斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

本视频展示了对受精后1至3天的斑马鱼胚胎进行视网膜以及附着视网膜色素上皮（RPE）的视网膜的显微解剖。所有操作均可使用精细镊子和常规实验室耗材完成。在标准体视显微镜下进行视网膜解剖时，通过刷拭动作以及RPE与培养板表面的黏附作用，将单层RPE去除并剥离。

对于附有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜解剖，需在解剖前通过胚胎碾压及洗涤去除培养板的黏附特性。为保持RPE完整，需小心提起该组织，从而有效分离脉络膜和巩膜与附有RPE的视网膜，随后使用化学蚀刻的钨针去除晶状体。该解剖方法可获得完整的视网膜组织，已成功用于研究斑马鱼视网膜及视网膜色素上皮的组织特异性RNA表达谱。

您好，我是来自普渡大学生物科学系UFE Leon教授实验室的Li Jang。今天我们将向您展示如何解剖斑马鱼胚胎的眼部组织。在我们的实验室中，利用该实验步骤来研究调控眼睛发育的基因网络。

那么，让我们开始吧。八、在显微解剖之前，准备好以下溶液：E3 培养基、过滤除菌的林格氏液以及五倍正常浓度的氢氧化钠。

接下来，对钨针进行化学蚀刻。将一个小烧杯用黏土固定在培养皿中，以方便操作并防止氢氧化钠溢出。将一个标准回形针固定在烧杯侧壁上。

将五份普通氢氧化钠倒入烧杯中，直至回形针接触到氢氧化钠。将直流电源的负极连接到回形针，正极连接到一段短钨丝的一端。用一个直径为四毫米的黏土小球包裹钨丝的另一端，并将此端浸入氢氧化钠溶液中。

将电压升高至约三伏，在氢氧化钠溶液中以每秒上下移动一次的频率浸入和提出金属丝，持续约10分钟。当黏土球从连接正极的金属丝另一端脱落时，暴露在氢氧化钠中的钨丝会逐渐变细，形成尖锐的针状。用任氏液或E3溶液冲洗该尖针以去除盐沉积物，并用胶带或针头夹持器将针固定在木质涂布棒上，以便于操作，为胚胎解剖做准备。

在繁殖前一晚，按照标准方案饲养成年超级鱼。将亲鱼成对放入静水繁殖缸中，并用隔板分隔。次日早晨打开房间灯光后，移除隔板，每隔半小时让亲鱼交配一次，每次交配持续10分钟，每次交配后将鱼分开。

将每次交配获得的胚胎分别置于E3培养基中，在28摄氏度条件下培养。在受精后10至12小时对胚胎进行分期，并在特定时间点解剖前立即重新确认发育阶段。解剖时使用Falcon 60 mm × 15 mm的聚苯乙烯培养皿。

新的未使用培养板对视网膜色素上皮（RPE）组织具有固有的黏附性，可持续约20分钟，有助于在视网膜解剖过程中去除RPE。如果需要保留附着RPE的视网膜，则可通过将两个胚胎完全碾碎后置于含有林格液的培养板中，并在解剖前静置30分钟，随后用新鲜林格液充分洗涤，以消除该黏附特性。所有精细解剖操作均在Olympus SC X 16显微镜下使用1倍物镜，以约5至8倍的放大倍数进行。

使用杜蒙镊子或化学蚀刻的钨针，将显微镜载物台预热至28摄氏度。为尽量减少温度波动对开始视网膜分离的影响，将处于特定发育阶段的胚胎转移至已准备好的Falcon 60 mm × 15 mm培养皿中的5毫升任氏液中（该培养皿的制备方法如前述无色素上皮视网膜分离所述），用镊子尖端迅速切断头部及部分前躯干，移除斑马鱼身体。接着，用大头针将头躯干部分的后端固定在培养皿上。用辅助镊子从额部前端开始，沿背侧打开头部。

取出脑组织，使眼睛内侧暴露并朝上，以便进行后续操作。为分离视网膜，使用镊子顶端轻轻刷拭朝上一侧眼睛暴露的视网膜色素上皮（RPE），直至观察到通向视网膜的小开口。持续进行刷拭和剥离操作，直至几乎完全暴露视网膜的内侧部分。

在采用眼球朝向培养皿的方法处理视网膜时，避免刮擦和穿刺暴露的视网膜，以去除视网膜侧的视网膜色素上皮（RPE）。持镊子与培养皿表面呈约45度角，轻轻刷动眼球。对于附着在锯齿缘区域相对较牢固的RPE，可通过将已分离的RPE部分固定在培养皿上，以便进行解剖并将其去除。

然后轻轻抬起视网膜，利用培养皿表面的黏附特性清除残留的视网膜色素上皮（RPE），并去除晶状体。注意避免损伤视网膜细胞，这些细胞也会轻微黏附于培养皿表面。若晶状体无法通过滚动脱离，可使用刻蚀钨针在晶状体表面以旋转动作将其分离。

开始进行附有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜解剖时，使用如RPE附着视网膜解剖所述方法准备的Falcon 60 mm × 15 mm培养皿。将处于特定发育阶段的胚胎转移至5 mL林格溶液中。剪下头部及部分前段躯干。

快速移除斑马鱼身体，操作方法同前。将头躯干部分的后端固定在培养皿上。用辅助镊子从额前部开始，从背侧打开头部。

取出脑组织，使眼睛的内侧暴露并朝上。若需使用镊子进行后续操作，应从眼睛的后外侧轻轻提起，并向眼前侧滚动。视网膜色素上皮（RPE）层外侧的脉络膜和巩膜组织与皮肤相对紧密地附着，可通过小心地将眼球向眼前侧滚动，将其大部分剥离。

在暴露眼睛外侧且眼球仍与皮肤相连以进行视网膜分离时，使用钨针去除晶状体。去除视网膜色素上皮（RPE）或带有RPE的视网膜后，可将分离的样品收集于RNA酶抑制剂的微量离心管中，用于后续的RNA表征分析。

此处展示了一次成功的、不含视网膜色素上皮（RPE）的视网膜分离，视网膜完整性得以保持，表现为视网膜表面完整。相应的组织学切片也显示，视网膜结构保持得非常好。特别是光感受器层与RPE之间细胞外基质的保存尤为完好。

成功的带有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜分离表现为完整且连续的RPE层。相应的组织学切片显示，视网膜细胞和RPE细胞均保持良好形态。从分离的视网膜中提取的总RNA质量较高。

这由生物分析仪分析获得的电泳图谱和凝胶图像所示。基线平坦，18S 和 28S 核糖体峰完整。RNA 完整性编号通常大于 9.8。

我们刚刚向您展示了获取斑马鱼胚胎视网膜（含和不含视网膜色素上皮）的显微解剖步骤。在进行该操作时，需特别注意视网膜解剖中最关键的步骤：水龙头尖端的刷动操作以及组织的卷曲动作。对于去除残留的视网膜色素上皮，我们发现解剖过程中将肘部支撑在椅子的可调节扶手上，可显著稳定手部动作。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。