测量细菌细胞的抗弯刚度，使用光学陷阱
April 26th, 2010
我们提出了一个封面防滑表面附有一个光学陷阱来衡量细胞的抗弯刚度弯曲的丝状细菌细胞的协议。
为了确定单个大肠杆菌细胞的弯曲刚度，首先，将细菌生长到指数期，然后将它们附着在经过化学处理的盖玻片表面上。让已经附着在表面上的细胞进一步生长，以便它们长出柔韧的末端。接下来流入介电珠，捕获磁珠并将其弯曲到电池的柔性尖端。
该过程的最后一步是用光阱弯曲比色皿并测量得到的强制位移数据。单元的弯曲刚度可以通过线性拟合强制位移数据来计算。大家好，我是来自普林斯顿大学 Louis Sickler 综合基因组学研究所和物理系 Joshua Shere 教授实验室的 Steven Wong。
今天，我们将向您展示弯曲单个生态细胞和结合细胞刚度的过程。我们在实验室中使用该程序来研究不同细胞内结构对细菌细胞机械完整性的贡献。那么让我们开始吧。
要开始此过程，请在 LB 培养基中培养 3 毫升任何大肠杆菌细胞至指数期。一旦细胞达到 600 纳米的光密度（介于 0.2 和 0.4 之间），在培养物中补充每毫升 50 微克的头孢氨苄 15 分钟，以诱导丝状生长。在这 15 分钟内，制作一个流动室。
将两片双面胶带（两片之间间隙为 3 毫米）贴在载玻片上，并在顶部贴上盖玻片。胶带之间的间隙为流动的液体创造了一个通道。将 10 微升用水稀释的 1% 聚乙啉流入流通室中，用微量移液管孵育 5 分钟，在盖玻片上涂上 PEI。
然后在腔室的一端流入 200 微升水，并在另一端用真空收集来清洗。在头孢氨苄存在下培养细菌 15 分钟后，在微量离心机中离心 1 毫升细胞，并用头孢氨苄重悬于 200 微升 LV 中。接下来，再次在一端使用微量移液器，在另一端抽真空，将 50 微升浓缩的细胞培养物流入腔室，将涂层盖玻片孵育三分钟。
然后用 50 微升补充有头孢氨苄的 Vel B 洗涤。要去除未贴壁的细胞，请将腔室在 37 摄氏度下孵育 30 分钟至 1 小时，让贴壁细胞生长，然后在细胞孵育时将它们放在光阱仪器上。将 3 微升直径为 0.5 微米的聚苯乙烯微珠放入一个用水稀释的 0.1% 聚赖氨酸微珠中孵育 30 分钟，制备聚赖氨酸包被的微珠。
当珠子完成孵育后，通过在微量离心机中旋转并悬浮在 1 毫升水中复苏来洗涤它们 3 次，继续将珠子与细菌结合并测量细胞的结合刚度。该协议最困难的方面是能够记录、定位和识别一个好的单元来测量弯曲、刚度。一个好的 cell 是具有明确定义的 stuck end 和 free end Place 的 cell 。
显微镜上的流动室寻找具有明确卡住末端的细胞。一些细胞仅附着在一个尖端，另一个尖端的弯曲力导致整个细胞旋转而不是弯曲。要找到合适的单元，请使用纵杆控制的载物台运动，用陷阱快速弯曲每个单元。
当找到合适的细胞时，用头孢氨苄将微珠溶液稀释 2 倍到 lb 中，将 30 微升微珠溶液加入流动室中，方法是将微珠溶液移液到一端，然后在另一端用 Kim 擦拭纸巾轻轻流出，光学捕获漂浮的珠子并将其接触到细胞的自由尖端。通过微量移液管再次清洗腔室，并使用含有 50 微升头孢氨苄的 LB 中的 Kim 白色组织去除未附着的珠子。接下来，运行自定义编写的实验室视图程序，将弯曲力施加到单元并记录强制位移数据。
首先，通过 RA 扫描检测激光束内附着的珠子并记录 3D PSD 电压信号来校准检测器响应。然后在显微镜图像中识别细胞的长轴。确定长单元轴后，沿垂直于长轴的方向逐步移动单元，同时移动单元记录、移动的距离以及珠子从光阱中心的位移。
最后，使用之前测量的陷阱刚度将位移值转换为施加的力并保存。此处的 tip displacement 和 force to file 是单个单元的强制位移数据。这条线的斜率是单元的弯曲刚度。
我们刚刚向您展示了如何将大肠杆菌的弯曲刚度与光阱相结合。使用此过程时，重要的是要记住找到具有明确卡住端和自由端的优质电池。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种使用光学捕捉技术测量丝状细菌细胞弯曲刚度的协议。该方法包括培养大肠杆菌细胞，将它们附着在盖玻片上，并施加弯曲力来评估它们的机械性质。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物物理学
- 细胞力学
背景
- 了解细菌细胞的机械性质对于洞察其行为和完整性至关重要。
- 大肠杆菌的丝状生长可以被诱导以研究它们的弯曲刚度。
- 光学陷阱提供了一种非侵入性的方法来施加作用于单个细胞的力。
- 以往的研究主要集中在细胞在各种条件下的机械完整性。
研究目的
- 开发一个可靠的协议来测量大肠杆菌细胞的弯曲刚度。
- 调查细胞内部结构对细胞力学的贡献。
- 增强对细菌细胞在机械应力下行为的理解。
使用的方法
- 在LB培养基中将大肠杆菌细胞培养到指数期。
- 使用头孢氨苄诱导丝状生长。
- 将细胞附着到经过化学处理的盖玻片上。
- 使用光学陷阱施加弯曲力并测量位移数据。
主要结果
- 该协议成功测量了单个大肠杆菌细胞的弯曲刚度。
- 数据分析揭示了施加的力与细胞位移之间的关系。
- 识别适合测量的细胞对于准确结果至关重要。
- 这些发现有助于理解细菌细胞力学。
结论
- 开发的协议对于研究细菌细胞的机械性质是有效的。
- 光学陷阱是研究细胞刚度的有价值的工具。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索细胞力学的其他方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
