Name: 制备小鼠脑组织中的免疫电镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习制备小鼠脑组织免疫电镜样本的完整流程，包括经心脏灌注固定、脑切片、免疫过氧化物酶染色及超薄切片技术。该方法可实现中枢神经系统内蛋白质分布的高分辨率成像。

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我们感谢邵明·卢（Shao-Ming Lu）和哈里斯·A·格尔巴德（Harris A. Gelbard）提供蠕动泵和振动切片机，同时感谢罗切斯特大学医学中心电子显微镜研究核心设施的凯伦·L·本特利（Karen L. Bentley）和盖尔·施奈德（Gayle Schneider）提供的技术协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH，项目号EY019277）、怀特霍尔基金会、伯勒斯·威康基金以及阿尔弗雷德·P·斯隆基金会向A.K.M.提供的资助支持。M.-È.T. 的研究由魁北克健康研究基金会（Fonds de la recherche en santé du Québec, FRSQ）博士后培训奖资助。

1. 动物灌注
<ol>
 <li>灌注前一天准备： 
 - 用双蒸水配制 2 L 磷酸盐缓冲液（PB；100 mM，pH 7.4）和 1 L 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS；含 0.9% NaCl 的 50 mM PB，pH 7.4）。将 PBS 和 1 L PB 储存于 4°C。这些溶液将用于灌注和包埋前免疫细胞化学。 
 - 配制 1 L 含 4.0% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）的固定液，可满足 6 只小鼠的灌注需求。在通风橱中，将 1 L PB 加热。称取 40 g 颗粒状多聚甲醛（PFA），当溶液温度升至 60°C 时加入其中。待溶液澄清、PFA 完全溶解后，冷却至室温（RT），并于 4°C 保存。</li>
 <li>灌注当天，在通风橱中用 PB 配制 500 mL 3.5% 丙烯醛溶液。随后，使用滤纸过滤 3.5% 丙烯醛和 4.0% PFA 溶液。</li>
 <li>对小鼠进行麻醉时，使用 27 号 ½" 针头向腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）。</li>
 <li>灌注过程中，依次向小鼠循环系统灌入 50 mL PBS、75 mL 丙烯醛和 150 mL PFA。为设置蠕动泵，先用 PBS 填充管道，并在一端安装 23 号 ¾" 蝶形针头。将管道另一端浸入灌注液（PBS、丙烯醛或 PFA）中。将蠕动泵流速设定为 20–25 mL/min（适用于幼年和成年小鼠）。整个灌注过程中，需仔细避免管道内产生气泡。</li>
 <li>待麻醉小鼠对疼痛刺激（如尾部夹捏）无反应后，再进行下一步操作。将动物置于解剖托盘中，用胶带固定四肢。使用镊子和剪刀切开皮肤和胸腔，暴露心脏。为尽量减少脑缺血，应迅速开始灌注。用小剪刀剪开右心房，并启动蠕动泵。用镊子夹住心脏，将蝶形针头插入左心室心尖部。</li>
 <li>更换溶液时，先停止蠕动泵，将管道从一种溶液转移至另一种溶液，然后立即重新启动泵。</li>
 <li>当 150 mL PFA 灌注完成后，停止蠕动泵。用小剪刀剪下头部，切开皮肤，并在两眼之间敲开颅骨。用小镊子小心剔除颅骨碎片，直至脑组织可轻松取出。将脑组织在 4°C 的 PFA 中后固定 2 小时，随后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
 <li>立即在冰浴 PBS 中使用振动切片机将脑组织切成横切面（厚度为 50 μm）。用细毛刷将用于免疫细胞化学的切片转移至含有 PBS 的玻璃小瓶中。其余切片可储存在含防冻剂（PBS 中含 30% 乙二醇和 30% 甘油）的溶液中，置于 -20°C，可保存数年。</li>
</ol>
2. 包埋前免疫细胞化学
<ol>
 <li>进行免疫细胞化学染色时，切片应在玻璃小瓶中自由漂浮处理。整个操作过程中需小心避免切片干燥。</li>
 <li>首先用移液管吸除 PBS，立即加入含 0.1% 硼氢化钠的 PBS 新鲜溶液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
 <li>用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，彻底去除气泡，并在封闭液（含 0.5% 明胶及用于制备二抗的动物正常血清 5%，本例 Iba1 免疫染色使用正常山羊血清）中室温孵育 2 小时。</li>
 <li>在封闭液中加入一抗，孵育 48 小时。进行 Iba1 免疫染色时，使用兔抗 Iba1 抗体（1:1000）。</li>
 <li>用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，然后在封闭液中加入与生物素偶联的二抗（1:1000），室温孵育 2 小时。 
 进行 Iba1 免疫染色时，使用山羊抗兔 IgG。</li>
 <li>用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，然后在封闭液中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（1:1000），室温孵育 1 小时。</li>
 <li>用 PBS 漂洗切片 10 分钟，再用 Tris/HCl 缓冲盐水（TBS；50 mM，pH 7.4）漂洗 2 次，每次 10 分钟。为显色，将切片置于含 0.05% DAB 和 0.01% 过氧化氢的 TBS 溶液中（新鲜配制）。当染色呈现深棕色时（见图 1 示例），用 TBS 漂洗终止反应。无论如何，反应时间最长不超过 5 分钟。随后用 TBS 漂洗 10 分钟，再用 PB 漂洗 2 次，每次 10 分钟。</li>
</ol>
3. 透射电子显微镜样品制备
<ol>
 <li>使用细毛刷将切片转移至多孔培养板中的磷酸盐缓冲液（PB）中。在通风橱内配制1%四氧化锇溶液。吸除培养板各孔中的PB，并用细毛刷将切片展平。立即将切片浸入1%四氧化锇溶液中，室温下固定30分钟。</li>
 <li>将切片转移至玻璃小瓶中，用PB漂洗3次，每次10分钟；随后通过逐步提高浓度的乙醇进行脱水处理：35%乙醇浸洗2次，每种50%、70%、80%、90%和95%乙醇各1次，100%乙醇浸洗3次，最后用丙烯酸甲酯浸洗3次。</li>
 <li>配制Durcupan树脂时，将20 g组分A、20 g组分B、0.6 g组分C和0.4 g组分D加入一次性烧杯中，充分混合至颜色均匀，然后倒入铝制称量皿中。如有需要，可将树脂倒入包埋模具中，在55°C烘箱中固化48–72小时，制成树脂块。</li>
 <li>使用经丙烯酸甲酯冲洗过的细毛刷，将切片从丙烯酸甲酯中取出，并浸入Durcupan树脂中，室温下浸渍过夜。</li>
 <li>次日，将铝制称量皿放入55°C烘箱中加热10分钟以软化树脂。用经丙烯酸甲酯冲洗过的毛刷，在ACLAR包埋膜上涂一层薄树脂，将切片平铺其上，再覆盖另一层包埋膜，并在上方均匀放置轻质重物（约2 g，例如玻璃小瓶的塑料盖），以促进树脂均匀分布。将样品置于烘箱中55°C孵育48–72小时，完成树脂聚合。</li>
 <li>聚合完成后，移除切片上方的重物和包埋膜。在双目解剖显微镜下，选取感兴趣的方形区域（约2×2 mm），用剃刀片小心地从膜上切下。</li>
 <li>使用瞬干胶（Superglue）将感兴趣区域粘附于树脂块顶端，并在55°C烘箱中固化1小时。</li>
 <li>为进行切片做准备，用剃刀片将树脂块修整成等腰梯形。</li>
 <li>使用超薄切片机和玻璃刀，去除组织表面的胶水和树脂。在玻璃刀的槽中加入重蒸水，切取数片半薄切片（厚度0.5–1 μm）。</li>
 <li>用完美环将切片转移至SuperFrost载玻片上。将载玻片置于80°C加热板上干燥1分钟。滴加数滴0.1%甲苯胺蓝染液（2 g硼砂和0.2 g甲苯胺蓝溶于200 mL重蒸水中），染色1分钟。用重蒸水冲洗去除多余染液。在光学显微镜下观察切片，可区分染色的组织与树脂（图2）。</li>
 <li>继续切片，直至组织与树脂的边界位于切片中央。请注意，以下操作需要经过训练。将玻璃刀更换为钻石刀，并在刀槽中加入重蒸水。切取银色至银金色的超薄切片（厚度60–80 nm），用细头倒置镊子小心收集于铜网载网上。将载网置于滤纸上干燥。</li>
 <li>为增强反差，可用柠檬酸铅染色超薄切片（0.03 g柠檬酸铅和0.1 mL 10N氢氧化钠溶于10 mL重蒸水中1）。用细头倒置镊子将载网置于一滴柠檬酸铅溶液上，染色2分钟。取出载网，依次在3份重蒸水中轻轻漂洗。最后将载网置于滤纸上干燥，并保存于载网盒中，待电镜观察（图3–6）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="脑组织染色、显微镜图像、细胞密度、组织学、研究研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 光学显微镜下的Iba1染色切片。Iba1的细胞分布仅限于小胶质细胞，表明免疫染色具有特异性。比例尺=100 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="组织学、染色组织切片、显微镜图像、组织-树脂界面、细胞结构研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 光学显微镜下的甲苯胺蓝染色半薄切片。注意组织与树脂之间的边界，该区域在电子显微镜下免疫染色将显示最强信号。
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="细胞超微结构、电子显微镜图像、细胞器、膜、细胞生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 超薄切片显示在电子显微镜水平下Iba1免疫阳性的小胶质细胞胞体及其突起。Iba1阳性的结构成分通过其免疫过氧化物酶-DAB电子致密沉淀物进行识别。比例尺=2 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="电子显微镜下的细胞结构；显微技术，细胞器，详细的细胞解剖结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. 超薄切片显示在电子显微镜水平下，呈现Iba1免疫阳性反应的不同大小和形状的小胶质细胞突起。比例尺=2 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig5.jpg" alt="细胞结构，电子显微镜图像；细胞器可视化；细胞内分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
 图 5. 高倍镜下显示来自图 4 的 Iba1 阳性小胶质细胞突起的超薄切片，可识别其细胞内细胞器。比例尺=1 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="细胞结构，透射电镜图像；超微结构研究，显微技术，细胞生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
 图6. 超薄切片在更高放大倍数下显示Iba1阳性小胶质细胞突起与包括突触在内的邻近神经组织成分之间的超微结构关系。比例尺=1μm。

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种用于免疫电子显微镜的小鼠脑组织制备方案，若严格操作，该方法可在超微结构良好保存与免疫细胞化学检测之间实现最佳平衡。
结合透射电镜（TEM），该方法能够区分缺乏明显特征和鉴定标准的细胞结构。特别是，Iba1 的免疫过氧化物酶-DAB 染色可识别神经组织中微胶质细胞的胞体和突起，并可用于分析其形态学特征、细胞内细胞器以及与其他细胞成分的超微结构关系（图3-6）。此外，本方案可用于分析可溶性或膜结合蛋白在胶质细胞或神经元结构中的超微结构定位，以及这些蛋白与细胞内细胞器的关联情况。事实上，通过本方案结合特异性抗体，我们先前已揭示了5-HT1A和5-HT1B5-羟色胺受体在成年大鼠中缝背核、黑质、苍白球和海马组织中的神经元胞体、树突、树突棘、无髓鞘轴突及内皮细胞中的超微结构定位2。我们还报道了EphA4和EphB2酪氨酸激酶受体在小鼠和大鼠出生后发育期及成年期的海马和大脑皮层中，定位于网格蛋白包被小泡以及不同类型的星形胶质细胞和神经元结构中的超微结构分布3,4,5,6。最后，该方案还可与预包埋免疫胶体金技术联合使用，以分析两种同时标...

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠（Nembutal）</td><td>OVATION Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤纸 315 24 cm</td><td>VWR international</td><td>28331-081</td><td></td></tr><tr><td>*丙烯醛 纯品（&amp;#8805;95%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01680</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠（&amp;#8805;98%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452173</td><td></td></tr><tr><td>*颗粒状多聚甲醛（PFA）（95%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>兔抗Iba1一抗</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>019-19741</td><td>储存于 -20&amp;#x00B0;C，以1:1甘油保存</td></tr><tr><td>生物素-SP标记的AffiniPure F(ab&amp;rsquo;)2片段山羊抗兔IgG（针对Fc片段）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-066-046</td><td>储存于 -20&amp;#x00B0;C，以1:1甘油保存</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-030-084</td><td>储存于 -20&amp;#x00B0;C，以1:1甘油保存</td></tr><tr><td>*四氧化锇 4% 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>环氧丙烷（&amp;#8805;99%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82325</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯一次性烧杯（50 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-291-10</td><td></td></tr><tr><td>铝制称量皿（70 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9261784</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan环氧树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>组织学用DPX封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>明胶处理载玻片</td><td>VWR international</td><td>100241-864</td><td></td></tr><tr><td>ACLAR包埋膜（7.8 mm）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>胶囊模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70150</td><td></td></tr><tr><td>高性能超级胶水</td><td>Corporate Express</td><td>LOC30379</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片用完美捞片环</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>金刚石切片刀 超薄型 45&amp;#x00B0;（2.5-3.5 mm）</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼皮明胶（~45%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">*操作丙烯醛、多聚甲醛和四氧化锇时，必须始终在通风橱中进行，并佩戴腈手套，同时应妥善处理废弃物。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

小鼠脑组织免疫电子显微镜样品制备

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

透射电子显微镜（TEM）在高空间分辨率下对中枢神经系统中小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的亚细胞结构（如树突、树突棘、轴突、轴突终末、胞体）及其细胞内细胞器和细胞骨架进行可视化观察具有极高价值。结合TEM与包埋前免疫细胞化学技术，可有效区分形态特征不明显的细胞成分，并提供识别依据（例如，使用针对小胶质细胞特异性标志物Iba1（离子化钙结合接头分子1；本文所示）的抗体来识别小胶质细胞胞体及突起），还可用于鉴定细胞成分中的神经递质内容（如5-羟色胺能）以及可溶性或膜结合蛋白的超微结构定位（如5-HT1A和EphA4受体）。本文介绍了一种小鼠经心脏灌注丙烯醛固定剂、脑组织取出与切片，以及免疫过氧化物酶-二氨基联苯胺（DAB）染色、树脂包埋和脑组织切片超薄切片的实验方案。完成上述步骤后，免疫染色样本即可用于TEM观察。若严格操作，该技术可在优异的超微结构保存与免疫细胞化学检测之间实现良好平衡。

关键词：透射电子显微镜，TEM，免疫细胞化学，包埋前染色，DAB染色，树脂包埋，超薄切片，小胶质细胞，Iba1，5-HT1A受体，EphA4受体，中枢神经系统，小鼠

我们描述了一种小鼠经心脏灌注、脑组织的取出与切片，以及免疫过氧化物酶染色、树脂包埋和脑切片超薄切片的实验方案。完成这些步骤后，免疫染色的样品即可用于透射电子显微镜观察。

透射电子显微镜（TEM）在可视化小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的亚细胞结构方面极为有用……

本实验的总体目标是制备适用于免疫电子显微镜观察的小鼠脑组织。首先通过灌注固定动物脑组织以完成固定；实验的第二步是切取脑组织并进行切片处理，以用于免疫组织化学染色。该操作流程的第三步是将切片进行脱钙、脱水和包埋。流程的最后一步是切割超薄切片。最终可获得高空间分辨率的结果，显示中枢神经系统不同区域和细胞类型中各种蛋白质的分布情况。大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学与解剖学系Esca实验室的Maria Trombley。今天我们将向您展示一种用于免疫电子显微镜的小鼠脑组织制备方法。在我们的实验室中，利用该方法研究小胶质细胞与突触在发育、经验依赖性可塑性以及衰老过程中的相互作用。接下来我们开始。在小鼠脑组织经心脏灌注固定后，将其置于约10毫升的甲醛溶液中，在4°C条件下后固定2小时。随后在4°C条件下，用冰浴的1×PBS溶液洗涤脑组织，每次10分钟，共洗涤3次，并使用振荡器进行振荡。立即对脑组织进行横切，切成50微米厚的切片。使用细毛刷将选定的切片转移至装有4°C XPBS的玻璃小瓶中。将剩余切片置于低温保护剂中，在-20°C下可保存数年而不发生改变。每个玻璃小瓶中最多处理10片游离切片用于染色。使用移液管将一份 XPBS 替换为新鲜的含 0.1% 硼氢化钠的 PBS 溶液，更换溶液时动作要迅速，以避免组织切片干燥。孵育 30 分钟后，用一份 XPBS 溶液冲洗切片，每次 10 分钟，共冲洗 3 次。注意去除所有气泡，然后加入含 0.5% 明胶和 5% 正常血清的 XPBS 溶液进行封闭，所用血清应与后续将使用的二抗相匹配。孵育2小时。加入用封闭液稀释的一抗。孵育48小时。用一倍浓度的XPB S溶液冲洗3次，每次10分钟。随后加入用封闭液稀释的生物素标记的二抗，每轮孵育2小时。之后再次用一倍浓度的XPBS溶液冲洗3次，每次10分钟，操作同前。用封闭液稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶室温孵育1小时。用1倍PBS缓冲液漂洗切片1次，再用1倍TBS缓冲液漂洗2次，每次10分钟。为显色，将切片与新鲜配制的含0.05% DAB和0.01%过氧化氢的1倍TBS溶液孵育。当染色呈现明显的深棕色或反应持续五分钟时，用一份XTBS冲洗切片以终止反应。然后用一份XTBS冲洗一次，再用一份x PB冲洗两次，每次10分钟。在通风橱中，使用细刷将切片转移至装有一份XPB的多孔培养板中。使用细刷从一个孔中取出PB，立即将切片展平。在进入下一孔之前，加入含1%四氧化锇的PB溶液，室温孵育30分钟。将锇酸处理的切片转移至玻璃小瓶中。用一份XPB缓冲液冲洗三次，每次10分钟。将切片置于浓度递增的乙醇中进行脱水。然后按照本方案文本部分所述使用丙烯酸氧化物处理。使用经丙烯酸氧化物冲洗过的细毛刷，将切片转移至新配制的dupant树脂中。为进行过夜浸渍，将盛有切片的培养皿置于55摄氏度烘箱中10分钟。为

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