Name: 制备果蝇 S2细胞，光学显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习制备果蝇S2细胞用于光学显微镜观察的完整实验流程。本方法通过lectin包被促进细胞贴壁与铺展，结合固定和免疫染色技术，帮助研究人员清晰观察细胞结构并分析基因功能。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所 P30 CA23074、美国癌症协会机构研究基金 74-001-31 以及亚利桑那大学胃肠道 SPORE（NCI/NIH CA9506O）的支持。

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

对于细胞生物学领域而言，理想的实验体系应具备成本低廉、易于操作，并适用于多种技术方法的特点。Drosophila S2 细胞满足这些要求，因此已迅速成为越来越多细胞生物学实验室的首选体系。
我们简要介绍了制备S2细胞用于显微镜观察的方法。S2细胞的一个显著优点是其在正常空气环境和室温条件下生长良好，因此可在显微镜下长时间观察而无需特殊的维持条件。尽管在常规培养条件下，S2细胞通常呈一定程度的圆形且贴附较松散，但可通过诱导使其充分铺展，便于成像。将S2细胞培养在预先用刀豆蛋白A（concanavalin A）包被的玻璃底培养皿上，细胞会牢固贴附并在盖玻片上形成薄层，是极佳的显微观察样本。

<table><tbody><tr><td>S2 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 细胞</td><td>DGRC</td><td>货号 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 细胞</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>无血清培养基</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>无血清培养基</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>无血清培养基</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>加入 10%（终浓度）热灭活胎牛血清以配制完全培养基。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>100 倍抗生素溶液</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>含青霉素（10000 U/mL）、&lt;br/&gt;链霉素（10000 &amp;#x03BC;g/mL）和&lt;br/&gt;两性霉素 B（25 &amp;#x03BC;g/mL）</td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% 溶液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>无水，ACS 级</td></tr><tr><td>分子筛</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>3A 型</td></tr></tbody></table>

drosophila s2 细胞用于光学显微镜观察的制备

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

理想的实验体系应具备成本低廉、易于维护、适用于多种技术手段的特点，并且拥有丰富的文献资料和基因组序列数据库支持。Drosophila S2 细胞系由离体培养的 20-24 小时龄胚胎发育而来1，具备上述所有特性。因此，S2 细胞非常适合用于细胞过程的研究，包括鉴定参与特定过程或机制的分子组分所对应的基因。S2 细胞之所以具有广泛应用价值，主要归因于其易于培养的特性、对双链 RNA（dsRNA）介导的 RNA 干扰（RNAi）具有高度敏感性，以及无论是活细胞还是固定细胞，均可方便地进行荧光显微镜观察。
S2 细胞可在多种培养基中生长，包括多种价格低廉、商业化供应、成分完全明确且无血清的培养基2。此外，S2 细胞在 21–24°C 下生长最佳且增殖迅速，并可在多种容器中进行培养。与哺乳动物细胞不同，S2 细胞不需要控制气体环境，仅在正常空气条件下即可良好生长，甚至可在密封的培养瓶中维持培养。
在S2细胞中，RNAi操作的简便性可与通过相差显微镜或荧光显微镜对固定或活细胞中实验诱导的表型进行便捷分析相辅相成。S2细胞在培养中以单层形式生长，但不表现出接触抑制。相反，在高密度培养时，细胞倾向于形成集落状生长。在低密度下，生长于玻璃或组织培养处理过的塑料表面的S2细胞呈圆形且贴附松散。然而，通过将细胞短暂培养在涂有凝集素刀豆球蛋白A（concanavalin A, ConA）3的表面上，可显著改善S2细胞的细胞形态学特征，使其充分铺展。此外，S2细胞还可通过稳定转染表达荧光标记的探针，以标记活细胞或固定细胞中特定的结构或细胞器。因此，对细胞进行显微分析的常规流程如下：首先，对S2细胞（可携带表达标记探针的转基因）进行RNAi处理，以消除目标蛋白；RNAi处理时间可根据不同蛋白的 turnover 动力学进行调整，并在目标蛋白对细胞存活至关重要时，尽量减少细胞损伤或死亡。接着，将处理后的细胞转移至预先涂有ConA的培养皿中，其中的盖玻片可促使细胞铺展并牢固贴附于玻璃表面。最后，研究人员可根据需要选择合适的显微镜模式对细胞进行成像。由于S2细胞在室温及正常大气条件下仍能保持良好活性，因此特别适用于需要长时间观察活细胞的研究。

Drosophila Schneider（S2）细胞是基因发现与功能分析中日益常用的研究体系。我们的目标是介绍一些使S2细胞成为越来越重要的实验体系的显微技术。

Drosophila S2 细胞用于光学显微镜观察的制备

理想的实验体系应价格低廉且易于维护，适用于多种技术方法，并有大量文献支持……

本实验的总体目标是描述用于光学显微镜观察的黑腹果蝇 S2 细胞的制备方法。首先需准备玻璃底培养皿，然后以凝集素 ConA 包被玻璃底部，以此完成细胞的制备。以促进S two细胞的贴附和铺展。该实验步骤的第三步是将培养基和S two细胞加入培养皿中。最后一步是固定培养皿中的S two细胞并进行免疫染色。最终，可以通过荧光显微镜分别对活的或固定的 S2 细胞进行观察，获得目标荧光四标记或免疫标记蛋白的定位结果。大家好，我是来自亚利桑那大学细胞生物学与解剖学系 Greg Rogers 实验室的 Joey Club。我是 John Nye，同样来自 Rogers 实验室。我也是 Dan Buster，来自 Greg Rogers 实验室。今天我们将向您展示一种用于制备果蝇 S2 细胞以进行光学显微镜观察的实验方法。我们在实验室中采用此方法，通过研究重要调控蛋白的缺失或过表达后中心体数量和结构的变化，来探讨黑腹果蝇（Drosophila）中中心体复制的调控机制。现在开始操作。我们使用标准的35毫米培养皿来制备玻璃底培养皿。这些底部为玻璃的培养皿可使细胞保持在与其常规培养条件非常相似的状态，同时允许通过显微镜级玻璃对活细胞进行观察。组装玻璃底培养皿时，使用带有厚壁的泡沫盒表面贴上胶带作为钻孔平台。将直径35毫米培养皿的下半部分放置在钻孔平台上，使培养皿底部紧贴泡沫盒表面，同时牢固握住培养皿两侧，使用手钻配合直径3/4英寸的铲形钻头在培养皿上钻孔。在钻完所有培养皿后，使用粗粒度、圆锥形的磨头钻头（其直径与铲形钻头相近）来打磨孔的外缘，使其光滑。将电钻侧放，使钻头伸出工作台边缘。用某种沉重但柔软的物体压住电钻以固定其位置，例如一个装有10千克沙子的重型塑料袋。使用锁定按钮使钻头持续运转。通过手持培养皿并将其边缘与研磨钻头接触，打磨新钻孔的粗糙边缘，使皿口光滑。待所有孔的外缘均打磨光滑后，将培养皿底部放入一个大烧杯中，用蒸馏水反复冲洗数次。这将去除塑料或泡沫塑料的细小碎屑，这些碎屑之后会漂浮起来。将培养皿底部摊开晾干。当培养皿干燥后，准备 Sard 180 4 胶水。按照10比1的质量比例混合树脂和固化剂，并充分搅拌。在每个培养皿外表面的钻孔周围涂抹一小圈胶水。然后将盖玻片覆盖在孔上，使其与胶水接触。盖玻片的尺寸必须比培养皿中的孔大至少约一毫米，且小于培养皿的直径。盖玻片应平整均匀地贴合在培养皿上。现在将培养皿放置一旁备用。底部朝上，晾至干燥。此过程在室温下可能需要一天或更长时间，但可通过将培养皿置于温暖的培养箱中以加快干燥速度。培养皿干燥后，可用凝集素ConA或Con A进行包被。我们使用Con A，是因为将S2细胞接种到Con A包被的盖玻片上后，细胞会充分铺展，成为显微镜观察的优良样本。为了包被培养皿，取一个玻璃底培养皿，将10微升包被溶液滴加到玻璃的上表面。待其干燥后，用紫外灯对培养皿及其盖子进行灭菌。在组织培养操作台内，将培养皿翻转，使其内表面正对紫外灯管，开启灭菌用紫外灯，照射至少45分钟。可以使用多种培养基对S两细胞进行培养。为满足我们的实验需求，我们采用VITROGEN SF 902培养基。为制备用于显微镜观察的RNAi处理S两细胞，需轻柔重悬细胞，并将其转移至含有两毫升培养基的connexin包被的玻璃底培养皿中。健康的细胞一旦接触到connexin包被的盖玻片，便会紧密贴附于其表面并开始铺展。这一过程大约在15分钟时应已明显可见，并在45分钟至1小时之间完成。由于S two细胞在常规实验室温度和大气条件下易于维持，因此在将细胞置于显微镜下时，无需特殊条件或设备来防止脱水，只需确保培养皿中有足够的培养基即可。S two细胞的长时间活体成像具有可行性。这些实验的运行时间仅受限于常见的光漂白和光毒性问题。S 两个细胞可以固定在玻璃底培养皿或普通盖玻片上。但在本视频中，我们将演示在玻璃底培养皿中的固定和免疫染色操作。甲醇和甲醛是两种常用于S两细胞固定的固定剂。首先，将约300毫升无水甲醇置于一个带盖的1升玻璃烧杯中，并在防爆的-20摄氏度冰箱中预冷。当甲醇冷却后，从冰箱中取出。迅速从玻璃底培养皿中移除培养基，然后快速将培养皿浸入甲醇中。迅速将盛有培养皿的烧杯放回冰箱，固定细胞 10 至 15 分钟。10 至 15 分钟后，从烧杯中取出培养皿，倒掉残留的甲醇，并用 PBST 重新水化细胞。此时细胞已准备好进行标准染色步骤，后续将演示细胞固定的染色操作。使用甲醛时，我们采用10%甲醛和缓冲液。之所以使用这种相对高浓度的甲醛，是因为S2细胞缺乏细胞质中间丝，而中间丝通常有助于在固定过程中维持细胞形态和结构。将细胞在10%甲醛中固定10至15分钟。固定完成后，将甲醛倒入废液杯中，并用 PBST 对固定后的细胞进行三次短暂洗涤。开始免疫染色程序：向固定细胞中加入一毫升封闭液，孵育 15 分钟。我们通常使用含 5% 正常山羊血清的 PBST 溶液。倒掉封闭液，直接将一抗加入细胞中。将培养皿盖重新盖上，以防止抗体溶液蒸发，并在室温下孵育30分钟。30分钟后，移除一抗溶液。使用移液管向培养皿中加入 2 毫升 PBST，孵育 5 分钟后弃去 PBST 并更换。随后用 PBST 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，直接向细胞中加入 100 微升二抗。将培养皿盖重新盖上，在室温下让抗体与细胞孵育30分钟。30分钟后，移除二抗，并用PBST进行三次、每次五分钟的洗涤。最后，直接向细胞中加入几滴封片介质。盖上培养皿盖子，如有需要，将培养皿置于4°C避光保存。图中显示的是S2细胞接种到刀豆蛋白A包被和涂层玻璃底培养皿后的代表性相差显微图像，数字表示接种后的分钟数。15分钟时可见明显的自我铺展现象，60分钟时基本完成。注意，细胞在包被的盖玻片上铺展时相位变暗。在此放大的贴壁细胞图像中，由箭头所示的细胞延伸并铺展的边缘清晰可见。可以对两种细胞进行转染，使其表达荧光标记蛋白，以标记固定或活细胞中感兴趣的结构。在此示例中，两种细胞被瞬时转染了一种融合构建体，该构建体包含核定位蛋白（nucleo foin），即一种与荧光蛋白EGFP融合的细胞核标记物。这些细胞被接种于经conna包被的玻璃底培养皿中，随后使用微分干涉相差显微镜（DIC）和落射荧光显微镜进行成像。经RNAi处理的S2细胞也可固定后进行免疫荧光分析。这些图像显示了固定的S2细胞经免疫染色后，绿色显示中心标志物PLP，红色显示微管，蓝色显示染色体的DAPI染色。在固定和免疫染色之前，细胞分别接受了为期四天的对照RNAi处理或靶向敲低促进纺锤体极聚焦的NCDA驱动蛋白样蛋白的RNAi处理。使用NCD RNAi处理后，细胞出现纺锤体极散开和纺锤体结构紊乱的现象。进行此操作时，务必注意在培养皿上钻孔时要格外小心。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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制备果蝇 S2细胞，光学显微镜

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