Name: 宏基因组库的大型屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: 了解宏基因组库的高通量筛选方法，使用机器人自动化技术将一万个菌落精确接种到尼龙膜上。该方法显著提高了基因组学研究的准确性和效率，适用于微生物群落功能基因筛选。

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1. 杂交实验步骤
一个杂交管可容纳1至2张膜（尺寸为22 cm × 22 cm）。每个杂交管使用50 ml杂交液和0.5 mg DNA探针（终浓度为10 ng/ml）。为获得最佳结果，建议使用凝胶纯化的DNA作为探针。若需扩大探针制备规模，应增加试管数量，而非增加每管中的试剂用量。
探针制备（0.5 mg DNA）：
<ol>
<li>将15 μl交联剂溶液用60 μl水稀释。</li>
<li>用水将DNA稀释至10 ng/μl，总体积为50 μl，置于带螺帽的微量离心管中。</li>
<li>将DNA在沸水中变性5分钟。</li>
<li>迅速转移至冰上，冷却5分钟，短暂离心。</li>
<li>加入50 μl反应缓冲液，轻轻混匀。</li>
<li>加入10 μl标记试剂，轻轻混匀。</li>
<li>加入第1步中稀释好的50 μl交联剂溶液，轻轻混匀；轻轻涡旋并短暂离心。</li>
<li>在37°C孵育30分钟。</li>
<li>置于冰上最多2小时，或加入等体积的100%甘油，于-20°C保存。 注意：使用试剂盒中提供的水。除非另有说明，所有试剂均需置于冰上。</li>
</ol>
膜制备与杂交
<ol>
<li>将50 ml杂交缓冲液和杂交管预热至60°C。</li>
<li>将杂交缓冲液加入杂交管中。将膜卷起后加入杂交管中。（若每管加入两张膜，应先将一张膜完全卷起，再朝相同方向将第二张膜卷在第一张之上。）</li>
<li>在60°C下孵育杂交管至少½小时。（确保膜充分浸透。）</li>
<li>用长吸头从杂交管中转移约1 ml杂交缓冲液至含有标记探针的管中。轻轻涡旋混匀并短暂离心。将混合液重新转移回杂交管。</li>
<li>在60°C下孵育过夜。 注意：操作膜时应使用镊子和手套。轻柔混匀杂交管内容物，因为过度震荡会导致难以消除的泡沫产生。膜应保持湿润状态加入；必要时先用杂交缓冲液或水浸泡，再沥去多余液体后加入。</li>
</ol>
2. 检测步骤
洗涤膜
<ol>
<li>将主洗涤缓冲液预热至 60°C。（可使用微波炉和/或加热板。）</li>
<li>如果一个杂交管中有两张膜，请将其中一张膜转移至一个洁净、预热过的空杂交管中。</li>
<li>用约 50 ml 主洗涤缓冲液短暂冲洗杂交管。</li>
<li>向杂交管中加入约 100 ml 主洗涤缓冲液，在 60°C 下孵育 10&nbsp;分钟。</li>
<li>重复步骤 3 和 4。</li>
<li>将膜转移至洗涤容器中，加入至少 250 ml 的次级洗涤缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。</li>
<li>重复步骤 6。 注意：在信号生成前，膜可在室温下的次级洗涤缓冲液中保存最多 ½ 小时。 </li>
</ol>
信号产生与检测（一张膜的操作步骤）
<ol>
<li>将两片保鲜膜平整地粘在桌面上（一片用于步骤2，另一片用于步骤4）。</li>
<li>通过将膜的角落轻轻接触容器壁，小心吸去膜上多余的缓冲液，并将膜转移至保鲜膜上（样品面朝上）。</li>
<li>在膜上加入6–7 ml ECF试剂，然后将保鲜膜折叠覆盖于膜上。用Kimwipe纸轻轻在保鲜膜表面移动，使ECF试剂均匀分布。孵育5分钟。</li>
<li>吸去膜上多余的ECF试剂，将膜转移至新的保鲜膜上，折叠保鲜膜覆盖膜，并用胶带密封边缘。用铝箔包裹膜。孵育1–2小时。</li>
<li>在扫描仪玻璃板上加入1–2 ml ECF试剂并均匀分布。然后将膜转移至玻璃板上（样品面朝下），并在膜上再加入1–2 ml ECF试剂。覆盖一层保鲜膜，并小心地将所有气泡从膜表面赶出。（可在保鲜膜上放置一块硬板，以确保膜紧贴玻璃板。）</li>
<li>使用富士FLA-5100荧光扫描仪（“单激光单图像”模式），设置如下：激发波长473 nm，检测滤光片LPB（510 nm），分辨率50 μm，信号位深16位，CH1电压400 V。（扫描一张22 cm × 22 cm大小的膜约需15–20分钟。） 可选步骤： </li>
<li>静置2–4小时（或更长时间）。</li>
<li>重复步骤6的扫描操作。</li>
</ol>
3. 剥离与储存步骤（NUF 版本）
<ol>
<li>将膜转移至100%乙醇中，室温下轻轻振荡孵育10分钟。</li>
<li>更换新鲜的100%乙醇，室温孵育过夜。（膜可在乙醇中保存数天。）</li>
<li>用蒸馏水替换乙醇，室温孵育10分钟。</li>
<li>向杂交管中加入100 ml水和5 ml 10% SDS（终浓度为0.5% SDS），轻轻混匀，然后放入膜。</li>
<li>在80°C孵育1小时。</li>
<li>将膜转移至一个洁净的空容器中。</li>
<li>在烧杯中加入500 ml水和5 ml 10% SDS（终浓度为0.1% SDS），放入微波炉加热至剧烈沸腾。</li>
<li>将接近沸腾的0.1% SDS溶液倒在膜上，轻轻振荡数分钟，然后静置冷却至室温。</li>
<li>用至少250 ml无菌的100 mM Tris（pH 8.0）冲洗至少10分钟。</li>
<li>用保鲜膜包裹膜，并用胶带小心封好边缘，于4°C保存。（膜切勿干燥。）</li>
</ol>

剥离步骤尚未经过优化。然而，制造商说明书提供的剥离方法（每次10分钟，用100%乙醇洗涤2次，再在60°C下用0.5% SDS洗涤1次，持续1小时）并不充分。至少需要在100%乙醇中孵育过夜，才能溶解ECF反应产物；在100%乙醇中孵育数天似乎对膜的重新杂交能力没有不良影响。制造商推荐的SDS处理步骤也显得不足。NUF尝试在80°C下用0.5% SDS处理1小时，随后用接近沸腾的0.1% SDS处理一次，获得了成功。Tracy已证明，仅需用接近沸腾的0.1% SDS倾倒冲洗一次即已足够。

实用提示： 
杂交缓冲液、杂交管和初次洗涤缓冲液在使用前必须预热至 60°C，并在整个实验过程中保持该温度。例如，可将缓冲液置于带有浸入式温度计的加热板上；在康宁（Corning）加热板上，将温度调至约 3 档可达到 60°C。

<table><tbody><tr><td>AlkPhos Direct 标记试剂</td><td>试剂盒</td><td>Amersham</td><td>RPN3680</td><td>包含标记试剂、交联剂溶液、反应缓冲液、水、对照 DNA、杂交缓冲液、封闭试剂。杂交缓冲液和封闭试剂储存于室温，其余试剂储存于 2-8&amp;deg;C。</td></tr><tr><td>ECF 底物</td><td>试剂盒</td><td>Amersham</td><td>RPN3685</td><td>包含 ECF 底物、ECF 底物稀释缓冲液。注意：包装内共含 60 ml 试剂；分装为每份 10 ml 置 Falcon 管中，储存于 20&amp;deg;C。每张膜（尺寸为 22 × 22 cm）使用约 10 ml。</td></tr><tr><td>20× 次级洗涤缓冲液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>121 g Tris（终浓度 1 M），117 g NaCl（终浓度 2 M）。用 NaOH 调节 pH 至 10，加水定容至 1 L。储存于 2-8&amp;deg;C，可保存最多 4 个月。</td></tr><tr><td>0.5 M NaH2PO4 缓冲液 pH 7</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>69 g NaH2PO4·H2O。用 NaOH 调节 pH 至 7，加水定容至 1 L。储存于室温。</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td></td><td></td><td></td><td>50.8 g MgCl2·6H2O，加水定容至 250 ml。储存于室温。</td></tr><tr><td>10% (w/v) SDS</td><td></td><td></td><td></td><td>20 g SDS，加水定容至 200 ml。储存于室温</td></tr><tr><td colspan="5">组合装 RPN3692 = RPN3680 + RPN3685</td></tr></tbody></table>

宏基因组文库的大规模筛选

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

宏基因组文库可存档来自微生物的大片段连续基因组序列，且无需预先进行培养。因此，建立一种高效构建和筛选宏基因组文库的简化流程，有助于高通量地研究未培养微生物群落的遗传与代谢特性。本文以视频形式展示了关键实验步骤，我们认为这是准确描述依赖机器人仪器与（人工）手动操作交替进行的长流程的最有效方式。首先，我们采用机器人将文库克隆点样至高密度宏阵列膜上，每张膜可容纳来自24块384孔文库板的重复菌落。该步骤必须实现自动化，不仅是为了保证准确性和速度，也是因为需要将大量文库克隆以高度密集的空间排布，实验尺度必须微型化。文库制备完成后，我们进一步演示了如何利用标准探针标记、膜杂交和信号检测方法的改良版本，对宏阵列膜进行目标基因的筛选。除视频直观展示外，我们还提供了详细的书面说明，涵盖所有操作步骤和所需材料，相关内容均可在线获取，与视频一并提供。

宏基因组文库可存档来自微生物的大片段连续基因组序列，且无需预先培养。构建一个……

因此，我们的目标是将这些宏基因组文库中的一些菌落接种到膜滤膜上，每张滤膜最多可容纳 10,000 个菌落。目前 rums 正在将尼龙滤膜放置于一块支撑物上，并轻轻将其展平。滤膜处于少量液体中，该液体仅为培养基 LB 肉汤（luria broth）。接下来，他将把这片湿润的膜转移至机器人设备上，由机器人自动在这张膜上接种 10,000 个菌落。这类操作中，机器人技术至关重要，因为没有任何人能够具备足够的耐心和精确度，将 10,000 个菌落逐一点样到一张膜上。机器人技术正是推动基因组学发展的重要工具之一，它能够以高精度完成大量重复性操作以及微小空间尺度上的实验步骤。目前，机器人正在准备处理这3块96孔板，每块板中的每个孔都含有宏基因组文库中的一个独立克隆。目前，机器人正在对将用于在膜上点样的接种针进行灭菌。接种针会依次浸入多种不同的溶液中，其中一种为70%乙醇，以实现灭菌，随后这些接种针将被插入含有全部克隆的3块96孔板中。现在正通过光照进行灭菌和干燥。接种针干燥后，培养皿将被送入机器人装置。每个菌落实际上都被印迹并复制了一份，这有助于作为对照。因此，我们实际上需要寻找两个完全相同的菌落，以显示杂交产生的信号。在将所有菌落点样到滤膜上之后，再次将其转移至如图所示的含氨苄青霉素的平板上，然后在37摄氏度下过夜培养。发生的情况是，每个菌落都会生长，你在滤膜上看到的阵列包含10,000个菌落。当然，每个菌落都含有大量重组DNA的拷贝，此处即为宏基因组DNA。这些样品来自我们采集的北太平洋中部海域。接下来，Saltram 将把该膜转移至一系列溶液中。他首先转移至一种氢氧化钠的碱性溶液，这将裂解菌落。该过程基本上会溶解细胞壁，释放出 DNA，从而使 DNA 与滤膜接触。此时，这些菌落中所有细菌的细胞壁正在溶解，DNA 已经被释放出来。在氢氧化钠中孵育 5 分钟后，将滤膜转移。这只是暂时放置的位置，因为接下来它将进入沸水蒸气中。因此这是裂解步骤的第二部分。首先，细胞已用含有氢氧化钠和去污剂十二烷基硫酸钠的强碱性溶液进行处理。现在，这些菌落正经历高温处理，即100摄氏度的蒸汽加热。这种碱性溶液与洗涤剂结合并加热后，将彻底裂解细胞，DNA 将游离于滤膜上。在蒸汽浴中放置五分钟后，需将该滤膜转移至中和溶液中。中和溶液的作用是中和所有碱性物质，随后将滤膜干燥。现在这是中和溶液，滤膜需在中和溶液中再放置五分钟。随后将滤膜转移至吸水纸上，通常过夜晾干。待载有裂解细胞的膜在室温下干燥过夜后，将其放入含有Tris、EDTA和蛋白酶K的溶液中，其中蛋白酶K的作用是去除膜上所有的蛋白质。你会看到 RUM 已将其翻转，以确保所有菌落均被蛋白酶 K 覆盖。这将消化大量多余的细胞物质和蛋白质。在 37°C 下用蛋白酶 K 孵育 30 分钟后，将膜从溶液中取出，并在吸水纸上干燥过夜。随后即可进入下一步，即杂交步骤。我叫Vin fm，是麻省理工学院delong实验室的一名博士后。我使用宏阵列技术来筛选系统发育标记以及功能基因。您已经了解了这些宏阵列文库的制备方法。接下来，我将为您逐步介绍如何进行筛选实验。这是宏阵列，在继续操作之前，我们需要通过紫外照射交联，将DNA固定在膜上。我们使用紫外交联仪进行这一步骤，将膜放入其中，设置为自动交联模式并开始交联。交联完成后，我喜欢将膜切成两半。这样做的原因是，这些膜将在杂交管内进行杂交，而将膜切成两半可以使膜的整个内表面充分暴露于杂交溶液中。可以看出，膜平整地置于管内，没有发生卷边或折叠。因此，这里我们将膜很好地放置在杂交管中。接下来，我将向其中加入杂交缓冲液。含有探针，我已将其放入另一支预热至60摄氏度的试管中。这是我偏好的杂交温度。在进行下一步之前，或者更准确地说，在我操作的同时，我将解释一下随检测试剂盒由生产商提供的杂交缓冲液。其中包含杂交缓冲液，我们会加入封闭试剂。此外还有磷酸盐缓冲液、SDS、氯化镁和氯化钠，以及一些尿素。很好。接下来，将这支含有杂交缓冲液、膜和探针的试管放入杂交炉中，我已将温度设置为60°C，随后即可放置过夜孵育，无需再管。因此，在理想条件下过夜孵育后，接下来需要洗涤膜以去除未结合的探针。杂交缓冲液和探针的制备过程中不涉及任何有害物质，因此可安全地倒入水槽中处理。我将去取我的主洗涤缓冲液，它也在60度下预热。该缓冲液一直在与膜杂交过夜相同的温度下良好加热。接下来，洗涤也将在相同温度下进行。因此，通常使用初洗缓冲液进行三次洗涤，每次孵育时间约为5到10分钟。同样，每次洗涤循环后，初洗缓冲液不含放射性物质，也无已知危险化学品，可直接倒入水槽中。在60摄氏度下用初洗缓冲液完成三次洗涤后。现在膜已准备好进行第二次洗涤，这一步可将膜的pH值调节至适合与ECF检测试剂接触的水平。接下来，我们在室温下用二次洗涤缓冲液洗涤膜。此时可以使用镊子取出膜，或者如果操作足够小心，也可以戴上手套，仅用手的背面或膜的边缘来接触膜，以避免用手套上可能存在的污染物污染膜表面。应将膜转移至含有已预配并恢复至室温的二抗洗涤缓冲液的容器中。将其平整地放置即可。有时膜可能会重叠，但这并不重要。请记住，此特定步骤仅用于平衡膜的 pH 值。然后让其孵育。如有需要，可进行轻微振荡。我发现这样做无论从哪方面来看都未见得特别有用或有害。因此，我只是再次将它放在实验台上静置五到十分钟，然后第二次重复二抗清洗步骤。二抗的第二次清洗已完成。现在开始准备检测并展开操作。我正在铺开一些保鲜膜，将膜放置在保鲜膜上，检测试剂面朝上，然后将保鲜膜折回来覆盖在膜上。这样就形成了一个良好的小袋，用于容纳检测试剂。这里我们已准备好膜。将多余的洗涤缓冲液沥干，滴在几张干燥的纸巾上，然后将膜平铺在保鲜膜上。您已预先混合好ECF检测试剂。这些通常可以在冰箱中长期冷冻保存数月，我只需将试剂倒入膜上即可。我会把剩余部分折叠起来，然后用保鲜膜包裹。通过折叠末端或边缘形成一个小囊袋，并用一些铝箔包裹以保护整个检测过程。同样放置约5到10分钟。现在可以将第一个袋子中的检测试剂排出。您会注意到，我已将部分保鲜膜粘贴在实验台上。您可能会发现这样做非常有用，可防止石蜡包埋用的保鲜膜不可避免地发生粘连。同样，将样品在纸巾堆上轻蘸以去除多余液体，然后卷入预先铺在实验台上的新鲜、干净的保鲜膜中，也是十分有效的操作步骤。好的，检测用的化学试剂大部分已经去除，接下来膜可以进行约两小时的孵育，以使信号充分显色。现在孵育时间已到，我们可以对膜上的信号进行检测。我们使用荧光扫描仪对膜进行扫描来完成检测，在此过程中仍需仅在膜的边缘进行操作。您可能会发现，使用移液器将膜与玻璃之间形成的气泡滚压出去会很有帮助。接下来我们准备进行扫描，对膜所覆盖的面部板区域分别在4纳米和73纳米波长下进行扫描。因此，当你放大完成的扫描结果时，会得到与该图像类似的效果。你会看到一个信号就在这里。每当出现两个相对的点时，就表示存在阳性信号。这是一个例子，这是第二个例子。因此，一旦确定了膜上产生信号的区域，就可以追溯该信号对应的是哪一块板以及哪一个孔，从而确定哪一个基因文库克隆携带了您希望通过筛选鉴定的特定基因。一旦确定了smid，你就可以开始寻找目标基因。一种方法是对整个smid插入片段进行测序，并找出你感兴趣的基因。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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