闪存冻结和Cryosectioning E12.5小鼠脑

大家好，我是来自加州大学欧文分校和 Ed Maki 实验室的 Spencer Curley，我将演示如何进行冷冻切片。为此，我首先使用这些常用试剂。我使用的包埋化合物或包埋介质称为 OCT，用于最佳切割温度。

这是一种透明的溶液，非常粘稠，可以很好地固定组织，同时您可以定位组织，然后它会冻结，最终它是水溶性的，因此您可以在任何类型的染色过程中去除它。所以我把纸巾包埋在模具里。这些冷冻模具活检容器有各种尺寸。

我将在这里使用这个较小的模具，因为我从小鼠那里做胚胎组织。我们快速冷冻我们的组织和液氮。首先，我将用我们水箱中的液氮填充这个保护性真空瓶。

在快速冷冻组织之前，您必须对组织进行冷冻保护，否则冷冻本身会破坏组织。所以你要做的是将组织沉入 30% 蔗糖溶液中过夜。如果需要更长的时间，那也没关系，只要组织下沉即可。

正如你所看到的，Visa 胚胎第 12.5 天的小鼠头部已经沉入蔗糖溶液中，因此它们已准备好冷冻。所以现在我要简单地将蔗糖溶液中的组织倒入我所在的一个更大的培养皿中，这样我就可以作组织了。我要取一些 OCT 倒入这个 35 毫米的培养皿中，它实际上是放在盖子上的，这样我就可以以一定角度获取它。

因此，OCT 沿着边缘汇集以获得深度。所以我使用一对较旧的钝镊子，仅仅是因为您不需要它们很锋利，也不想毁坏另一对镊子。所以我，我拿起它们，非常轻柔地把其中一个头抬出来，然后把它放进OCT的第一次沐浴中。

我只想用 OCT 包衣给胚胎涂上一层。这样可以更好、更均匀地冷冻组织。您不希望组织周围有任何残留的蔗糖或任何气泡。

绝对避免气泡。所以我只是轻轻地搅拌 OCT 在头部周围和下方，移动头部，通过 OCT 移动，让它在那里静置几秒钟，然后填充我的冷冻模具。所以现在我要用 OCT 填充冷冻模具，再次避免气泡。

我只是要把它装满，直到模具的顶部。正如你会注意到的，我已经标记了模具。所以我会的，在它被冻结后，我将能够看到我的方向。

当 OCT 冻结时，它会变成白色，并且您无法再看到您的组织。所以你肯定想用永久性记号笔标记。这，冷冻模具。

实际上，在 OCT 中，我确实在里面有一个气泡，所以我要用镊子把它推出来。你不希望它干扰你的组织冻结。所以现在我要将这个盘子的头部转移到我模具中的 OCT 中。

我只是把它从盘子里拿出来，然后非常轻柔地把它放进模具里。然后我要去显微镜前，在那里我将定位组织。我在我的冷冻模具里有组织，我要通过内窥镜查看，以便确定它的方向。

我将通过这个老鼠头做冠状切片。所以我需要调整它的方向，以便我可以将其放置在冠状切片的低温恒温器中。所以再说一次，我正在使用这些旧的钝镊子，正如你所看到的，这里有一些气泡，我将尽我所能将它们取出。

但这些较小的气泡不是，也不是坏事。我没有注意到这些小气泡的任何东西。你只是不想要大气泡。

所以我会尽我所能将它们铲出，并且一定要经常擦拭镊子，因为这样可以更好地避免气泡。现在，如果你能看到我的标签，我的顶部有一个 t，左边有一个 F。这只是向我表明，头部、头顶将向上，而正面或面部将在我的左侧。

这样我就知道冠状切片要切开哪个表面，我只是在轻推组织。同样，有时这会引入气泡，您只想将它们推出，这样它们就不会与组织一起冻结。所以有气泡很糟糕，主要是因为当你冻结时，组织气泡会导致不一致的冻结。

快速冻结的目的是一次冻结所有内容。此外，当您切割组织和低温恒温器时，如果刀片穿过气泡而不是 OCT 或组织，它可能会导致卡住或撕裂，并破坏或破坏您的组织。所以你绝对想不惜一切代价避免这些气泡。

尤其是较大的。所以我仍然把它定位在这里。这个组织已经固定了 24 小时，所以它对我的作非常坚固。

其他组织可能更柔软一些，因此您只想非常轻柔。因此，一旦我将其放置在瞄准镜下方，脸朝左，头顶朝上，我就需要确保它在其他方向平面上也是正确的。因此，我将抬起并查看立方体的所有面，以确保它是正确的。

我看到它略微向下倾斜，所以我只能用镊子抬起。好？这肯定需要大量的练习。好吧，看起来不错。

现在我要走到这里，把它放在液氮中冷冻。好了，现在组织在冷冻模具中的位置已经正确定向，我将把我的液氮倒入这里的这个培养皿中。这只是一个普通的塑料培养皿，用于组织培养，直到顶部。

它很快就蒸发了。我要拿起我的镊子，放下冷冻模具。正如你所看到的，我实际上已经弯曲了下唇。

这绝对可以带来更好、更好的控。我要冻结它。当组织和 OCT 冻结时，它会变成纯白色。

一旦完成，它将全部是白色的。然后我必须快速将冷冻的组织放入零下 80 度的冰箱中储存。你想握住它，这样组织就不会被淹没。

所以你必须非常小心，把它放在液氮的顶面。好了，现在它被冻结了。在我达到负 80 度之前，再保持几秒钟。

好了，现在我要把它调到负 80 度。所以我从零下 80 度中取出我的组织，并将其放入这里的低温恒温器中。腔室实际上下降到零下 24 摄氏度。

现在，您必须让组织平衡大约半小时到一个小时，然后才能开始切片。否则，它太脆了。因此，虽然所有 cryos 统计数据都不同，但我只想在这里指出关于这台机器的一些基本信息。

所以我们使用 Leica CM 30 50 s。这是一台很好的机器，因为它有一个单独的样品冷却装置，这是一个很好的附加好处。您可以设置试样温度，并且不同的组织需要不同的切割温度。

因此，当您第一次加载组织时，您需要进行一些调整。这些在所有 cryos 统计数据上都是相似的。这些是电子设备，其中一些是手动作的。

例如，您需要缩回低温恒温器的臂或将其向前推进，以使其更靠近或更靠近刀片。你可以快点或慢点。您可以在此处使用加号或减号设置切割的厚度。

您将在修剪或截面厚度之间进行选择，这在此处的中间按钮中指示。您只需按下此按钮并使用这些向上或向下箭头来调节温度，即可在此数字显示屏旁边设置腔室或样品本身的温度。因此，对我们来说，当我们进行冷冻切片时，我们会使用这些 fish fisher 品牌的 Super frosts 和显微镜载玻片。

它们涂有一些粘合剂，因此组织在加工过程中不会脱落。有时在切片过程中，您会注意到组织似乎有点软，如果它撞到刀片并聚拢起来，就会有一些迹象。你可以用它来解决这个问题的是这个 Fisher 品牌超级友好的冻结。

它，它是，它会快速冻结组织，您只需将其对准您的组织并按下扳机，如果组织太软，它会迅速重新冻结组织。在将组织安装到卡盘上进行切片之前，我想带您快速浏览一下机器中的一些东西。所以这是您实际加载刀片的地方，刀片用这个金属板固定。

通过拉起这个臂，您实际上可以根据需要拆卸和更换刀片。确保它良好且安全。您不想过度固定刀片，否则它实际上会翘曲。

您会注意到在切片中，组织厚度不一致。所以你想要，你不想把这个手臂一直向下推。你只想让它到达它所在的地方，即使是刀片本身。

这是您在切片过程中可能需要调整的另一件事。它被称为防侧倾板。这是一块玻璃，可以在这里装进这个支架里，你可以在这里用这个弹簧加载的螺丝来调整它。

你基本上可以向前或向后移动它。这将使您的组织或切片保持平坦，以便您可以将它们安装在载玻片上。在切片过程中，您可能想要调整的另一件事是刀片上进行实际切割的位置。

那么你如何调整就是你只需抬起这个杠杆，你就可以向左或向右滑动整个装置。只有当您注意到您的组织卡在刀片的某个部分，或者您想节省刀片时，您才会真正使用它，因为它们相当昂贵。因此，您只需来回移动它即可找到一个漂亮干净的区域。

您可以调整的另一件事是切割角度。现在，在你看不到的一侧，有三个不同的位置。我们只使用中间位置，您可以通过抬起另一个控制杆来调整它。

而且，你可以让这个装置上下移动。我们总是把它放在中间。所以我现在就保持这种状态。

所以这里是低温恒温器的头部。它实际上会在切片时容纳冷冻组织标本。它上下摆动并朝着刀片前进。

基本上，您将组织安装在这个卡盘上，我们将卡盘放入头部，将其拧紧，然后使用后面的这些旋钮调整角度，使其切割更直。所以现在我要把组织安装到卡盘上。您希望将卡盘保持在室温下，因为您首先要添加一层 OCT，并且您不希望它立即冻结，因为您希望它是一个漂亮的平坦层。

我们在这里使用这个装置来做一个，它被称为热提取器。实际上，它将用于在 OCT 冻结时将其压平。所以我首先要做的是检查室温，然后将其放在这个支架上。

以我的一些 OCT 气泡为例。在这里没关系，因为他们会被挤出来。就加一个，一点点，不是你不需要太多。

拿起热量提取器，就把它放在那儿。等待几秒钟。然后你可以看到 OCT 很好而且很平坦。

现在我已经有了我的组织，我需要标记实际的 OCT。好的，所以我将在 OCT 上标记一个点，以指示它的位置。所以，我刚刚用蓝点标记了顶部。

所以现在我将把组织块从模具中取出，我只需推动它的背面即可。所以我要轻轻地推它的背面，然后把它推到我的手里，但同样，我不希望它解冻。所以我把它放回去。

所以现在你可以看到我贴在上面的带有蓝色标记的组织块。所以我知道那是胚胎的头顶。我想切开面部，因为这些是冠状切片。

所以现在我要做的是再添加一滴 OCTA 大液滴，我现在必须迅速采取行动，因为一切都很冷。我拿起我的纸巾，把它放在中间，确保它平放在已经做好的 OCT 床上。现在我让它冻结，这大约需要一两分钟。

所以现在它已经完成了冻结。我要把安装在卡盘上的组织放在卡盘上，把它放进头部，尽可能地把它弄直，然后收紧。它可以，它很好，很紧。

我将它放在刀片的正前方，然后推进它，这可能需要几秒钟。好了，现在我将使用刀片的平坦边缘来真正对组织进行精细定位。所以我只是，我，我会看一下边缘，上下摆动组织，以确保边缘对齐。

如果他们没有，你知道，它可能看起来像这样。我显然夸大了它，但你可以在这里看到，它不是直接靠在刀片上。所以我只是不断进行调整，直到我觉得它尽可能地直。

我认为这很好。所以我从各个角度观察，以确保组织会直接切到刀片上，然后我用刀片的边缘来表示这一点。所以我往上看，从侧面看，组织实际上看起来还不错。

我不必做很多调整，但如果我做了，我只会使用脑后的旋钮。通过向左或向右转动，您可以看到您可以以这种方式进行微调。但它看起来还不错。

现在，我，我实际上正在推进组织。它，它还没有切割，因为它没有抵住刀片。组织嵌入 OCT 深处。

因此，可能需要几分钟才能到达组织。您不想走得太快，因为它可能会卡住并破裂 OCT 和您的组织，但您也不想走得太慢，因为它可能需要很长时间。这台机器上有一个很好的功能，您可以在较厚的部分进行修剪，这将使您走得更快。

所以现在我实际上正在切入 OCT，所以我放慢了一点速度。所以我还没有开始研究组织，但现在是我评估切片将如何进行的时候。很多变量可以、可能导致您的组织切片进行得非常好或非常糟糕。

我发现这个低温恒温器最常发生的事情是，组织实际上有点太冷了。我已经，我已经降低了温度，但似乎还是有点太冷了。发生的情况是刀片会颤动穿过、穿过组织或 OCT。

所以你会得到这些小线，这些水平线穿过 OCT。我所做的是拿起我的拇指，简单地加热边缘，轻轻触摸 OCT 即可加热它，滑动我的拇指，不要太久。然后当我剖析它时，我注意到它们出来得好多了，喋喋不休也停止了。

所以，在我开始研究组织之前，我会评估这些类型的事情。所以我注意到，当刀片穿过组织时，OCT 中实际上有一个障碍或裂缝。所以我首先要做的一件事是更换刀片。

我不确定这把刀片在这里放了多久，在我之前是谁用过的，所以我只想继续把一把新刀片拿出来。这些显然非常锋利，所以你必须小心。所以我要调整防侧倾板，底部有一个装有弹簧的螺丝，你只需要伸到下面，就可以把它移进或移出。

所以我已经推进了足够多的切片，所以现在我进入了组织。不幸的是，OCT 的块上出现了裂缝，这种情况经常发生，不幸的是，你无法真正控制它，但你可以做一些事情来修复它。如果裂缝已经穿过组织，那么您必须丢弃样本或尝试挽救您能挽救的样本。

在这种情况下，裂缝似乎位于组织上方。所以我要做的是取一把已经放入低温恒温器的剃须刀片。它是，它是冰冷的。

我将尝试修剪掉 OCT 块顶部的破裂部分。所以，我将再次，我将用我的拇指来加热 OCT 块的表面。然后我要进行剖析，如果你能在这里看到它，它就是裂缝了。

所以我在那里取下了那块纸巾，然后我刚刚扔掉的 oct OCT 的其余部分，它是破裂的部分。所以我要做的是尝试使用冰镇的剃须刀片修剪掉破裂的部分。我必须非常笔直地进入，我必须用双手在刀片上均匀施加压力。

我将在 OCT 中来回摇晃刀片。所以我来回摇晃，慢慢切入 OCT。希望我能去除破裂的部分。

好的，我将通过去除这个多余的 OCT 来减少。然后，我将稍微缩回头部，因为我已经创建了可以卡在刀片上的边缘，如果发生这种情况，它实际上可能会折断 OCT 和组织，从而破坏我的样品。

所以我缩回了，所以我需要再向前推进一点才能回到组织中，希望我已经纠正了裂缝。好了，现在我回到组织上。好吧，看起来我确实纠正了它。

因此，OCT 中不再有任何裂缝，这将使捕获部分变得更加容易。所以现在我要推进到我感兴趣的组织部分。现在，我，我刚刚触及表面，我想进入这个胚胎的大脑。

这些足够大，我实际上可以看到我感兴趣的结构。我没有提到我使用这些刷子来清洁我要捕获的每个部分之间的刀片。这个大的仅用于清洁区域和去除多余的 ooc OCT。

我还使用这些更精细的画笔来纵这个冷板的截面，以便在我在截面上捕获它时将其定位。同样，这些是低温的，因此 OCT 不会融化并粘在刷子上。因此，为了捕获组织，我首先用拇指加热 OCT 和组织。

我将拍摄我已经标记的其中一张幻灯片。我把它倒过来，每个人的做法都不同。但我的做法是，当幻灯片朝下时，我喜欢用右手握住右上角。

然后用我的左拇指作为枢轴点，这样我就可以直接向下靠在板上并捕获该部分。OCT 和组织实际上会靠着载玻片融化并自行安装。所以首先，我会用拇指慢慢加热组织，抓住我的载玻片，用右手握住右角，移动板，将其笔直向下放下，让它融化。

我会检查组织，确保没有褶皱或气泡，看起来不错。我会继续这样做，直到我切开整个大脑。我现在通过解剖范围查看各个部分，以确保它们看起来不错，而且你可以看到，部分顶部的前脑看起来都很好。

您可以将这些冷冻切片用于原位杂交等作。我们有时会进行基本的组织学、h 和 e 染色。你也可以进行免疫荧光，你知道，有很多类似的检测方法。

特别是对我来说，这些切片是固定的，并进行了原位杂交处理。这就是我接下来要做的事情。