纯化荧光蛋白的光转化及活细胞中双探针光学标记

以下实验的总体目标是利用荧光蛋白M orange two和ron作为双探针光学标记，选择性地标记四个独立的细胞群体或细胞区室。该方法首先用低强度488纳米激发光照射细胞，使所有绿色荧光蛋白的荧光信号失活；第二步，用高强度488纳米激发光照射细胞，使M orange荧光发生光转化，转变为红色荧光。

接下来，细胞暴露于800纳米的双光子激发下，以开启dral荧光。结果再次表明，基于M Orange 2与drawn ppa的双探针光学标记，可实现四种不同组合的细胞标记。该方法相较于现有的亚细胞分级分离等实验的主要优势在于，其可在活细胞中进行。

该实验流程有助于解答β细胞生物学中的关键问题，例如为何仅有少量胰岛素囊泡被分泌。尽管该流程可用于研究β细胞功能，也可应用于其他系统。例如，可用于活体中癌细胞的示踪。一种荧光蛋白液滴样本由八水乳液构成，其中荧光蛋白位于水相中。

该乳液被夹在显微镜载玻片和一块22毫米见方的盖玻片之间，用于显微镜观察。在本实验开始前，必须将显微镜载玻片和盖玻片清洗干净，并涂覆疏水剂。通过用丙酮清洗五分钟来清洁玻璃器皿。

清洗后，将玻璃器皿静置晾干。接着，配制2%的甲基三甲氧基硅烷丙酮溶液，并将玻璃器皿浸入该溶液中涂层2分钟。涂层完成后，将玻璃器皿从溶液中取出，静置使其干燥。

然后用喷瓶中的70%乙醇冲洗玻璃器皿。冲洗后，让玻璃器皿再次自然晾干，并去除残留液体。使用加压空气干燥后，包被的玻璃器皿可保存至少一个月。

玻璃器皿准备就绪后，获取先前已从大肠杆菌中纯化并带有组氨酸标签的荧光蛋白。测定纯化蛋白的吸收光谱。用 pH 为 8、含 0.1% 牛血清白蛋白的 Tris 缓冲盐溶液配制储备稀释液，使其光密度值约为 0.1。

此外，在一个15毫升的锥形管中，准备10毫升的1:1混合液，包含正辛醇和Tris缓冲盐溶液，并剧烈混合。混合后，静置混合物直至相分离完全。上层相为正辛醇，用于制备乳液，用移液器将45微升正辛醇和5微升荧光蛋白加入一个epi管中。

轻轻敲击试管数次以开始乳液的形成，然后将试管置于超声波清洗仪中处理30秒。同时，在超声处理期间准备好已包被的显微镜载玻片和盖玻片。乳液应完全呈浑浊状。

立即用移液器从管中乳液的中部吸取四微升，滴加到经包被的显微镜载玻片上，并用经包被的盖玻片覆盖。乳液应在载玻片与盖玻片之间均匀铺展。数分钟内，样品即可保持稳定。

以下步骤是在共聚焦激光扫描显微镜上建立荧光蛋白光转化实验的一般策略。该步骤既可用于纯化的蛋白质，也可用于活细胞。本实验以含有纯化 m orange two 蛋白的液滴样品作为光转化实验的通用起始材料。

按如下方式设置共聚焦激光扫描显微镜：使用40倍、数值孔径1.3的油浸物镜，图像尺寸设为512×512像素。将像素驻留时间设为6微秒，扫描缩放倍数设为4，并增大针孔尺寸，使Z轴分辨率匹配为3微米。

为初始荧光和光转化后的荧光设置两个检测通道，同时设置一个光转化通道。使用561纳米激发光观察橙色荧光信号，并收集570至630纳米之间的荧光。使用633纳米激发光检测光转化后的红色荧光信号，并收集640至700纳米之间的荧光。

对于光转换通道，选择488纳米激光线，并收集490至540纳米之间的荧光信号。成像。光转换通道并非绝对必要，但可能有助于实验。开始实验时，使用检测通道通过连续扫描对初始荧光进行成像，以调节激光功率和检测器增益，获得最佳图像质量。

然后激活光转换通道并选择低激光功率。开始成像时间序列，并逐步增加光转换激光强度，直至观察到初始荧光出现明显漂白。持续扫描，直到初始荧光强度大约漂白至75%。

接下来，关闭光转换通道，并激活用于检测光转换后荧光的检测通道。在低激光功率下以高探测器增益开始成像，然后逐步提高激光功率，直至检测到光转换后的荧光信号。

检测到信号后，调整激光功率以及检测增益以获得最佳图像质量。最后，优化用于光转化的激光功率及其照射时间。增加激光功率将加快光转化速率。

然而，过高的激光功率会导致蛋白质发生光漂白。在确定最佳的光转化条件、激光功率和照射时间后，可利用这些参数来配置标准的光漂白模块或光漂白后荧光恢复模块。由于M orange two具有红移光谱特性，此后将不再需要光转化通道。

可将该方法与绿色光可切换荧光蛋白 drawn PU 联用，实现双探针光学标记。开始双探针光学标记时，先在玻璃底 MatTek 培养皿中培养 HeLa 细胞，并在成像前 24 小时使用标准的 LIPECTOMY 2000 转染法将编码荧光蛋白的质粒转染至细胞中。

将活细胞置于共聚焦激光扫描显微镜上，并按照之前所述设置显微镜以进行M orange双光转换。然后配置显微镜以实现DPA光切换。DPA由488纳米光激发，其荧光可使用M orange双光转换通道进行成像。

务必尽量降低用于成像 MPA 的激光功率，因为过高的激光功率会导致 mpa 失活。添加一个用于 MPA 光激活的通道，使用 800 纳米双光子激发，随后确定成像、光激活和 OFA 荧光光失活所需的激光功率。

该实验步骤中最困难的部分之一是在不光转化 M orange 的情况下使 RPA 失活，因为这两个过程发生在相同的波长下。为防止此情况发生，仔细优化光转化条件至关重要。

激光功率与持续时间需谨慎设置，以实现M orange two的光转化。在使用488纳米光激发以失活PU时，需避免发生显著的M orange two光转化。一旦确定了M orange two光转化和DPA光开关的参数，应使用较低的激光功率。

可实现双探针光学标记。首先，使用低功率488纳米激发光使整个视野中的DPA荧光失活；然后选择感兴趣区域，并使用高功率488纳米激发光将mOrange2进行转化。

最后，选择一个感兴趣区域，并使用800纳米双光子激发激活DPA荧光。荧光蛋白液滴样品非常适合用于建立共聚焦显微镜的光转化应用。当液滴样品制备得当时，液滴呈现高度均一的形态。

然而，当制备样品时未在载玻片上涂覆盖玻片，所制备样品中的液滴往往会受到其中一个玻璃表面的挤压而变形。在缺乏0.1% BSA的情况下，荧光蛋白倾向于在八烷与水的界面处聚集。荧光光转化形成的光环效果在很大程度上依赖于激光功率和照射时间。

激光功率过高或曝光时间过长会导致光漂白，从而引起光转化后红色荧光的减弱。M orange two 与 PHO 独特的光谱特性允许在光转化前进行双探针光学标记；表达 M orange two、组蛋白 H two B 和 DPA mito 的细胞在细胞核中显示橙色荧光，在线粒体中显示绿色荧光。当使用低功率 488 纳米激发光关闭所有荧光时，M orange 的光转化程度最小。

两个M橙色荧光蛋白可通过高强度488纳米激发光转化为红色。一旦M橙色荧光蛋白完成光转化，即可使用800纳米双光子激发重新开启囊泡荧光。通过双探针光学标记技术，细胞可被四种不同的方式标记。

利用该技术，可特异性地标记四种不同的细胞群体。如您所见，该实验操作中最困难的环节之一是在不发生mOrange光转化的情况下使MPA失活。一旦掌握此项技术，便可利用该系统开展进一步的实验，例如，在胰腺β细胞中同时追踪多个细胞群体。

以上就是全部内容。希望本次讲解对您有所帮助，祝您的实验顺利成功。