Name: 荧光显微镜下细胞电融合的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 学习细胞电融合技术，通过改良贴壁法与电穿孔技术实现体外细胞融合，并利用荧光显微镜检测融合效率。该方法适用于小鼠黑色素瘤细胞，为细胞生物学研究提供可靠的实验方案。

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本工作由斯洛文尼亚研究署（项目 J2-9764 和计划 P2-0249）资助。本视频是斯洛文尼亚卢布尔雅那大学电气工程学院主办的“电穿孔技术与治疗”科学研讨会及研究生课程的补充材料。

一、使用细胞示踪剂 CMFDA 和 CMRA 负载细胞
<ol>
 <li>实验使用预先培养的小鼠黑色素瘤细胞系（B16-F1）细胞进行。将细胞分别在两个25 cm2的培养瓶（TPP, ZDA）中，用添加了10%胎牛血清、0.15 mg/ml L-谷氨酰胺、16 mg/ml庆大霉素（均来自Sigma-Aldrich，德国）、200单位/ml结晶青霉素（Pliva，克罗地亚）的DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）中培养至70–80%汇合度，并在37°C、5% CO2条件下孵育。</li>
 <li>通过向原装Invitrogen小瓶中的50 μg染料分别加入10.76 μl和9 μl二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，德国），配制两种10 mM的细胞示踪剂（Cell trackers）储备液（Green CMFDA和Orange CMRA）。储备液可在4°C冰箱中保存数月。实验开始前，将溶液加热至DMSO晶体完全溶解。</li>
 <li>配制无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液（130 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、11.7 mM D-葡萄糖、1.3 mM CaCl2、10 mM HEPES，pH 7.4）。在两个15 ml离心管中，分别将2.1 μl的每种储备液（10 mM CMFDA或CMRA）与3 ml无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液混合，得到含有约7 μM CMFDA（或CMRA）的“负载溶液”。</li>
 <li>用无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液将细胞冲洗两次，然后将负载溶液加入培养瓶中。在37°C、5% CO2条件下孵育30分钟。在第一次孵育期间，试剂可自由穿过细胞膜；但一旦进入细胞内部，试剂即转化为不能透过细胞膜的荧光反应产物。</li>
 <li>第一次孵育结束后，用培养基冲洗细胞，并在37°C、5% CO2条件下继续孵育2小时。</li>
 <li>将两个培养瓶中的细胞（分别负载CMFDA和CMRA）进行胰酶消化，并在50 ml离心管（TPP, ZDA）中以1:1的比例混合红绿标记细胞。通过加入DMEM培养基稀释或离心浓缩，调节细胞浓度至5 × 106 个细胞/ml。在24孔板（TPP, ZDA）的每个孔中加入20 μl细胞悬液。在37°C、5% CO2条件下孵育20分钟，使细胞轻微贴附于孔板表面并形成细胞间接触。</li>
</ol>
二、电融合
<ol>
 <li>配制等渗磷酸钾缓冲液（10 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 250 mM 蔗糖）和低渗磷酸钾缓冲液（10 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 75 mM 蔗糖）。</li>
 <li>将含细胞的多孔板置于显微镜载物台上，将电极放置于孔底部，并连接至脉冲发生器。</li>
 <li>用1 ml等渗磷酸钾缓冲液洗涤细胞，随后加入350 μl低渗磷酸钾缓冲液以诱导细胞肿胀。缓冲液应覆盖电极。</li>
 <li>在施加电脉冲前，将细胞置于低渗缓冲液中静置2分钟。在此期间，由于细胞内外渗透压失衡，水分子进入细胞，导致细胞体积增大。应在细胞接近最大体积但尚未启动调节性体积减小前施加电脉冲。</li>
 <li>为实现最佳电融合效果并维持细胞活力，应使用最优的电脉冲参数。这些参数取决于所用的细胞系[1]。本实验中，使用电穿孔装置（本例为意大利IGEA公司Cliniporator）对每个样品施加8个矩形脉冲（每个脉冲持续100 μs，频率1 Hz）。脉冲通过两根平行的Pt/Ir金属丝电极传递，电极直径为0.8 mm，间距为5 mm，在每个孔中形成约1200 V/cm的电场强度（对照孔除外）。</li>
 <li>脉冲施加后，静置细胞10分钟。通过荧光显微镜和相差显微镜检测融合率。</li>
</ol>
III. 图像采集与融合率的测定
<ol>
 <li>使用配备物镜（×20）和冷却CCD相机（VisiCam 1280，Visitron，德国）的荧光显微镜（本实验中使用Zeiss AxioVert 200，Zeiss，德国）观察细胞。图像在MetaMorph 7.1.1软件（Molecular Devices，美国）中采集，但也可使用其他类似的图像采集软件。CMFDA使用单色器（Polychrome IV，Visitron，德国）在492 nm激发，CMRA在548 nm激发。CMFDA和CMRA的荧光信号通过两个发射滤光片采集，一个中心波长为535 nm（HQ535/30m，用于CMFDA），另一个中心波长为605 nm（D605/55m，用于CMRA，均来自Chroma，美国）。使用二向色镜（Q515LP）可避免通道间的串扰。</li>
 <li>在每个孔中随机选择五个视野，分别采集三幅图像（相差、红色和绿色荧光）。从每组三幅图像中生成三通道图像。在此类图像中，可同时观察到荧光标记的细胞质和细胞膜，因此可轻松识别融合细胞[图1]。</li>
 <li>在每幅三通道图像中计数所有三种类型的细胞（仅红色荧光、仅绿色荧光以及双荧光标记的细胞）。通过将双荧光细胞数量除以每幅图像中总细胞数量，计算双荧光细胞所占百分比。融合效率定义为双荧光细胞百分比乘以2，因为当同色细胞发生融合时，有一半的融合细胞无法被检测到。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="酵母细胞显微图像；荧光标记显示细胞内红色和绿色蛋白。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. B16F1 细胞电融合后的三通道显微图像：相差图像、CMRA 荧光（激发波长 548 nm）和 CMFDA 荧光（激发波长 492 nm），物镜放大倍数 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

细胞膜非特异性融合的能力（例如通过外加电场实现）在生物技术、医学以及生物学研究中具有重要意义。这种非特异性融合能够生产出极具价值的杂交细胞及其产物（如单克隆抗体），并有助于揭示融合的基本机制[2]。电融合是一种潜在的高效方法，因为它可以根据不同类型细胞的特点进行适当调整。当紧密接触的细胞受到高压电脉冲作用而进入融合活性状态（即易于发生融合的状态）时，即可实现电融合。电融合的效率取决于多种参数，这些参数影响电融合过程的两个阶段。电融合过程的第一阶段是实现细胞间的紧密物理接触，这一目标可通过多种方法实现[3-8]。黏附法（将细胞培养至汇合状态）可有效利用细胞间自发形成的广泛接触区域；然而，该方法会产生体积巨大且含多个细胞核的融合细胞。我们采用的是改良的黏附法，由此获得的融合细胞体积较小（含2至5个细胞核），更有可能存活并增殖（图1）。实验中采用的渗透处理可引起细胞渗透性肿胀，也有利于细胞间的接触[9]。电融合过程的第二阶段是使细胞膜达到融合活性状态。融合活性状态与细胞膜的电穿孔状态高度相关（即细胞膜非特异性地对正常情况下无法通过完整膜的分子通透），并且受相同电脉冲参数（幅度、持续时间、次数和频率）的调控[10]。不同细胞实现最佳电穿孔[1]和电融合所需的电学参数各不相同，取决于细胞大小及其生物学特性。因此，针对用作融合伙伴的不同细胞系，必须优化相应的电学参数以实现有效融合。

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>胞质荧光染料</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>胞质荧光染料</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium）</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>试剂</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>试剂</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>试剂</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>电脉冲发生器</td><td>工具</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>多孔板</td><td>工具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>工具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>工具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>工具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>电极</td><td>工具</td><td>定制</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

荧光显微镜下观察细胞电融合

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

细胞电融合是一种安全、非病毒性且非化学性的方法，可用于制备用于人类治疗的杂交细胞。电融合涉及对紧密接触的细胞施加短暂的高电压电脉冲。施加短暂的高电压电脉冲会导致细胞质膜的不稳定。不稳定的膜对不同分子具有更高的通透性，并且容易与任何邻近的不稳定膜发生融合。因此，电融合是一种实现高度不同细胞非特异性融合的便捷方法in vitro为了实现细胞融合，细胞膜需在电场作用下发生去稳定化，并紧密接触，从而使其脂质双分子层相互合并，进而实现细胞质的融合。在本视频中，我们展示了高效的细胞电融合方法in vitro通过改良的贴壁法进行。在此方法中，细胞仅轻微贴附于孔板表面，以便更换培养基，同时细胞仍保持其球形形态。细胞融合的可视化通过预先用不同的荧光细胞示踪染料标记细胞的细胞质来实现；其中一半细胞用橙色CMRA标记，另一半细胞用绿色CMFDA标记。融合率的计算方式为双荧光细胞数量除以总细胞数量再乘以2。

在本视频中，我们展示了高效的细胞电融合方法 体外 通过使用电穿孔的改良黏附法，随后借助荧光显微镜观察融合细胞的荧光信号实现检测。

细胞电融合是一种安全、非病毒性且非化学性的方法，可用于制备用于人类治疗的杂交细胞。电融合过程包括……

电融合技术涉及对紧密接触的细胞施加短暂的高电压电脉冲。在本视频中，我们通过改良的贴壁法展示了体外细胞电融合的操作过程。实验以小鼠黑色素瘤细胞BF one为材料进行。进行实验时，请按照以下步骤操作。将细胞分别接种于两个独立的培养瓶中，培养至80%融合度。随后，分别向其中加入2.1 µL的每种储备溶液。在离心管中，将10毫摩尔的C-M-F-D-A或CMRA分别加入3毫升克雷布斯-赫斯缓冲液中。用克雷布斯-赫斯缓冲液冲洗细胞两次，然后将负载溶液加入培养瓶中。负载溶液分别含有约7微摩尔的C-M-F-D-A或CMRA。在受控环境中孵育细胞30分钟。在第一次孵育期间，染料可自由穿过细胞膜进入细胞质，并在其中转化为对细胞膜具有通透性的反应产物。第一次孵育结束后，洗涤细胞，然后用培养基再次孵育细胞2小时。使用配备有冷却CCD相机的荧光显微镜，并通过采集软件进行观察。对于负载CMRA的细胞，将激发波长设置为548纳米，并选择适当的带通滤光片以获取红色荧光图像；对于负载C-M-F-D-A的细胞，将激发波长设置为492纳米，并选择适合的带通滤光片以获取绿色荧光图像。分别对两个培养瓶中的细胞进行计数，然后将红色和绿色荧光标记的细胞按1:1的比例混合，并调整细胞浓度至每毫升500万个细胞。在每个孔的中央加入20微升细胞悬液。将细胞置于24孔多孔板中，在控制气氛下孵育20分钟，使细胞轻微贴附于孔表面形成单层，并建立细胞间的相互接触。随后将含细胞的多孔板放置于显微镜载物台上。将电极置于孔板底部，并将其连接至脉冲发生器。为实现最佳电融合效果并维持细胞活性，应采用合适的电脉冲参数。这些参数取决于细胞系，需通过预实验确定。移除培养基，并用1毫升ISO omu磷酸钾缓冲液洗涤细胞，随后加入350微升低渗Miller磷酸钾缓冲液以诱导细胞膨胀。将细胞置于高渗缓冲液中两分钟后施加电脉冲。应在细胞接近其最大体积时施加电脉冲，即在细胞启动调节性体积减小之前。我们实验中的减少。施加一串由八个持续时间为100微秒的矩形脉冲组成的脉冲序列，频率为1赫兹。脉冲输送后。10分钟后，再静置细胞10分钟。通过相差显微镜和荧光显微镜测定扩散效率。在五个随机选择的视野中，各采集三张图像，分别为相差、红色荧光和绿色荧光图像。在每张图像中，将在 ImageJ 软件中对每个图像三联体创建三个通道图像，以提高图像的视觉质量；预处理步骤可应用于原始图像，包括背景减除和使用默认参数集进行对比度增强。最后，使用 RGB 转灰度 ImageJ 插件合成三通道图像。在此类图像中，可同时观察到静息状态的细胞质和细胞膜。因此，在三通道图像中，可轻松识别并计数三种类型的细胞：红色荧光细胞、绿色荧光细胞以及双荧光细胞。通过将每幅图像中双荧光细胞的数量除以该图像中所有细胞的总数，计算双荧光细胞的百分比。融合效率则定义为双荧光细胞百分比乘以2。当相同颜色的视图细胞重叠时，有一半的视图细胞无法被检测到。

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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