小鼠脑组织免疫电子显微镜样品制备

本实验的总体目标是制备适用于免疫电子显微镜观察的小鼠脑组织。首先通过灌注固定动物脑组织以完成固定；实验的第二步是切取脑组织并进行切片处理，以用于免疫组织化学染色。

该操作流程的第三步是将切片进行脱钙、脱水和包埋。流程的最后一步是切割超薄切片。最终可获得高空间分辨率的结果，显示中枢神经系统不同区域和细胞类型中各种蛋白质的分布情况。

大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学与解剖学系Esca实验室的Maria Trombley。今天我们将向您展示一种用于免疫电子显微镜的小鼠脑组织制备方法。在我们的实验室中，利用该方法研究小胶质细胞与突触在发育、经验依赖性可塑性以及衰老过程中的相互作用。

接下来我们开始。在小鼠脑组织经心脏灌注固定后，将其置于约10毫升的甲醛溶液中，在4°C条件下后固定2小时。随后在4°C条件下，用冰浴的1×PBS溶液洗涤脑组织，每次10分钟，共洗涤3次，并使用振荡器进行振荡。立即对脑组织进行横切，切成50微米厚的切片。

使用细毛刷将选定的切片转移至装有4°C XPBS的玻璃小瓶中。将剩余切片置于低温保护剂中，在-20°C下可保存数年而不发生改变。每个玻璃小瓶中最多处理10片游离切片用于染色。

使用移液管将一份 XPBS 替换为新鲜的含 0.1% 硼氢化钠的 PBS 溶液，更换溶液时动作要迅速，以避免组织切片干燥。孵育 30 分钟后，用一份 XPBS 溶液冲洗切片，每次 10 分钟，共冲洗 3 次。注意去除所有气泡，然后加入含 0.5% 明胶和 5% 正常血清的 XPBS 溶液进行封闭，所用血清应与后续将使用的二抗相匹配。

孵育2小时。加入用封闭液稀释的一抗。孵育48小时。

用一倍浓度的XPB S溶液冲洗3次，每次10分钟。随后加入用封闭液稀释的生物素标记的二抗，每轮孵育2小时。之后再次用一倍浓度的XPBS溶液冲洗3次，每次10分钟，操作同前。

用封闭液稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶室温孵育1小时。用1倍PBS缓冲液漂洗切片1次，再用1倍TBS缓冲液漂洗2次，每次10分钟。为显色，将切片与新鲜配制的含0.05% DAB和0.01%过氧化氢的1倍TBS溶液孵育。

当染色呈现明显的深棕色或反应持续五分钟时，用一份XTBS冲洗切片以终止反应。然后用一份XTBS冲洗一次，再用一份x PB冲洗两次，每次10分钟。在通风橱中，使用细刷将切片转移至装有一份XPB的多孔培养板中。

使用细刷从一个孔中取出PB，立即将切片展平。在进入下一孔之前，加入含1%四氧化锇的PB溶液，室温孵育30分钟。将锇酸处理的切片转移至玻璃小瓶中。

用一份XPB缓冲液冲洗三次，每次10分钟。将切片置于浓度递增的乙醇中进行脱水。然后按照本方案文本部分所述使用丙烯酸氧化物处理。

使用经丙烯酸氧化物冲洗过的细毛刷，将切片转移至新配制的dupant树脂中。为进行过夜浸渍，将盛有切片的培养皿置于55摄氏度烘箱中10分钟。为软化树脂，用经丙烯酸氧化物冲洗过的毛刷，在氯代包埋膜上涂布一层薄薄的树脂。

将切片转移至包埋膜上，并均匀覆盖另一层包埋膜。在上方放置约两克重的轻质压块，以帮助树脂均匀分布。将样品置于培养箱中，在55摄氏度下聚合48至72小时。聚合完成后，在双目显微镜下移除包埋膜顶层的压块。

选取 2×2 毫米大小的兴趣区域，使用剃刀片从膜上切除，并将这些兴趣区域用超级胶水粘附到树脂块的顶端。在 55°C 的培养箱中固化一小时。

使用剃刀刀片将树脂块修整成等腰梯形，这是超薄切片吸取的最佳形状。使用切片机和玻璃刀，去除组织表面的胶水，以获得一个平整的表面，用于吸取。

用双蒸水填充玻璃刀的舟槽，切取几片厚度在0.5至1微米之间的切片。使用完美的环状工具将切片转移至超冻载玻片上。在80摄氏度的加热板上干燥1分钟，然后用0.1%亚甲蓝染色1分钟。

使用洗瓶以双蒸水冲洗掉多余的染料。在光学显微镜下观察切片，区分染色的组织与树脂。继续切割半薄切片，直至组织与树脂的边界大致位于切片中央。将玻璃刀替换为钻石刀，并向刀槽中注入双蒸水。

将银切至银金色超薄切片，厚度为60至80纳米。使用精细倒置镊子小心地将切片收集到铜网载网上。

将载网置于滤纸上干燥以增强对比度。使用精细的倒置镊子将载网转移至柠檬酸铅液滴中染色两分钟。随后将载网依次浸入三份双蒸水中，轻轻漂洗。

将载网在滤纸上干燥后，存放在载网盒中，以备后续在电子显微镜下观察。在电子显微镜下观察载网，以观察免疫染色结果以及细胞组分的形态结构，包括细胞器及其相互之间的关系。

此处展示了光镜水平下 IBA1 的代表性免疫染色结果。IBA1 的细胞分布仅限于小胶质细胞，这在电子显微镜水平上证实了其特异性。IBA1 免疫染色后，可见小胶质细胞的胞体和突起。

免疫过氧化物酶DAB染色呈现为电子致密沉淀物。其他IBA1免疫染色的小胶质细胞突起则显示出不同的大小和形态。高倍放大显示其中一个小胶质细胞突起内存在多种细胞器，同时也揭示了另一个小胶质细胞突起与邻近神经毡结构（包括突触）之间的超微结构关系。

我们刚刚向您展示了如何制备用于免疫电子显微镜的小鼠脑组织。在进行此操作时，重要的是要牢记严格遵循所有步骤，并轻柔地处理脑组织。就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利。