一个较大的培养皿中，以便于操作。然后取适量OCT包埋剂，倒入一个直径为35毫米的培养皿中，该培养皿此时正倒扣在盖子上，以便获得合适的角度。因此，OCT 会沿着边缘积聚形成深度。我使用了一对较旧的钝头镊子，因为并不需要锋利的镊子，而且也不希望损坏另一对镊子。我用镊子轻轻夹起其中一个组织头，放入第一个 OCT 浴中。我只想用OCT包埋胚胎，这有助于组织更充分、更均匀地冷冻。组织周围不应残留任何蔗糖或气泡。务必避免产生气泡。因此，我只是轻轻地搅拌OCT，使其在样本周围和下方流动，同时将样本在OCT中移动，并静置几秒钟，与此同时我来填充冷冻模具。现在，我将用OCT填充冷冻模具，同样要避免气泡。我将把它填充到模具的顶部。正如您所注意到的，我已经对模具进行了标记，这样在样品冷冻后，我仍能清楚地辨识其方向。当OCT冻结时，它会变白，此时就无法再看到组织。因此，一定要用永久性记号笔标记冷冻模具。实际上我在OCT中确实产生了一个气泡，所以我要用镊子把它从边缘轻轻推出去。你不希望气泡影响到组织的冷冻效果。现在，我要将头部样本从这个培养皿转移到模具中的OCT包埋剂里。我将轻轻地把它从培养皿中取出，然后非常轻柔地放入模具中。接着，我会将模具放到显微镜下，以调整组织的方向。现在组织已经放在我的冷冻模具中了，我将通过显微镜观察，以便正确地定位组织。我将对这只小鼠头部进行冠状切片。因此，我需要调整其方向，以便将其放置在冰冻切片机中进行冠状切片。同样，我使用这些旧的钝头镊子，如您所见，这里有一些气泡，我将尽力将其排除。但这些较小的气泡并无问题，我并未注意到这些较小气泡带来任何影响。只需避免出现大气泡即可。因此，我将尽可能地把它们移开，并且一定要经常擦拭镊子，这样能更好地避免产生气泡。现在，如果你们能看到我的标记，上方标有一个“t”，左侧标有一个“f”。这提

flash-freezing-and-cryosectioning-e125-mouse-brain

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

闪存冻结和Cryosectioning E12.5小鼠脑

本视频展示了小鼠脑组织的冷冻保存方法，以从肿瘤组织中分离出特定的解剖区域或特定细胞群体。该技术对于获得脑组织形态学的最佳光学分辨率，进而进行后续分析至关重要。...

小鼠脑组织的速冻保存：一种用于组织学分析的快速冷冻完整小鼠脑标本的技术

在本视频中，我们演示了使用冷冻切片机对冷冻的小鼠脑肿瘤组织进行切片。所获得的冷冻脑组织切片将保存在低温条件下，直至进行后续分析。...

冷冻小鼠脑组织切片：从小鼠冷冻脑组织获取薄切片的操作流程

本视频演示了制备小鼠冷冻脑组织切片以用于下游分析的详细逐步操作流程。...

小鼠脑组织的下游分析处理

本文介绍一种可同时对多只动物的脑组织进行冷冻切片的实验方案，作为替代单个处理脑组织的省时方法。该方法可降低免疫组织化学染色过程中的变异性和减少冷冻切片及成像所需的时间。...

同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

本实验方案描述了利用廉价且常见的工具采集离散的冷冻脑区，以获得高质量蛋白质和RNA的方法。...

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。...

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

本方案描述了一种实用策略，可在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪前，加快立体定位注射坐标的验证步骤。...

通过冰冻切片法对立体定位注射坐标的初步验证

本研究介绍了一种简化的组织处理流程，包括断头、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，该方法可进一步扩展至共聚焦和多光子成像。该技术具有与复杂解剖方法相当的效率，且无需依赖高超的手术操作技能。定量图像分析为其提供了广泛的研究潜力。...

直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

学习使用OCT包埋和液氮速冻技术对小鼠E12.5胚胎脑组织进行冷冻切片的方法。本视频演示了冷冻切片机的操作技巧，包括如何避免组织裂纹和变形，确保获得高质量的神经组织切片用于后续分析。

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