荧光显微镜下细胞电融合的可视化
July 1st, 2010
在这个视频中，我们表现出高效的细胞电融合在体外修改坚持使用电和随后的细胞融合与可视化荧光显微镜检测方法。
电聚变涉及在近距离环境中将短高压电脉冲施加到电池中。在本视频中，我们演示了通过改良的 Adherence.Method 在体外电融合细胞。在小鼠黑色素瘤细胞 BF 1 上进行实验。
对于实验，请执行以下步骤。在两个单独的培养瓶中培养细胞至 80% 汇合。分别加入 2.1 μL 每种储备液。
在离心管中分别加入 10 毫摩尔 C-M-F-D-A 或 CMRA 到 3 毫升 Krebs Hess 缓冲液中。用 Krebs Hess 缓冲液冲洗细胞两次，然后将上样溶液插入培养瓶中。上样溶液分别包含大约 7 微摩尔 C-M-F-D-A 或 CMRA。
在受控气氛中孵育细胞 30 分钟。在第一次孵育期间，区域自由穿过细胞膜进入胞质溶胶，在那里它们被转化为膜 IMP 通透性反应产物。第一次孵育后，冲洗细胞，然后用培养基再孵育 2 小时。
使用在采集软件中配备制冷型 CCD 相机的荧光显微镜观察细胞。将激发波长设置为 548 纳米，并为加载 C-M-F-D-A 的细胞选择合适的带通滤光片威胁荧光图像。将激发波长设置为 492 纳米，并为绿色荧光图像胰蛋白酶眼选择带通滤光片，并对两个培养瓶中的细胞进行计数，并将红色和绿色细胞以一一的比例混合在一起，将细胞浓度调整为每毫升 500 万个细胞。
在每个孔的中间滴入 20 μL 细胞悬液。在 24 多孔板中，在受控气氛中孵育细胞 20 分钟，使细胞以单层形式略微附着在孔表面，并在它们之间建立细胞接触。将带有细胞的多孔放在显微镜载物台上。
将电极放置在孔底部并将它们连接到脉冲发生器为了实现最佳电熔并保持细胞活力，应使用适当的电脉冲参数。这些参数取决于细胞系，应在初步实验中确定。取出培养基，用 1 毫升 ISO omu 磷酸钾缓冲液和 350 μL hypos Miller 磷酸钾缓冲液洗涤细胞，以诱导细胞肿胀。
在施加电脉冲之前，将细胞置于高渗缓冲液中 2 分钟。当电池接近其最大体积时，应施加电脉冲。那是在他们开始监管量之前。
在我们的实验中减少。应用了 1 赫兹的 8 个矩形脉冲序列，持续时间为 100 微秒。脉冲输送后。
10 分钟后，让细胞保持 10 分钟不受干扰。通过面部对比和荧光显微镜测定扩散产率。E 在五个随机选择的视野中采集三张图像、面部对比度、红色和绿色荧光。
在每个图像中，从图像 J 软件中的每个图像三元组创建三个通道图像，以提高图像的视觉质量，预处理步骤可以应用于原始图像、背景、减法和对比度增强，使用默认参数集。最后，使用 RGB 到灰度图像 J 插件合成三通道图像。在这样的图像中，可以看到静止的细胞质和细胞膜。
因此，在三通道图像中可以很容易地确定很少的细胞，计数所有三种类型的细胞，红色、绿色和双荧光。通过将双荧光细胞的数量除以每个图像中所有细胞的数量来确定双荧光细胞的百分比。然后将融合产量定义为双荧光细胞的百分比乘以 2。
由于当相同颜色的单元格查看时，未检测到一半的视图单元格。
概述
本视频演示了使用改良的粘附方法结合电穿孔的体外高效电融合细胞的过程。该过程包括通过荧光显微镜检测融合的细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞融合技术
- 电穿孔方法
- 荧光显微镜应用
背景
- 电融合是一种应用电脉冲来促进细胞融合的技术。
- 该方法可以提高创建杂交细胞的效率。
- 荧光显微镜允许可视化融合的细胞。
- 理解细胞融合对于各种生物学应用至关重要。
研究目的
- 展示一种可靠的细胞电融合方法。
- 可视化并量化细胞融合的效率。
- 提供可以在其他实验室复制的协议。
使用的方法
- 培养并准备小鼠黑色素瘤细胞以进行融合。
- 在融合前使用荧光染料标记细胞。
- 施加电脉冲以诱导细胞融合。
- 使用荧光显微镜分析融合结果。
主要结果
- 通过荧光指示成功实现了细胞融合。
- 计算双重荧光细胞的百分比以确定融合产率。
- 确定了细胞活力的最佳电脉冲参数。
- 通过图像处理技术提高了图像的视觉质量。
结论
- 改良的粘附方法对细胞电融合有效。
- 荧光显微镜是评估融合效率的有价值工具。
- 该协议可以适用于研究中的各种细胞类型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
