尼罗河红染色 C. elegans: 固定动物脂质液滴可视化的方法

0 次观看3:34 分钟 • April 30th, 2023

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- 当观察脂滴(中性脂质的细胞内储存细胞器)时,首先向样品中添加去污剂溶液,例如含有 Triton X-100 的溶液。这将使蠕虫的细胞透化。接下来,将样品固定在适当浓度的异丙醇中,例如 40%。

然后,将 Nile Red 添加到样品中并避光,因为染料对光敏感。固定使染料能够接触到整个动物的脂滴。Nile Red 是一种亲脂性染料,其荧光发射光谱取决于局部脂质环境的极性。

当暴露于极性脂质(如磷脂)时,尼罗红的发射光谱处于较高的红色波长中。当暴露于中性脂质(如脂滴中性核心中的三酰甘油和甾醇酯)时,尼罗红的发射光谱会转移到较低的黄金波长。

因此,使用荧光显微镜的绿色通道,该通道将收集黄金色波长发射,以可视化整个动物脂质液滴的尼罗红染色。在示例方案中,我们将看到 Nile Red 染色程序和固定样品中脂滴的成像。

- 为了进行尼罗红脂质染色,将蠕虫铺在线虫生长培养基 (NGM) 上,接种晚对数 OP50 大肠杆菌,并在 20 摄氏度下将蠕虫生长至 L4 早期。用 1 毫升 PBST 溶液洗涤蠕虫,并将蠕虫悬浮液转移到 1.5 毫升微量离心管中。

蠕虫以 560 倍重力离心 1 分钟,然后去除上清液并重复 PBST 洗涤,直到从悬浮液中清除大肠杆菌。接下来,向蠕虫沉淀中加入 100 微升 40% 异丙醇或 60% 用于 ORO 染色,并将样品在室温下孵育 3 分钟。

- 添加异丙醇对于染色前蠕虫的适当透化至关重要。

- 将蠕虫以 560 倍重力离心 1 分钟,然后去除上清液,不要破坏蠕虫沉淀。

- 在离心步骤中尽量减少光照非常重要。

- 现在,在黑暗中,向每个样品中加入 600 μL 先前制备的 NR 工作溶液。将试管倒置 3 次,将蠕虫和溶液充分混合。然后将样品在室温下避光孵育 2 小时。

孵育后,离心蠕虫并去除上清液。然后加入 600 μL PBST,将样品在黑暗中孵育 30 分钟,以去除多余的 NR 染色剂。像以前一样再次旋转样品后,除掉大约 50 μL 的上清液外,其余所有上清液。

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最后更新:1 八月 2026