人类精子中Ca²⁺信号成像技术

本实验的总体目标是获取用荧光钙离子探针标记的固定人精子的图像序列。首先，通过将活动精子游入孵育培养基中，从精浆中分离出活动精子。经获能处理后，细胞用荧光钙离子指示剂标记，然后转移至可熔融成像室，并将成像室置于倒置荧光显微镜上进行观察。

通过时间序列图像记录钙离子浓度的变化，并据此分析单个细胞的响应。大家好，我是来自英国伯明翰大学生命科学学院 Steven J. Public Cova 博士实验室的 Edwin Andres Morales Garcia。我是 Katherine Nash，同样来自 Public Overlap 课题组。

我是来自公共重叠组织的 Jennifer Morris。今天我们将展示一种用于成像单个人类精子细胞内钙离子反应的实验方法。在我们的实验室中，利用来自卵子和女性生殖道的刺激物来研究精子活动的调控机制时，会使用这一实验流程。

接下来我们开始。从精液采集的瞬间起，将精液样本在37摄氏度下保存，时间不超过30分钟，以从精浆中分离运动细胞。将1毫升添加了0.3% BSA的L'S平衡盐溶液（简称S-E-B-S-S）加入一系列5毫升聚苯乙烯圆底试管中。在每支试管中的S-E-B-S-S溶液下轻轻铺加0.3毫升精液，并将管盖松松盖上。

将试管在37摄氏度、6%二氧化碳条件下以45度角孵育1小时。为使运动细胞游入S-E-B-S-S中，轻柔地用移液器吸取各管上层0.7毫升溶液，并将所有试管中的溶液转移至一个洁净的15毫升聚苯乙烯离心管中。轻轻振荡混匀，然后在新的血细胞计数板中对经甲醛固定的不动细胞进行计数。

将精子浓度调整为每毫升600万个细胞，使用S-E-B-S-S培养基，并将精子分装至5毫升聚苯乙烯圆底试管中，每管200微升。管盖松紧适度。若需研究获能精子的反应，将试管置于37摄氏度、6%二氧化碳环境中孵育5至6小时，以完成获能过程。取10微升10%多聚赖氨酸，以数个小液滴的形式滴加至22乘以50毫米的载玻片中心。

将盖玻片编号为1，并使其完全干燥。使用真空润滑脂将处理面朝上的盖玻片固定于可熔成像室上，以达到实验目的。

每次成像实验中，选取一管已获能的细胞，加入1.2 µL浓度为2.5 mg/mL的钙依赖性器官绿（Calcium dependent organ green），该染料溶于DMSO中，终浓度为10 µmol。将试管置于37 °C、6% CO₂条件下孵育40分钟。

使用带有 P200 吸头的 200 微升移液器，将管中的溶液完全吸出。通过轻轻将液体注入进液口来填充计数室。倾斜计数室，使气泡从出液口逸出。

将整个腔室放入培养箱中，在37摄氏度、6%二氧化碳条件下继续孵育20分钟，以使精子附着于多聚D-赖氨酸。将腔室安装至倒置荧光显微镜上，并连接灌流装置。

将制备样本置于避光环境中至少10分钟，以使灌流液充分清除。在40倍或60倍相差显微镜下观察，选择细胞间距足够、可单独评估每颗细胞荧光信号的视野。细胞应充分贴壁，但最好仍表现出明显的伪足活动。

将显微镜切换至绿色荧光通道。保持曝光时间处于获得清晰荧光图像所需的最低水平，以在 IQ 软件中减少光漂白。

启动时间序列图像采集。以0.1赫兹的频率采集图像，并使用软件控制的快门来限制光照。首先记录三到五分钟的对照期，然后通过更换灌流系统入口处的灌流液来改变灌流液中的钙离子浓度并施加药物。

请注意每种刺激物添加到记录头的时间，并按照本方案文字部分所述，计算其到达腔室的时间。为离线分析图像，可使用绘图工具在每个细胞或细胞的特定区域（此处为精子后头部，因为储存的钙在此区域被动员）周围勾勒出感兴趣区域（ROI）。使用滑动条滚动查看图像序列。

识别并剔除未能完全保留在 ROI 内、与其他细胞重叠，或表现出荧光强度先大幅快速上升随后急剧下降（此特征为细胞死亡）的细胞。使用分析功能为每个 ROI 生成时间-荧光强度曲线。随后可将数据导出并在电子表格中进行分析。

这些图像来自使用 3 µM 孕酮刺激期间获得的系列图像。下方一行已用伪彩着色。为了更清楚地说明相对强度的变化，此处为孕酮进入腔室的位置。

这些结果以延时视频动画形式展示。注意荧光强度的快速升高，随后是缓慢增加，表明细胞内钙水平发生相应变化。这些数据来自三个细胞后部头部的平均强度，在此进行量化。

在箭头所示时间点加入 3 µM 孕酮。虚线表示对照组平均荧光水平。今天，我们向您展示了如何分离高质量的细胞，用钙离子敏感性染料进行负载，并监测单个细胞对刺激的反应。

进行此操作时，重要的是要记住使用最佳的细胞群体，同时尽量减少对细胞的光照以避免光损伤，并选择最适合您所观察反应的染料。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。