Name: 测量细菌细胞的抗弯刚度，使用光学陷阱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学习使用光学陷阱测量大肠杆菌的抗弯刚度。该方法通过诱导丝状生长、化学固定和施加弯曲力，帮助研究人员研究细菌细胞力学特性及其细胞内结构对机械完整性的贡献。

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我们感谢明斋孙在细胞与表面结合方面的有益建议。感谢内德·温格伦和泽梅尔·吉泰的宝贵讨论。本研究由美国国立卫生研究院资助项目P50GM07150、美国国家科学基金会职业奖PHY-0844466以及阿尔弗雷德·P·斯隆基金会支持。

<ol>
	<li>将大肠杆菌细胞在LB培养基（Luria-Beltrani broth）中培养至对数生长期（OD = 0.2–0.4）。</li>
	<li>在LB培养基中加入50 μg/mL头孢氨苄，继续培养15分钟以诱导丝状生长，随后通过离心将菌液浓缩5倍。</li>
	<li>通过将1%聚乙烯亚胺（polyethylenimine）水溶液注入流动池中，孵育5分钟后用水冲洗，制备PEI包被的盖玻片。</li>
	<li>将浓缩后的菌液注入流动池，3分钟后用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB混合液冲洗，以去除未贴壁的细胞。</li>
	<li>将流动池置于37°C孵育30分钟至1小时，使贴壁细胞充分生长，随后将其放置于光镊装置上进行实验。</li>
	<li>将直径为0.5 μm的聚苯乙烯微球（Bangs Labs）与0.1%多聚赖氨酸（polylysine）水溶液孵育30分钟，制备多聚赖氨酸包被的微球；随后洗涤3次，并重悬于水中。</li>
	<li>将微球悬液用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB培养基稀释两倍后，加入流动池中。</li>
	<li>使用光镊捕获悬浮微球，并将其接触细胞的游离末端。（我们使用Mad City Labs压电载物台来控制样品的运动。）当找到合适的微球-细胞组合后，用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB溶液冲洗流动池，以去除未结合的微球。</li>
	<li>运行自行编写的LabView程序，对细胞施加弯曲力并记录力-位移数据。
程序细节
<ol class="lalpha">
 <li>通过对附着微球在检测激光束内进行光栅扫描，并记录三维PSD电压信号，校准探测器响应。</li>
 <li>在显微镜图像中识别细胞的长轴方向。</li>
 <li>沿垂直于细胞长轴的方向，以步进方式移动细胞。</li>
 <li>记录移动的距离以及相对于光镊的位移量。</li>
 <li>利用先前测定的光阱刚度将位移转换为施加的力，并将尖端位移和力数据保存至文件。</li>
</ol>
</li>
</ol>
成功的秘诀：在第8步中，需要找到一个末端粘附清晰的细胞。有些细胞仅在一端粘附，另一端的弯曲力会导致整个细胞发生旋转，而非弯曲。通过使用操纵杆控制载物台移动，快速手动弯曲每个细胞，从而找到合适的细胞对。
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="力-位移曲线；线性拟合；胡克定律；实验数据；物理分析；弹簧常数。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1. 该图显示了一个单细胞的力-位移数据。该直线的斜率即为细胞的弯曲刚度。

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

本文视频的制作由 Mad City Labs 赞助，该公司生产本研究中所使用的仪器。

本文介绍的实验方案旨在定量测量细菌细胞的弯曲特性。该实验装置可适用于任何能够诱导生成丝状结构的杆状细胞。我们已成功利用此装置研究了细胞骨架纤维对大肠杆菌（E. coli）细胞弯曲刚度的影响。该技术同样可用于评估压力、细胞壁刚度以及其他细胞内组分在决定细胞整体弯曲刚度中的作用。

<table><tbody><tr><td>头孢氨苄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>聚赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>直径0.5-&amp;mu;m的聚苯乙烯微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Nano-LP 系列纳米定位系统</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用光镊测量细菌细胞的弯曲刚度

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

我们开发了一种用于测量丝状杆状细菌弯曲刚性的实验方案。实验中使用光镊施加力，光镊是一种由光构成的微观三维弹簧，当高强度激光束通过显微镜物镜聚焦到极小光斑时形成。为了使细胞发生弯曲，我们首先将活细菌结合到经化学处理的盖玻片表面。随着细胞生长，细胞中部仍固定于盖玻片，而两端则自由延伸。通过使用药物头孢氨苄诱导细胞产生丝状生长，我们可以识别出一端固定于表面、另一端游离且可受弯曲力作用的细胞。随后，将经多聚赖氨酸包被的微球结合至生长中细胞的游离末端，利用光镊施加弯曲力。同时记录微球所受的力及其位移，细胞的弯曲刚度即为该力-位移关系曲线的斜率。

关键词：弯曲刚性，丝状细菌，光镊，杆状细菌，头孢氨苄，多聚赖氨酸微球，弯曲刚度

我们介绍一种利用光镊弯曲附着在盖玻片表面的丝状细菌细胞的实验方案，以测量细胞的弯曲刚度。

我们开发了一种用于测量丝状杆状细菌弯曲刚度的实验方案。通过光镊施加力，光镊是一种显微的……

为了测定单个大肠杆菌细胞的弯曲刚度，首先将细菌培养至对数生长期，然后将其附着于经过化学处理的盖玻片表面。让已附着在表面的细胞继续生长，使其形成柔性的末端。接着流入介电微珠，捕获一个微珠并将其弯曲至细胞的柔性末端。该实验步骤的最后一步是利用光镊弯曲细胞，并测量由此产生的受迫位移数据。通过对接力位移数据进行线性拟合，可计算出细胞的弯曲刚度。大家好，我是来自普林斯顿大学路易斯·西克勒整合基因组学研究所及物理系 Joshua Shere 教授实验室的 Steven Wong。今天，我们将向您展示一种弯曲单个生态细胞并测量其细胞刚度的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究不同细胞内结构对细菌细胞机械完整性所起的作用。现在，让我们开始吧。开始此实验步骤时，将3毫升任意大肠杆菌细胞在LB培养基中培养至对数生长期。当细胞在600纳米处的光密度达到0.2至0.4之间时，在培养物中加入50微克/毫升的头孢氨苄，作用15分钟，以诱导菌体形成丝状生长。在这15分钟内，制备一个流动腔室。将两段双面胶带粘贴在载玻片上，两段之间留出3毫米的间隙，然后在上方贴上盖玻片。胶带之间的间隙可形成液体流动通道。使用移液器将10微升用蒸馏水稀释的1%聚乙烯亚胺（PEI）溶液注入流动室，室温孵育5分钟，使盖玻片表面完成PEI包被。然后，从腔室的一端加入200微升水，并在另一端用真空装置收集液体，进行清洗。在头孢氨苄存在下培养细菌15分钟后，将1毫升菌液在微量离心机中离心沉淀，再悬浮于含头孢氨苄的200微升LV溶液中。接着，再次使用微量移液器从一端加入，另一端用真空装置吸引，将50微升浓缩菌液流入含有包被盖玻片的腔室中，孵育3分钟。然后用50微升添加了头孢氨苄的Vel B洗涤。为去除未贴壁的细胞，在将细胞置于光镊仪器上之前，于37摄氏度孵育30分钟至1小时，使已贴壁的细胞生长。通过将3微升直径为0.5微米的聚苯乙烯微球与0.1%多聚赖氨酸水溶液按1:1稀释后孵育30分钟，制备多聚赖氨酸包被的微球。当珠子完成孵育后，使用微型离心机离心并用一毫升水重悬，洗涤三次，随后将珠子与细菌结合，并测量细胞的结合刚度。本实验方案中最困难的部分是能够回收、定位并识别出适合进行弯曲刚度测量的优质细胞。优质细胞应具有清晰可辨的固定端和游离端位置。在显微镜下的流动腔中寻找一端牢固附着的细胞。一些细胞仅在一端附着，另一端所受的弯曲力会导致整个细胞发生旋转而非弯曲。为找到合适的细胞，可使用操纵杆控制载物台移动，通过光镊快速弯曲每个细胞。当找到合适的细胞后，将珠子溶液用含头孢氨苄的LB培养基稀释两倍，通过移液将30微升珠子溶液加入流动池的一端，并用Kimwipe纸巾从另一端轻轻引出，使溶液流动。使用光镊捕获一个悬浮的珠子，并将其接触细胞的游离末端。随后，用移液器及含50微升头孢氨苄的LB培养基的Kimwipe白纸巾再次清洗流动池，以去除未结合的珠子。接下来，运行自行编写的LabVIEW程序，对细胞施加弯曲力，并记录力-位移数据。首先，通过在检测激光束内对附着的微珠进行角向扫描（RA扫描），并记录三维PSD电压信号，来校准探测器响应。然后，在显微镜图像中确定细胞的长轴方向。在确定细胞长轴后，将细胞沿垂直于长轴的方向逐级移动，同时记录细胞移动的距离以及微珠相对于光镊中心的位移。最后，利用先前测得的光镊刚度将位移值转换为施加的力，并保存数据。此处保存到文件的尖端位移和力即为单个细胞的受迫位移数据。该直线的斜率即为细胞的弯曲刚度。我们刚刚向您展示了如何将大肠杆菌的弯曲刚度与光镊技术相结合。在使用该方法时，重要的是要记住选择一个具有明确定义的固定端和自由端的良好细胞。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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