Name: 一步代谢:碳水化合物，在一个单一的过程量化的有机和氨基酸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习一步代谢组学方法，利用脲酶处理和GC/MS技术同时定量分析碳水化合物、有机酸和氨基酸。该方法可检测新生儿筛查中38%的额外遗传代谢病，显著提升诊断效率。

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感谢 Anthony Thomas 提供的出色技术支持。

尿液样本处理步骤
<ol>
 <li>将尿液样本在 37°C 水浴中解冻。若原始容器受损，需将样本转移至新容器中。</li>
 <li>取最大 13 ml 的样本 aliquot，置于已标记的锥形离心管中，并在 -20°C 下保存。</li>
 <li>使用折射仪测量样本的折射率，取数滴尿液置于仪器中，记录其光学密度。</li>
 <li>通过 0.2 μm 滤膜对样本进行过滤。</li>
 <li>根据样本的光学密度，量取下表所示体积：
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>1.000–1.009</td>
 <td>1.00 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.010–1.019</td>
 <td>0.50 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.020–1.050</td>
 <td>0.25 ml + 0.25 ml H2O</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>将上述指定体积的样本转移至一个含有以下内标物的 Reactivial 管中：500 纳摩尔（nmoles）3 肌酸；10 nmoles d3 甲基丙二酸；每种以下物质各 100 nmoles：13C3 乳酸、13C3 丙酮酸、13C2 15N 甘氨酸、d3 丝氨酸、d5 苯丙氨酸、d11 己酰甘氨酸、15N2 乳清酸、d4 癸二酸、13C6 葡萄糖、d6 肌醇和 d5 色氨酸。</li>
 <li>向样本中加入 20 微升（μl）浓度为 7.5 单位/μl 的脲酶溶液（Calzyme Laboratories 货号 116A0100），然后通过惰性隔垫用 CO2 冲洗并密封。</li>
 <li>将样本在 37°C 下孵育 30 分钟，每隔 15 分钟补充一次二氧化碳气体以维持压力。</li>
 <li>再加入 20 μl 脲酶溶液，用二氧化碳冲洗反应管，并在 37°C 下继续孵育 15 分钟。</li>
 <li>加入 500 μl 的丙酮:甲醇（30:70）混合液，将橡胶隔垫更换为聚四氟乙烯（Teflon）涂层隔垫，并在 -20°C 下冷却 15 分钟。</li>
 <li>以 1500 rpm 离心 10 分钟去除固体成分，上清液倾入洁净的 2.0 cc Reactivial 管（Supelco/Sigma）中。</li>
 <li>按以下方式加入三乙胺三氟乙酸盐（TEA/TFA）（Sigma）：
 <ul>
 <li>1.00 ml 样本加入 20 μl</li>
 <li>0.5 ml 或更少样本加入 40 μl</li>
 </ul>
 </li>
 <li>用乙腈定容，并在 70°C 氮气流下吹干至恒定体积（TEA/TFA 将保留），约需 15 分钟。</li>
 <li>重复第 13 步，最多 4 次，直至出现沉淀（每次约 10 分钟）。</li>
 <li>冷却约 2 分钟。小心加入二氯甲烷（避免沸腾溢出），吹干约 4 分钟。</li>
 <li>重复第 15 步。</li>
 <li>按以下比例加入 MSTFA（N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺）（Thermo Scientific）：
 <ul>
 <li>1.00 ml 样本加入 150 μl</li>
 <li>0.50 ml 或更少样本加入 200 μl</li>
 </ul>
 </li>
 <li>在氮气氛围下密封，于 70°C 孵育 1 小时。</li>
 <li>在氮气氛围下转移至微量进样瓶，用于气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）分析。</li>
 <li>将微量进样瓶置于 Agilent 5975 GC/MS 自动进样器中进行分析。仪器温度设置如下：进样口 200°C，接口 250°C，柱温箱初始 80°C 保持 1 分钟；以 4°C/分钟升温至 130°C，再以 6°C/分钟升温至 200°C，最后以 12°C/分钟升温至 285°C，保持 10 分钟。色谱柱：DB-5，25 m，内径 320 微米，膜厚 0.5 微米。质谱条件：离子源 230°C，四极杆 150°C，扫描范围 50–650 amu，扫描速率 2.46 次/秒，溶剂延迟 3.5 分钟。</li>
</ol>
代表性结果
请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">点击此处</a>查看代表性结果。

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

代谢筛查实验室是圣路易斯大学（一家非营利性机构）拥有的经CLIA认证的临床实验室。Shoemaker博士不直接从实验室收入中获利，但可能间接受益于实验室的运营成果。所有方法、技术、结果、正常参考范围、宏指令、软件、数据库或结论均不视为专有，可供感兴趣的各方自由使用。

尿素酶法（1）在医学文献中已被引用62次，并有多种改良方法。松本（Matsumoto）研究组（2,3）简化了该方法以适用于高通量新生儿筛查，并报告了来自16000例患者的结果。桑原（Kuhara）等人（4-7）报道了该方法在多种先天性代谢缺陷诊断与随访中的应用。Rhead（8）也证实了该方法在先天性代谢缺陷的临床诊断与随访中的实用性。该方法已被应用于熊、基因敲除小鼠、大象的尿液，以及整只果蝇及其幼虫匀浆样品的分析（9）。此外，还对位点定向诱变前后隐球菌（Cryptococcus）的培养基进行了分析，但未进行尿素酶处理步骤（10）。该方法已被用于医学生、唐氏综合征患者以及老年痴呆退伍军人在口服色氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸负荷后的营养状况评估（11）。通过定量这三种氨基酸的降解产物，可评估全部八种B族维生素，因为这些氨基酸在降解过程中均分别依赖全部8种维生素。已有研究报道了药物的毒性作用及其通过补充维生素得以缓解的情况（12）。正常妊娠与唐氏综合征妊娠的羊水样本也已被分析并报道（13-15）。

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>气相色谱/质谱/计算机</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>气相色谱/质谱/计算机</td></tr><tr><td>脲酶</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>亦见 Sigma C3</td></tr><tr><td>稳定同位素标准品</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气相色谱柱</td><td>J&amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>小瓶</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

一步式代谢组学：单次操作同步定量碳水化合物、有机酸与氨基酸

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

目前，美国出生的每名婴儿都会接受多达42种被称为“先天性代谢错误”的罕见遗传病筛查。该筛查方法基于串联质谱技术，通过定量酰基肉碱来检测有机酸血症，同时测定氨基酸水平。所有州还对半乳糖血症等碳水化合物代谢疾病进行酶学检测。由于初筛结果可能缺乏特异性，阳性结果需通过更确证的方法进行后续检测。本报告描述了用于先天性代谢错误筛查的“尿素酶法”样本前处理方法。该方法使用结晶态尿素酶酶解体液中的尿素，从而使大多数其他水溶性代谢物可在单一操作流程中完成脱水和衍生化，以适用于气相色谱分析。在氮气流中蒸发脱水的过程通过添加乙腈和二氯甲烷得以促进。随后，在独特的催化剂三乙基氟乙酸铵存在下进行三甲基硅烷化反应。自动化进样和色谱分析完成后，通过宏程序驱动，利用经三甲基硅烷（TMS）衍生化生物化合物的质谱数据库，对192种代谢物进行定制化定量分析，并对所有主要组分进行半定量分析。该分析可在广泛使用的Chemstation平台上完成，所需宏程序和数据库可由作者提供。在本实验室，已采用该方法分析超过16,000份患者样本，诊断率约为17%——即17%的样本结果提示临床医生需采取相应诊疗措施。其中包含180余例确诊的先天性代谢错误，约38%的病例是既往方法无法诊断的。

本文由该方法的发明者介绍了用于气相色谱/质谱分析中间代谢物的尿素酶样品制备法。该方法通过一步法定量检测碳水化合物、有机酸和氨基酸，实现了基于串联质谱技术对新生儿筛查中先天性代谢缺陷的后续跟踪。

目前，美国出生的每名婴儿都会接受多达42种被称为“先天性代谢错误”的罕见遗传病筛查。该筛查方法基于……

在此单步代谢组学流程中，生物样本经过一次性处理，即可用于气相色谱-质谱联用技术分析碳水化合物、有机酸和氨基酸。首先，使用脲酶处理样本以去除尿素。该流程的第二步是在含有两种挥发性成分——三乙醇胺和三氟乙酸铵——的去垢剂存在下对样本进行脱水。随后通过三甲基化对组分进行衍生化处理。最后，通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析，并自动定量碳水化合物、有机酸、氨基酸、异亮氨酸、甘氨酸以及氨基糖，从而能够确认和追踪新生儿筛查中发现的大多数遗传代谢病，以及额外38%目前未通过串联质谱技术进行筛查的疾病。您好，我是圣路易斯大学代谢筛查实验室的Jim Shoemaker。我在这里演示一步法代谢组学，这是一种用于分析生物液体中中间代谢物的方法，无需分离酸性、碱性和中性化合物。这使得我们能够通过单一程序跟进串联质谱新生儿筛查，从而一步完成对有机酸、氨基酸、碳水化合物、碳水化合物衍生物以及乙酰甘氨酸的分析。其结果是，在我身后的图表中，您可以看到，标为红色的那些疾病诊断可通过一步法代谢组学实现，而这些疾病在现有的串联质谱新生儿筛查中则无法被检测出来。下面我们开始演示。首先，将尿液样本置于37摄氏度的水浴中。如果原始容器已受损，需将样本转移至新的容器中。取一份样品 aliquot，置于已标记的锥形离心管中，于零下 20 摄氏度保存，作为备份。随后，将数滴尿液滴加至手持式折射仪中，测量并记录样品的光学密度。测量光学密度后，通过 0.2 微米滤膜对样品进行过滤。根据过滤前测得的光密度值量取相应体积的样品。当光密度值在1.000至1.009之间时，取1毫升样品；当光密度值在1.010至1.019之间时，取0.5毫升样品；当光密度值在1.020至1.050之间时，取0.25毫升样品与0.25毫升水混合。将指定体积的样品转移至反应小瓶中，该小瓶已含有本处表格所示的同位素标记内标物。这些内标物包括肌酸、甲基丙二酸、乳酸、丙酮酸、甘氨酸、苯丙氨酸、己酸、甘氨酸、乳清酸、SEBA酸葡萄糖、肌醇和色氨酸。然后加入20 µL浓度为7.5 单位/µL的脲酶溶液。通过惰性隔垫向样品中通入二氧化碳并密封。将样品在37摄氏度下孵育30分钟，每隔15分钟补充一次二氧化碳气体，以确保在30分钟孵育结束时压力维持稳定，并额外加入20微升脲酶溶液。用二氧化碳冲洗小瓶，并将样品在37摄氏度下继续维持15分钟。尿素酶处理完成后，应立即进行脱水和衍生化处理，紧随尿素酶处理步骤之后进行。使用500微升体积的30至70的丙酮-甲醇溶液处理样品，并将样品上的橡胶隔垫更换为聚四氟乙烯（Teflon）涂层隔垫。将样品在零下20摄氏度冷藏15分钟。在1500转/分钟条件下离心10分钟以去除固体，然后将上清液转移至一个洁净的2.0 CC反应小瓶中。接着加入三乙胺三氟乙酸盐（T-E-A-T-F-A），该物质是三甲基化反应的催化剂：对于1毫升样品，加入20微升；对于0.5毫升或更小体积的样品，则加入40微升。用乙腈补足体积，然后在70摄氏度下置于氮气流中，直至体积恒定，表明仅剩T-E-A-T-F-A。此过程约需15分钟。再次用乙腈补足体积，并在70摄氏度下置于氮气流中，直至体积恒定，重复此步骤最多四次，直至形成沉淀。每次脱水后大约需要10分钟，冷却约两分钟。小心加入二氯甲烷至满，注意防止沸腾溢出，并干燥。此步骤约需四分钟。用二氯甲烷补足体积并干燥。再重复一次。接下来，对样品进行衍生化。向1毫升样品中加入150微升OFM和STFA，每0.5毫升或更少样品加入200微升。在氮气氛围下密封样品，并在70摄氏度孵育1小时。1小时孵育结束后，在氮气氛围下操作，将样品转移至微量小瓶中，用于气相色谱-质谱分析，此处使用Agilent 5 9 7 5 GCMS，配备DB五毛细管柱。进行质谱分析时，将源温度设为230摄氏度，四极杆温度设为150摄氏度，扫描质量范围设为50至650 AMU，每秒扫描2.46次。溶剂延迟时间为3.5分钟。进样口的仪器温度为200摄氏度，另一处仪器温度为250摄氏度。对于程序升温过程，先将色谱柱温箱设置为80摄氏度保持1分钟，然后以每分钟4摄氏度的速率从80摄氏度升至130摄氏度，接着以每分钟6摄氏度的速率从130摄氏度升至200摄氏度，最后以每分钟12摄氏度的速率从200摄氏度升至285摄氏度，并在该温度下保持10分钟。将装有衍生化样品的微量小瓶放入自动进样器中，由气相色谱-质谱联用仪（GCMS）进行自动进样，并开始分析。下图显示了一个经过脲酶处理后尿液样本的代表性GCMS分析谱图，图中峰对应于代谢物焦谷氨酸、4-羟基环乙酸和哈金森酮（hawkinson）。这些代谢物提示为霍金斯无尿症，这是一种罕见的遗传性疾病。谱图中的所有峰均可归属于已知的代谢物并进行定量。新生儿初筛检测的结果可能缺乏特异性。然而，通过气相色谱-质谱法（GCMS）分析尿液样本，发现Hawkins尿液代谢物水平升高，从而证实了这种先天性代谢缺陷疾病的诊断。采用相同的尿液筛查（URIs）方法，共确诊了184例先天性代谢缺陷患者。其中近40%的诊断（以红色显示）若采用新生儿筛查中常用的串联质谱法将无法检出。以上是我们演示如何使用尿素酶法通过一步代谢组学分析生物流体中的碳水化合物、有机酸、氨基酸以及酰基甘氨酸，所有这些成分均可在同一流程中完成检测。需要牢记的是，在评估该流程的有效性时，可通过检测所有内标物的存在情况，分别对尿素酶消化、脱水以及三甲基硅烷化反应的完全程度进行评价。选择内标物是为了明确证明，例如脱水反应是否进行完全：如果反应不完全，肌酐的三（三甲基硅烷）衍生物（creatinine TRI TMS）就不会以最大量存在。这就是我们的验证方法。如果您对我们开发的、用于在化学工作站（chem station）中解析该流程的宏和程序库感兴趣，请通过屏幕上显示的电子邮件地址与我联系。有关我们实验室的更多信息，请访问屏幕上显示的网址。非常感谢。我是吉姆·肖梅克。

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科研

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Biology

生物学

一步代谢：碳水化合物，在一个单一的过程量化的有机和氨基酸

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中具有重要价值。本文介绍了一种利用正相液相色谱联用高分辨率质谱、极性切换及快速循环周期的技术方案，可对生物材料中的极性代谢物组成进行高灵敏度、高准确性和高分辨率的分析。...

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

代谢组学实验结果的可靠性取决于样品制备的有效性和可重复性。本文描述了一种严格且深入的方法，能够从生物液体中提取代谢物，并可选择性地对多达数千种化合物或仅特定感兴趣的化合物类别进行后续分析。...

多步制备技术以回收多种代谢物化合物类别用于深入且信息丰富的代谢组学分析

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文的目的是描述一种从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物以进行代谢组学分析（特别是毛细管电泳-质谱分析）的实验方案。...

从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物用于毛细管电泳-质谱法进行代谢组学分析

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。...

采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

本文介绍了一种对小麦籽粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该方案包括乙腈代谢物提取法以及反相液相色谱-质谱分析法，并在正离子和负离子电喷雾电离模式下进行检测。...

基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。...

液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

我们构建了一个整合了XY-Meta和metaX的非靶向代谢组学工作流程。在本方案中，我们展示了如何使用XY-Meta从开放获取的谱图参考数据库中生成诱饵谱图库，随后进行错误发现率（FDR）控制，并在完成代谢组学谱图鉴定后，利用metaX对代谢物进行定量分析。...

基于FDR控制的非靶向代谢组学鉴定与定量一体化工作流程

本方案旨在通过挥发性盐溶液洗涤、液氮快速淬灭、冷冻干燥以及−8 °C保存相结合的方法，实现单细胞质谱分析（SCMS）中细胞代谢物的保存。结果表明，液氮淬灭对于维持代谢物谱至关重要，而应尽量减少长时间的低温保存，以避免代谢物发生改变。...

单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：细胞洗涤、淬灭、干燥与储存的联合操作

学习一步代谢组学方法，利用脲酶处理和GC/MS技术同时定量分析碳水化合物、有机酸和氨基酸。该方法可检测新生儿筛查中38%的额外遗传代谢病，显著提升诊断效率。

一步式代谢组学：单次操作同步定量碳水化合物、有机酸与氨基酸

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