Name: 小鼠胚胎的龙文化，一个系统来评价分枝的分子机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习小鼠胚胎肺器官培养技术，用于研究肺发育过程中的上皮-间充质相互作用。该方法通过液体气液界面培养，可观察FGF9处理对肺分支形态发生的影响，为发育生物学和再生医学研究提供可靠实验手段。

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本研究得到了Saban研究所博士前奖项（PMDM）以及美国国立卫生研究院RO1 HL75773基金（DW）的支持。

器官培养是一种研究基因和蛋白质表达的非常有用且多功能的技术。这些 离体 培养方法可作为初步检测手段或与其他方法相互补充 在体 研究。
1. 胚胎肺组织分离
<ol>
 <li>根据美国国立卫生研究院（NIH）和实验动物福利办公室（OLAW）指南，于交配后第11.5或12.5天（E11.5-12.5）通过CO2麻醉法处死妊娠小鼠。将动物放入密闭舱内，通入100% CO2。待动物失去意识后，加大CO2气流，必须确保动物达到临床死亡。</li>
 <li>以下所有步骤均需在超净台内的无菌条件下完成。从妊娠雌鼠体内取出子宫。操作时将妊娠雌鼠仰卧放置，并用70%乙醇喷洒体表。在腹部做切口，固定动物后肢并向上牵拉皮肤以暴露腹腔，切开腹膜腔后取出子宫。</li>
 <li>将子宫置于装有冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）的50 ml锥形管中，以冲洗去除血液，并轻轻振荡2分钟。</li>
 <li>随后将子宫转移至培养皿中，在体视解剖显微镜下使用弹簧剪剪开子宫壁，释放胚胎。用带孔勺子收集胚胎，并将其置于含有HBSS、预冷的新培养皿中，放置于冰上。</li>
 <li>在体视解剖显微镜下，于含有冷HBSS的培养皿中逐个分离胚胎肺组织（图1）。</li>
 <li>使用无菌移液管将分离得到的胚胎肺组织转移至另一含有HBSS的培养皿中，置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 胚胎肺组织培养
<ol>
 <li>在 Nunclon 聚苯乙烯培养皿中，每孔加入 500 微升至 1 毫升添加了 50 单位/毫升青霉素-链霉素的 D-MEM/F-12 培养基。</li>
 <li>将 Nuclepore 聚碳酸酯核孔膜置于培养基上方。放置 Nuclepore 聚碳酸酯核孔膜时，应确保光面朝下接触培养基，粗糙面朝上。</li>
 <li>使用无菌移液管将解剖好的胚胎肺组织置于 Nuclepore 聚碳酸酯核孔膜上。</li>
 <li>用镊子调整胚胎肺的位置。置于滤膜上的胚胎肺应保留完整的气管，并使气管保持平直状态，从而确保所有肺组织内部压力一致。</li>
 <li>将 Nunclon 聚苯乙烯培养皿放入细胞培养箱中，进行所需时间的培养（图 2）。</li>
</ol>
3. 材料
1. 胚胎全肺组织的分离
<ol>
 <li>用于实验的妊娠期定时小鼠（C57BL6 野生型或转基因型），于交配后第 11.5 至 13.5 天（E11.5–13.5）处死。</li>
 <li>不含氯化钙、氯化镁或硫酸镁的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体状态（Invitrogen，Carlsbad，CA），添加 50 单位/毫升青霉素-链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）。HBSS 在开封前室温保存，开封后置于 4°C 保存。青霉素-链霉素分装后于 -20°C 保存。</li>
 <li>体视解剖显微镜（Leica，Wetzlar，德国）。</li>
 <li>解剖工具，包括 Dumont 镊子、精细虹膜剪（直头）、Noyes 弹簧剪和 Moria® 勺（带孔）（Fine Science Tools，Foster City，CA）。</li>
</ol>
2. 胚胎全肺培养
<ol>
 <li>杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（D-MEM/F-12）(1X)，液体，1:1，含 L-谷氨酰胺，不含 HEPES 缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA），添加 50 单位/毫升青霉素-链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）。将 DMEM/F-12 瓶避光保存（例如用铝箔包裹），并于 4°C 储存。将青霉素-链霉素分装后于 -20°C 保存。</li>
 <li>Nuclepore 聚碳酸酯径迹蚀刻膜，8.0 µm，13 mm（Whatman Nuclepore Track-Etch 膜（Whatman，Florham Park，NJ）。</li>
 <li>Nunclon 聚苯乙烯培养皿（带盖），4 孔（Rochester，NY）。</li>
 <li>一次性移液管，无菌（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="胚胎发育阶段，E12.5，示意图：肢体去除、器官识别、咽部、气管分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. E12胚胎肺的解剖。（A） 从右侧观察的E12.5全胚胎。（B） 胚胎的右前肢已被移除。（C） 左手持镊子固定胚胎，使其在培养皿中保持稳定。箭头指示解剖切面。（D） 胚胎肺位于心脏（已移除）后方和脊柱前方。此图显示皮肤和心脏移除后的肺组织。（E） 咽部的移除使完整的肺组织得以从胚胎中分离。（F） 多余的咽部组织和食管已被修剪去除。图中显示的是带有完整气管和喉部的E12.5胚胎肺。（Cr）头侧叶，（Med）内侧叶，（Ca）尾侧叶，（Acc）副叶，（Le）左侧叶。
<img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="肺类器官在48小时内生长情况，对照组与FGF9处理组；显微镜图像显示结构变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. FGF9促进体外培养肺组织中间充质的扩展和上皮的扩张。 (A-C) E12.5期肺组织在无FGF9条件下培养48小时。注意分支数量增加。(D-F) E12.5期肺组织在含FGF9条件下培养48小时。可见上皮和间充质在培养24小时后即出现扩张(E)。培养48小时后(F)，对上皮的影响更为显著。比例尺：A-F 400 μm 4。
本实验方法的完整文字方案可在 <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">Springer Protocols</a> 中获取。

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

小鼠胚胎肺培养：一种评估分支分子机制的体系

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

肺的原始特化、分支形态发生以及多种肺细胞谱系的形成，需要肺内胚层与其周围间充质和间皮之间的特异性相互作用。研究表明，肺间充质是驱动肺分支形态发生的诱导信号来源。上皮-间充质-间皮间的相互作用在胚胎肺形态发生过程中亦至关重要。早期胚胎肺器官培养是一种研究上皮-间充质相互作用的非常有效的体系。在此体系中（排除母体影响和血流干扰），上皮和间充质的形态发生过程可在易于调控的特定条件下进行。更重要的是，该技术可直接在无血清、化学成分明确的培养基中完成。通过外源表达蛋白、重组病毒载体和/或转基因小鼠品系分析、反义RNA以及RNA干扰介导的基因敲低等方法，可实现基因功能的获得与缺失研究。

早期胚胎肺器官培养是研究上皮-间充质相互作用的非常有用的体系。在此体系中，上皮和间充质的形态发生过程均能在可被轻易调控的特定条件下进行。

肺脏原始特化、分支形态发生以及多种肺细胞谱系的形成需要特定的相互作用……

本视频演示了一种小鼠胚胎肺组织的分离与培养方法。该操作首先在胚胎发育第11.5天（E 11.5）或第12.5天（E 12.5）获取胚胎，随后打开胚胎体腔并取出肺组织。随后将肺组织置于液-气界面进行培养，并在培养后孵育。使用体视显微镜可观察到胚胎肺间充质和上皮在特定处理下的生长与分支变化。您好，我是David War Burton。我负责洛杉矶班研究研究所儿童医院的发育生物学与再生医学项目。我是Jan Carro，沃伦·伯顿博士实验室的高级博士后。今天我们将向您展示一种分离小鼠胚胎肺并将其置于器官培养中的技术。该技术源于大约 20 年前南加州大学牙科学院 Tina Jaco Halkin 和 Pablo 提出的最初描述。我们在实验室中采用此方法研究肺的分支形态。现在让我们开始。在产后第11.5天或12.5天，将一只经二氧化碳安乐死的定时妊娠小鼠置于超净工作台内，仰卧位。用70%乙醇喷洒小鼠，然后在腹部做一切口。然后握住动物的后肢，向上拉扯去除皮肤。切开腹腔并取出子宫。将子宫放入盛有冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的50毫升锥形管中，轻轻摇动两分钟以洗去血液。接下来，在体视解剖显微镜下将子宫转移至培养皿中。使用弹簧剪剪开子宫壁以释放胚胎。然后用带孔勺收集胚胎，并将其置于含有HBSS的培养皿中，置于冰上。继续在体视解剖显微镜下操作，开始解剖胚胎肺。首先将胚胎置于其左侧。用镊子夹住右前肢，并用左手持镊固定。从肢体开口处开始切割胚胎并去除皮肤。此步骤将有助于观察内部器官，并在下一步中定位心脏和肺。移除心脏。胚胎的肺位于心脏后方、脊柱前方。接下来，将完整的肺从胚胎上分离。然后去除多余的组织和食管。肺组织取出后，使用无菌移液管将其转移至含有冰上预冷的 HBSS 的培养皿中。向无克隆级聚苯乙烯培养皿的每个孔中加入 0.5 至 1 毫升添加了青霉素-链霉素（50 单位/毫升）的 D-M-E-M-F12 培养基。随后将一张核孔聚碳酸酯膜置于培养基表面，光滑面朝下，粗糙面朝上。使用无菌移液管将解剖好的胚胎肺放置在核孔聚碳酸酯膜上。在体视显微镜下调整胚胎肺的位置。胚胎肺应保留完整的气管，并如图所示将其置于平直位置。这可确保所有肺组织具有相同的内部压力，随后将培养皿转移至细胞培养箱中，在所需时间内进行培养。此处，E12.5 胚胎肺组织在有或无 FGF nine 的条件下培养。FGF nine 属于成纤维细胞生长因子家族，可诱导体外培养 48 小时后肺组织中间充质的扩展以及上皮的扩张。在缺乏 FGF 九的情况下，可观察到分支增加。这些图像为在体视显微镜下拍摄的胚胎肺组织照片。相比之下，在含有 FGF 九的条件下培养 48 小时的肺组织表现出上皮扩张和管状结构。培养24小时后。48小时后，对上皮的影响更加显著。因此，我们刚刚向您展示了如何从胚胎小鼠肺组织制备器官培养样本。进行此操作时，重要的是要记住尽快将肺组织从胚胎中取出，以减少组织降解。感谢观看，希望您觉得这项技术有用。祝您的实验顺利。

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