Name: 技术成像钙 2 +信号在人类精子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解如何使用延时荧光显微镜技术成像人类精子中的钙离子信号。该方法通过钙敏感荧光染料标记活动精子，并将其固定于可灌注成像室中，以记录单个精子细胞对刺激的钙响应动态变化。

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本工作由惠康基金会、医学研究理事会、皇家学会、伯明翰科学城以及不育研究信托基金资助。我们感谢Cairn Research在构建和整合成像系统方面提供的专业协助。

精液分析正常的健康生育男性提供的精子，通常按以下方法进行成像前准备。
<ol>
<li> 精液样本在37°C下保存不超过30分钟。通过游走法将细胞从精浆中分离至添加补充物的Earle's平衡盐溶液（sEBSS；mM：1.8 CaCl2·2H2O，5.37 KCl，0.81 MgSO4·7H2O，26.2 NaHCO3，1.0 NaH2PO4·2H2O，116.4 NaCl，55.6 D-葡萄糖，2.73 丙酮酸钠，41.8 乳酸钠）中，该溶液添加了0.3%去脂/无脂肪酸的炭吸附Fraction V BSA（BSA的质量对精子获能的成功至关重要）。将1 ml sEBSS移液至一系列5 ml离心管中，每管轻柔地在其下层加入0.3 ml精液。在37°C、6% CO2条件下孵育1小时后，小心吸取每管上层0.7 ml液体并合并。取10 μl精子悬液与90 μl 1%（v/v）甲醛混合以固定细胞，随后在Neubauer计数板中计数精子。然后用sEBSS将悬液中的细胞密度调整至600万个细胞/ml。</li>
<li> 将样本分装至松盖离心管中，每管200 μl，并在37°C、6% CO2条件下孵育5–6小时，以完成精子获能。</li>
<li> 盖玻片（22×50 mm）预先用聚-D-赖氨酸处理。将10 μl聚-D-赖氨酸溶液（10% w/v）以数个小液滴形式滴加至盖玻片中央，随后让其自然风干。此过程可在加热台上进行，必须完全干燥。使用真空脂将盖玻片固定于一个封闭式、特制的、可灌流的聚碳酸酯成像室（尺寸为35 mm × 20 mm × 5 mm，容量约180 μl），类似于Warner RC20型灌流室。当在倒置显微镜下观察细胞时，聚-D-赖氨酸包被的盖玻片构成成像室的底部，而一个直径为12 mm的圆形盖玻片则作为成像室的顶部，以允许光线透过。</li>
<li> 使用Oregon Green BAPTA1-AM（OGB）或Calcium Green 1-AM对细胞进行标记。OGB通过溶于DMSO制备。在DMSO中加入Pluronic酸F127（一种去垢剂）以防止染料“聚集”。该溶液可于实验前在实验室中现配（100 mg Pluronic溶于0.5 ml DMSO），也可购买预混制剂。将20 μl该溶液加入50 μg OGB（2.5 mg/ml）的分装管中。该试剂管可冷冻保存，使用时再解冻。</li>
<li> 精子获能完成后（在sEBSS中37°C、6% CO2条件下孵育5–6小时），选取一管用于成像，加入1.2 μl OGB溶液，终浓度为10 μM。继续孵育40分钟，随后用P1000（蓝色）移液枪头将细胞悬液轻柔注入成像室的进液口。将成像室放入孵箱中，聚-D-赖氨酸包被面朝下，孵育20分钟。细胞倾向于沿成像室表面游动，并附着于聚-D-赖氨酸包被区域。</li>
<li> 将成像室安装至显微镜载物台上，连接灌流装置，并以约0.5 ml/min的速度进行灌流。滚轴泵将生理盐水送入成像室，出液口的溢出液由带捕集装置的抽吸泵移除。在暗处静置至少10分钟，通过灌流去除未贴壁的细胞和细胞外染料。温度稳定性至关重要，因为微小的温度波动不仅可能影响细胞内Ca2+稳态，还可能影响染料的Kd值。实验通常在25°C下进行，通过将暗室温度维持在该水平实现。我们发现，将房间温度控制在所需水平，比使用温控载物台或在盐水进液管路上安装恒温加热器，能提供更佳的温度和聚焦稳定性。</li>
<li> 在相差显微镜（40倍或60倍油镜）下观察细胞，并选择成像区域。优先选择靠近进液口的聚-D-赖氨酸包被区域，此处盐水流动呈层流且稳定。同时应选择细胞密度适中的区域（密度过高会因邻近细胞信号干扰而影响数据质量和完整性），且细胞附着良好但鞭毛活动仍可辨识的区域。保存一张相差图像。随后切换至荧光模式（激发波长480 nm，发射波长540 nm），并将曝光时间缩短至获得清晰荧光图像所需的最低值（通常为50–200 ms）。</li>
<li> 通过启动时间序列图像采集软件（IQ）开始实验。通常以0.1 Hz频率采集图像，并仅在图像采集期间通过软件控制的快门开启照明。虽然可使用更高的采集速率，但必须考虑光漂白及光损伤导致伪影的问题（见讨论部分）。IQ（及其他大多数采集软件平台）可在实验过程中实时绘制荧光强度变化曲线。</li>
<li> 在3–5分钟的对照期后，通过更换灌流储液瓶中的生理盐水来调节盐水成分（如[Ca2+]o）或施加药物。记录每次刺激物添加的时间，以便计算其到达成像室的时间，对于本实验中描述的缓慢反应（采样频率0.1 Hz）已具备足够准确性。若需研究更快速的反应，可通过Warner RC20灌流室所配备的第二个进液口直接将刺激物加入盐水流动路径，从而获得更高时间精度。</li>
<li> 使用IQ软件离线分析图像。围绕每个细胞（或细胞部分）划定感兴趣区域（ROIs），同时选择一个无细胞区域（用于软件自动背景扣除）。随后检查图像序列，剔除在实验过程中死亡或发生顶体反应的细胞（顶体反应表现为荧光迅速大幅增强，随后胞质染料丢失），以及因移动明显而在时间序列分析中产生伪影的细胞。</li>
<li> 对每个ROI获取时间-荧光强度曲线，然后在Excel中离线分析这些数据。首先将荧光强度归一化为对照期的平均值，使用公式 R = [(F - Frest) / Frest] × 100%，其中R表示相对于对照期的荧光变化百分比，F为时间t时的荧光强度，Frest为对照期内至少30次F值测定的平均值。</li>
</ol>
代表性结果
图1显示了一系列细胞经3 μM孕酮刺激的实验图像。上排图像及视频1以灰度显示荧光图像，下方图像（及视频2）则以伪彩（Image J中的“16_colors”查找表）显示相同图像，其中“冷”色调表示荧光强度较低，“暖”色调表示荧光强度较高。实验过程中可使用IQ软件中的查找表实时以伪彩观察细胞，但通常使用灰度图像更有利于判断细胞标记是否良好。前两幅图像分别在开始记录后的0 s和100 s采集。荧光信号应保持稳定，且在顶体后区和精子颈部区域通常最强。孕酮约在175 s时进入成像腔，随后的3rd 和 4th 图像（180 s 和 220 s）显示 [Ca2+]i （荧光）起源于细胞后部头部和颈部区域。后续图像分别在290、360、740、990和1440秒时采集，显示初始[Ca2+]i 瞬时升高及继发的持续性升高。图2展示了电子表格分析结果，将每个ROI的原始荧光值转换为标准化荧光值（与对照期相比的荧光变化百分比）。图3显示了3个细胞在3 μM孕酮刺激下呈现“典型”反应的时间归一化荧光曲线图。
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="荧光显微镜延时序列显示神经元活动的灰度图和伪彩图。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 1"> 图 1. 用黄体酮刺激细胞的示例数据。上排为灰度荧光图像序列，下排为伪彩图像序列。时间点分别为 0、180、220、290、360 和 990 秒。3 μM 黄体酮于 175 秒时进入成像室。第一张图中显示了感兴趣区域（ROIs）。 
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="显示时间与浓度变化趋势的数据分析图表（Excel）" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 2"> 图 2. 在 Excel 中对单细胞荧光数据进行分析。黑色数字为垂直排列的荧光数据时间序列。下方红色数字为使用文中所给公式获得的归一化数据。该图显示了本实验中细胞 64 的归一化荧光-时间曲线，在受到刺激后，荧光信号出现短暂上升，随后为缓慢上升及一系列小幅振荡。 
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="显示瞬态吸收光谱的图表；持续2分钟的光学激发测量。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图3"> 图3. 3个单细胞的荧光-时间轨迹，以相对于对照值的百分比变化表示。在箭头标记的时间点加入3 μM孕酮。虚线表示对照荧光的平均值。

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

若操作成功，该技术可用于记录人类精子中自发性和诱导性 Ca2+ 信号的分布与动力学特征。可从大量细胞（最多达 200 个）中获得反应结果，这一点至关重要，因为人类精子在自发性和刺激诱导的 Ca2+ 信号方面存在较大个体差异。标记的成功率以及记录过程中细胞的存活情况在很大程度上依赖于样本质量。质量较差的样本会导致标记效果不佳、反应微弱，且细胞可能在记录过程中死亡。 人类精子对光损伤非常敏感，因此我们采用最低必要的光照（包括强度和曝光时间），以最大限度地提高细胞存活率，并减少因细胞死亡导致的人工假象。高灵敏度相机（允许使用低强度照明）具有显著优势，因为它能够检测到微弱的荧光信号。背照式电子倍增CCD（EM-CCD）相机尤为适用，尽管价格昂贵。使用LED照明（替代配备激发滤光片的氙灯或汞灯）也有助于提高细胞存活率（Nishigaki 等，2006）。 尽管比率成像具有明显优势，但我们并未使用Fura-2，因为Fura-2需要紫外光激发，且每次测定比率均需采集两幅图像。对于使用单波长可见光染料获得的数据，荧光强度的归一化可在很大程度上补偿不同细胞间染料负载量的差异，但无法校正单个细胞内染料分布的不均一性，这一点必须予以注意。虽然原则上单波长染料可以进行校准，但该技术的准确性较差，因此我们不尝试进行此类校准。 尽管使用 Fura-2（或发射比值染料 indo）获得的比值数据即使未经校准，也能较为真实地反映[Ca2+]i的相对变化，但单波长染料的荧光强度与[Ca2+]i之间的关系远非线性。在饱和曲线最有用的部分，单波长染料的响应通常近似呈对数关系。目前我们使用俄勒冈绿 BAPTA-1（图4），因为它对接近静息水平（50–100 nM）的[Ca2+]i微小变化具有较高敏感性。当[Ca2+]i上升超过1 μM时，荧光变化将低估实际响应，且染料可能达到饱和。在不采用紫外激发的前提下，改进该技术的一种方法是使用如Fluo-3和Fura Red等染料对细胞进行双重负载。这两种染料均可在488 nM处被激发，但其响应特性截然不同。在540 nM和650 nM处同时记录发射光信号，可获得比值，从而为[Ca2+]i的精确监测提供更优方法（Haughland, 2002），该方法也可能适用于精子研究（Nisigaki et al, 2006）。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="荧光发射与钙浓度关系图，比较OGB1和OGB2的响应数据。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图4"> 图4. Oregon Green BAPTA-1 和 Oregon Green BAPTA-2 在游离 [Ca2+]（nM）与峰值波长处荧光发射（约525 nm）之间的关系。OGB1 在静息 [Ca2+] 下产生更强的荧光，但在较低浓度即达到饱和，因此可用范围较小。这些曲线的数据来源于 Molecular Probes 手册（Haughland, 2002）。

<table><tbody><tr><td>低光照相机</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>俄勒冈绿 BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>Image J</td><td>公共领域软件</td></tr><tr><td>LED 照明系统</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

人类精子中ca2+信号成像技术

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

荧光显微镜观察加载了荧光 Ca2+-sensitive 荧光染料用于测量 Ca²⁺ 的空间和时间动态变化2+活细胞中的信号传导。在这里，我们描述了在我们的实验室中用于将人精子悬浮液负载Ca2+-reporting染料，并在生理刺激期间测量荧光信号。运动细胞通过直接上泳法分离，并根据实验需要在获能条件下孵育0–24小时。细胞可渗透的AM（乙酰氧基甲基酯）酯形式的Ca2+-reporting染料被加入到一份细胞等分试样中，并给予1小时的孵育时间，使染料进入细胞质。我们使用可见光波长的染料以尽量减少对细胞的光损伤，但这意味着无法进行比率测量记录。本文讨论了该方法的优缺点。在染料孵育期间，将细胞引入成像腔室，并使其贴附于经聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。孵育结束后，通过将腔室连接至灌流装置，去除多余的染料和未贴壁的细胞。腔室持续灌流，刺激物和改良盐溶液随后被加入灌流液储液槽中。实验通过时间序列采集荧光图像进行记录，并在离线状态下进行详细分析，通过手动绘制感兴趣区域完成。数据被标准化为刺激前水平，从而对每个细胞（或细胞的某一部分）生成显示Ca2+以荧光变化百分比的形式获得响应。

通过刺激诱发单个精子的[Ca2+]i信号变化进行评估。将具有运动能力的精子细胞用Ca2+敏感型荧光染料（AM酯法）负载后，固定于可灌流的腔室中。利用时间推移荧光显微镜对细胞成像，并通过灌流介质施加刺激。单个细胞（或特定区域）的反应通过Excel软件进行离线分析。

人类精子中Ca2+信号成像技术

使用加载了荧光性Ca2+敏感染料的细胞进行荧光显微镜观察，用于检测Ca2+信号在空间和时间上的动态特征。

本实验的总体目标是获取用荧光钙离子探针标记的固定人精子的图像序列。首先，通过将活动精子游入孵育培养基中，从精浆中分离出活动精子。经获能处理后，细胞用荧光钙离子指示剂标记，然后转移至可熔融成像室，并将成像室置于倒置荧光显微镜上进行观察。通过时间序列图像记录钙离子浓度的变化，并据此分析单个细胞的响应。大家好，我是来自英国伯明翰大学生命科学学院 Steven J. Public Cova 博士实验室的 Edwin Andres Morales Garcia。我是 Katherine Nash，同样来自 Public Overlap 课题组。我是来自公共重叠组织的 Jennifer Morris。今天我们将展示一种用于成像单个人类精子细胞内钙离子反应的实验方法。在我们的实验室中，利用来自卵子和女性生殖道的刺激物来研究精子活动的调控机制时，会使用这一实验流程。接下来我们开始。从精液采集的瞬间起，将精液样本在37摄氏度下保存，时间不超过30分钟，以从精浆中分离运动细胞。将1毫升添加了0.3% BSA的L'S平衡盐溶液（简称S-E-B-S-S）加入一系列5毫升聚苯乙烯圆底试管中。在每支试管中的S-E-B-S-S溶液下轻轻铺加0.3毫升精液，并将管盖松松盖上。将试管在37摄氏度、6%二氧化碳条件下以45度角孵育1小时。为使运动细胞游入S-E-B-S-S中，轻柔地用移液器吸取各管上层0.7毫升溶液，并将所有试管中的溶液转移至一个洁净的15毫升聚苯乙烯离心管中。轻轻振荡混匀，然后在新的血细胞计数板中对经甲醛固定的不动细胞进行计数。将精子浓度调整为每毫升600万个细胞，使用S-E-B-S-S培养基，并将精子分装至5毫升聚苯乙烯圆底试管中，每管200微升。管盖松紧适度。若需研究获能精子的反应，将试管置于37摄氏度、6%二氧化碳环境中孵育5至6小时，以完成获能过程。取10微升10%多聚赖氨酸，以数个小液滴的形式滴加至22乘以50毫米的载玻片中心。将盖玻片编号为1，并使其完全干燥。使用真空润滑脂将处理面朝上的盖玻片固定于可熔成像室上，以达到实验目的。每次成像实验中，选取一管已获能的细胞，加入1.2 µL浓度为2.5 mg/mL的钙依赖性器官绿（Calcium dependent organ green），该染料溶于DMSO中，终浓度为10 µmol。将试管置于37 °C、6% CO₂条件下孵育40分钟。使用带有 P200 吸头的 200 微升移液器，将管中的溶液完全吸出。通过轻轻将液体注入进液口来填充计数室。倾斜计数室，使气泡从出液口逸出。将整个腔室放入培养箱中，在37摄氏度、6%二氧化碳条件下继续孵育20分钟，以使精子附着于多聚D-赖氨酸。将腔室安装至倒置荧光显微镜上，并连接灌流装置。将制备样本置于避光环境中至少10分钟，以使灌流液充分清除。在40倍或60倍相差显微镜下观察，选择细胞间距足够、可单独评估每颗细胞荧光信号的视野。细胞应充分贴壁，但最好仍表现出明显的伪足活动。将显微镜切换至绿色荧光通道。保持曝光时间处于获得清晰荧光图像所需的最低水平，以在 IQ 软件中减少光漂白。启动时间序列图像采集。以0.1赫兹的频率采集图像，并使用软件控制的快门来限制光照。首先记录三到五分钟的对照期，然后通过更换灌流系统入口处的灌流液来改变灌流液中的钙离子浓度并施加药物。请注意每种刺激物添加到记录头的时间，并按照本方案文字部分所述，计算其到达腔室的时间。为离线分析图像，可使用绘图工具在每个细胞或细胞的特定区域（此处为精子后头部，因为储存的钙在此区域被动员）周围勾勒出感兴趣区域（ROI）。使用滑动条滚动查看图像序列。识别并剔除未能完全保留在 ROI 内、与其他细胞重叠，或表现出荧光强度先大幅快速上升随后急剧下降（此特征为细胞死亡）的细胞。使用分析功能为每个 ROI 生成时间-荧光强度曲线。随后可将数据导出并在电子表格中进行分析。这些图像来自使用 3 µM 孕酮刺激期间获得的系列图像。下方一行已用伪彩着色。为了更清楚地说明相对强度的变化，此处为孕酮进入腔室的位置。这些结果以延时视频动画形式展示。注意荧光强度的快速升高，随后是缓慢增加，表明细胞内钙水平发生相应变化。这些数据来自三个细胞后部头部的平均强度，在此进行量化。在箭头所示时间点加入 3 µM 孕酮。虚线表示对照组平均荧光水平。今天，我们向您展示了如何分离高质量的细胞，用钙离子敏感性染料进行负载，并监测单个细胞对刺激的反应。进行此操作时，重要的是要记住使用最佳的细胞群体，同时尽量减少对细胞的光照以避免光损伤，并选择最适合您所观察反应的染料。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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