Name: 超声引导下显微注射到小鼠前脑在子宫内在E9.5 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解超声引导下显微注射技术在小鼠前脑发育研究中的应用。该方法利用高频超声成像在胚胎期E9.5将逆转录病毒载体精准递送至神经发生前的生发区细胞，实现基因表达调控，为发育神经科学研究提供重要工具。

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第1部分：准备手术区域
<ol>
<li>若使用生物危害性试剂（例如逆转录病毒载体），手术应在II级生物安全柜（BSC）内进行。超声背向散射显微镜（UBM）应放置在BSC旁边，换能器置于BSC内部，并由特制手术台上的电机控制支架固定。构建视频中所示手术台所需的组件已在线列出。该清单连同手术台多个角度的图像（可应要求提供），应足以支持完成构建。</li>
<li>剖腹手术（即切开腹腔以接触内脏器官的外科手术）的切口开启与关闭通常在带有塑料背衬的吸水垫上进行。手术前，所有必要器械（如剃刀、手术剪、镊子、已装好自动夹施夹器等）和材料（如磷酸盐缓冲液PBS、缝合线、麻醉剂、小鼠固定装置及覆盖板等）均应灭菌并放置于手术区域。尽量缩短切口开放时间对于提高手术成功率至关重要。所有动物操作均应佩戴经MB-10溶液或同等效力消毒剂处理过的无菌手套，并根据需要定期重复消毒，以确保手套始终处于无菌状态。</li>
</ol>
第2部分. 小鼠麻醉
<ol>
<li>用1 cc注射器吸取麻醉液，其中包含1份戊巴比妥钠（Nembutal，50 mg/ml）与4份经滤膜过滤灭菌的25 mg/ml硫酸镁PBS溶液。最终得到的溶液含戊巴比妥钠10 mg/ml和硫酸镁20 mg/ml。每只小鼠应单独称重，并按每公斤体重注射90 mg戊巴比妥钠的剂量给药（例如，一只28 g的小鼠需注射250 μL）。</li>
<li>在妊娠小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5，可根据需要使用其他时间点）时，将麻醉剂注射至其腹腔（腹腔内注射，IP），穿刺需穿透皮肤和腹肌。等待8–12分钟，直至小鼠失去反应。通过动物体位松弛以及对尾部和脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。用指甲轻轻夹捏皮肤极为敏感，若对此无任何反应，则表明动物已充分麻醉。需注意，即使对尾部和脚趾夹捏完全无反应的动物，在初次手术切口时仍可能轻微抽动。但这是反射性反应，并不代表麻醉不足。应使用石油基眼用软膏涂抹小鼠眼部，以防手术期间角膜干燥。</li>
<li>在等待小鼠麻醉的过程中，设置好手术区域和超声设备。由于使用逆转录病毒或慢病毒需在生物安全二级（BSL2）条件下操作，如前所述，病毒注射应在II级生物安全柜中进行。此外，所有与病毒接触的溶液和一次性材料均须用10%次氯酸钠溶液（漂白剂）去污染。手术器械和超声设备应使用MB-10（<a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a>）或所在机构所采用的等效消毒液进行处理。</li>
</ol>
第3部分. 胚胎暴露
<ol>
<li>如果条件允许（取决于动物设施的限制和可用空间），建议将手术准备区与手术区设在不同位置，以最大限度降低动物间的交叉污染风险。开始手术时，将动物仰卧置于无菌吸水表面上，用70%乙醇彻底清洗腹部区域。可采用更广泛的术前处理（例如，交替使用碘伏和70%乙醇多次清洗），但根据我们的经验，此类啮齿类动物存活手术并不需要。使用双面剃刀，在约1英寸宽、1.5英寸长的腹部区域剃除毛发，剃毛时应以大约45°角进行短促快速的动作。必须妥善处理手术区域，但避免过度湿润，以免导致动物不必要的体温下降，甚至可能引发低体温症。</li>
<li>使用精细手术剪，先在皮肤上做一条1英寸的纵向切口，然后切开动物的腹肌（切断连接皮肤与肌肉的结缔组织有助于完成第二步切口）。在整个操作过程中，应注意确保手术器械始终保持无菌状态，并根据需要进行消毒处理（例如，当器械尖端接触到非无菌材料时）。</li>
<li>使用镊子小心地拉出子宫角，记录每侧胚胎的数量。在保留两个相邻胚胎暴露在外的同时（具体选择哪两个胚胎取决于每侧的排列情况），将大部分子宫角重新放回动物体内。在此过程中，每次仅暴露两个胚胎，并使其浸没于PBS中，同时保持母体处于仰卧位。</li>
<li>将动物仰卧放入聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）固定装置中，手术期间将保持此位置（图1A）*。随后，将一个10 cm组织培养皿**（使用前应以MB-10消毒）通过一对镊子略微穿过绿色硅胶膜（使用L RTV硅橡胶基质和固化剂制备；Dow-Corning产品编号分别为3142761和2156946）缓慢下放至母体上方。当下放培养皿时，用镊子夹住待注射的两个胚胎之间的子宫组织，并轻轻将其拉过膜孔。同时，将培养皿完全下压至固定装置上，并插入图钉以固定其位置。然后向培养皿中加入预热至37°C的PBS，完全覆盖胚胎。</li>
<li>将含有动物及暴露胚胎的注射平台置于超声探头下方（图1A），以实现通过子宫壁对暴露胚胎的实时成像（图1B）。随后，使用电机控制将探头缓慢下放至PBS浴液中，直接位于待成像胚胎上方。当探头距离胚胎约2–3 mm时即可获取图像。在探头来回振荡采集图像的过程中，必须特别注意确保探头头部不会触碰胚胎。</li>
</ol>
* 手术过程中用于固定母鼠的支架可由机械加工车间轻松制作。该支架应包含一个宽大的有机玻璃底座，并在其顶部粘接两块有机玻璃侧板，侧板之间留有足够空间（宽度需能容纳小鼠仰卧）。侧板上应加工出凹槽，并用黑色石蜡（例如解剖盘中使用的石蜡）填充。该石蜡将用于固定图钉，以固定盛有PBS的培养皿，使胚胎在注射过程中浸没于PBS中。

** 10 cm 细菌培养皿的底部中央应打一个孔（直径约 2 cm）（可使用重型便携式打孔器和 13/16th 英寸圆形冲模： <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm</a>此外，应在中心孔两侧约1.5 cm处用火焰加热的针头烧出两个小孔（当然也可使用钻头制备）。这些小孔随后需涂抹真空脂，作为固定培养板的图钉穿过并插入黑色石蜡的位置。涂抹真空脂的目的是防止PBS泄漏。

第4部分：将病毒载入显微注射针
<ol>
<li>使用内径为1 mm的拉制玻璃毛细管，通过磨出斜面制备显微注射针。针尖的锋利程度至关重要，若针尖不够锋利，可能严重阻碍对子宫壁和羊膜囊的穿刺，从而导致实验失败。将 sharpened 针插入移液器套管中，该套管通过导管连接至安装在手动推注/回吸泵上的25 μL微量注射器（也可使用其他设备来控制针头的加载与释放，但视频中展示的是此装置）。为获得最佳响应性（避免空气系统带来的膨胀与压缩），微量注射器、导管和针头应完全充满矿物油。</li>
<li>在加载针头前，需确保从注射器到针尖的整个系统中无气泡。然后在开始加载病毒前，先回吸一小段空气泡（长度为1–2 mm）进入针头。此气室有助于将病毒与矿物油分隔开。待注射的病毒原液应含有终浓度为0.08 mg/mL的polybrene（有关病毒制备的更多信息，请参见参考文献1、2）。需注意，浓缩的逆转录病毒原液通常含有大量颗粒物，其中包含大部分具有感染性的成分，因此若进行过滤会导致滴度下降5至10倍。此外，根据制备方法的不同，病毒原液可能因裂解的包装细胞释放的基因组DNA而变得黏稠（尤其在使用293细胞制备MLV/VSV假型病毒时更为明显）。若病毒分装液黏稠，应加入少量DNAse I以降低其黏度，否则将极难加载针头。取8–10 μL病毒液滴加于无菌的Parafilm膜上，以备加载针头。随后使用回吸泵小心地加载针头，并注意避免堵塞。将加载好的针头置于注射区域的显微操作器位置，操作时需小心，避免针头触碰胚胎或超声探头而折断。需注意，若因某些原因需在注射前较长时间提前加载针头，可在针尖吸入少量空气，注射前再将其排出。此气室可防止病毒液在针尖处干燥（一旦发生干燥，该针头几乎无法继续使用）。</li>
</ol>
第5部分. 超声引导下的病毒注射
<ol>
<li>超声探头生成的实时图像显示在视频监视器上，可用于引导显微注射针进入胚胎。利用该系统，可在 E8.5 时将病毒注射至羊膜腔，或在 E9.5–E11.5 期间注射至羊膜腔或脑室系统（图1B）。这是整个操作中最困难的部分，需要大量实际操作经验才能掌握（通常需 5–20 小时，具体取决于研究人员）。针尖在超声图像中表现为屏幕上最亮的点，并应随探头位置的调整（通过 y 和 z 平面上的电机控制以及 x 平面上的手动控制）而同步移动。至关重要的是，探头的振荡方向必须与针的长度方向平行，以确保在调整位置进行胚胎注射时，针尖始终位于成像平面内。</li>
<li>应调整胚胎位置，使目标区域（本例中为前脑脑室）清晰可见，并使注射路径中尽可能少地穿过子宫组织。此外，切勿通过胎盘进行注射。当目标脑区与注射针推进方向对齐后（通过显微操作仪上的旋钮调节），针尖应刚好接触子宫壁，随后快速短促地向前刺入以穿透组织。采用类似方法依次穿透羊膜腔和脑组织。在某些情况下，经验丰富的研究人员可一步到位直接刺入脑室，尤其是在针尖非常锋利时。移动探头、注射针以及通过移动台上的母鼠来调整胚胎位置的操作技巧，均需通过实际练习掌握。</li>
<li>完成所需数量胚胎的注射后，使用 5.0 丝线缝合腹壁。缝合技术并非本手术特有。最后，使用兽用自动夹钉器在皮肤表面沿肌肉层缝合处进行夹合固定。不建议缝合皮肤，因为小鼠会啃咬拆除缝线。应在切口部位给予镇痛处理，以减轻小鼠苏醒后所经历的疼痛。推荐沿切口部位每隔几毫米皮下注射 0.25% 布比卡因溶液（0.8 ml/kg，或 2 mg/kg）。</li>
<li>在小鼠恢复期间，将其轻柔地放置于铺有吸水纸的洁净笼内，并放入凝胶包（以促进喂食和补水）。将笼子置于设定为 37°C 的滑动加热器上，以维持体温。苏醒后，将小鼠与凝胶包一同转移至洁净笼中，并放回动物架。</li>
<li>术后次日检查小鼠是否存在阴道出血、腹部收缩和/或整体状态不佳的表现，这些均为流产的征象。若出现上述情况，应立即实施安乐死。毛发整洁、整体健康状态良好则表明手术恢复成功。注射后的胚胎可在胚胎期或出生后处死并用于进一步分析。若病毒表达报告基因（如人源碱性磷酸酶 PLAP 或 GFP），染色可显示病毒感染阳性区域（图1C）。</li>
</ol>
代表性结果
注射后的胚胎可在注射后1至2天直至成年期间的任意时间点处死取材。如果病毒表达报告基因（如PLAP或GFP），则可通过报告基因的表达来鉴定病毒感染的细胞及其克隆后代。例如，图1C显示的是出生后脑组织切片，该脑组织曾被病毒感染 在子宫内 在E9.5时使用表达PLAP的逆转录病毒载体进行感染。经组织化学染色后，被感染的细胞呈现为紫色簇状结构。除了用于识别病毒感染的细胞外，报告基因的表达还可用于观察细胞形态与位置，以及基因表达状态。
 <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="使用超声波和显微注射装置进行基因编辑的过程；小鼠胚胎超声图像；新皮层组织学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在 E9.5 小鼠前脑脑室中进行病毒注射。A. 将麻醉后的动物放置在注射台上。两个胚胎将被暴露并置于超声探头下方所示位置（箭头）。充满病毒的显微注射针位于胚胎附近，并与超声探头对齐。B. 来自 E9.5 小鼠胚胎的实时超声图像的屏幕截图。V，脑室；AS，羊膜囊；UW，子宫壁。C. 在 E10.5 时，胚胎被注射了表达 PLAP 的病毒。对 PLAP 进行组织化学染色，以显示病毒感染的位置。

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

使用超声引导进行病毒注射的时间范围为胚胎发育第8.5天至第11.5天（E8.5–E11.5）。在E8.5时仅可注射羊膜腔，而在E9.5至E11.5期间则可同时注射羊膜腔和脑室系统。若操作正确，通过超声引导将病毒颗粒注入脑室系统后，病毒可接触并感染脑室系统内壁的细胞，从而感染前脑（新皮层、基底神经节、间脑、眼等）、中脑和后脑的多种结构（图1C）。注入羊膜腔的病毒则可接触胚胎外部的细胞。除了病毒外，超声引导还可用于向发育中的胚胎注射细胞。因此，该技术在实验设计中提供了多种可选参数（发育时间点、靶向结构、病毒或细胞类型）。
注射的病毒或细胞必须表达报告基因，以便于识别被感染或注射的细胞。传统上，曾使用人胎盘碱性磷酸酶（PLAP）或GFP作为报告基因。根据经验，我们发现PLAP是一种非常有用的报告基因，因为PLAP的组织化学和免疫组织化学染色均能产生清晰且明确的单细胞染色，便于分析细胞形态和位置，并进行克隆分析。由于病毒表达的GFP信号可能较弱，因此GFP作为报告基因在组织染色方面可能并不理想，但如果需要通过荧光激活细胞分选（FACS）获取单个细胞，则GFP仍具有应用价值。

<table><tbody><tr><td>显微操作仪 </td><td>Narishige International</td><td>91084361683D</td><td></td></tr><tr><td>HI-7 移液管架</td><td>Narishige International</td><td>9108436141</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 支撑臂</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436206</td><td></td></tr><tr><td>IP铁底板</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436167</td><td></td></tr><tr><td>移液器 holder 的 CI-1 连接器</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436257</td><td></td></tr><tr><td>内径1 mm的管子</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>911013</td><td></td></tr><tr><td>三通鲁尔锁止旋塞阀（每包10个）</td><td>卡尔·蔡司股份有限公司</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>电机控制器，2-4 轴</td><td>Newport Corp.</td><td>860-c2</td><td></td></tr><tr><td>操纵杆</td><td>Newport Corp.</td><td>PMC200-J</td><td></td></tr><tr><td>微米调节器</td><td>Newport Corp.</td><td>ADAPT-BM17-375</td><td></td></tr><tr><td>电动驱动器</td><td>Newport Corp.</td><td>CMA-25CC</td><td></td></tr><tr><td>电缆组件</td><td>Newport Corp.</td><td>860I-10</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 平移台</td><td>Newport Corp.</td><td>UMR8-25</td><td></td></tr><tr><td>微米</td><td>Newport Corp.</td><td>BM17-25</td><td></td></tr><tr><td>基板</td><td>Newport Corp.</td><td>M-PBN8</td><td></td></tr><tr><td>内侧安装支架</td><td>Newport Corp.</td><td>EQ80-I</td><td></td></tr><tr><td>外侧安装支架</td><td>Newport Corp.</td><td>EQ80-E</td><td></td></tr><tr><td>手动灌注/抽吸泵</td><td>Stoelting 公司</td><td>51222</td><td></td></tr><tr><td>25 &amp;mu;l 微量注射器</td><td>Stoelting 公司</td><td>51113</td><td></td></tr><tr><td>24&quot;x12&quot;x0.5&quot; 公制板</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-640</td><td></td></tr><tr><td>自调节脚垫组</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT34-841</td><td></td></tr><tr><td>条形透镜架</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-669</td><td></td></tr><tr><td>直角支架夹</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT53-357</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; 职位持有者</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-646</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#8221; 钢柱</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT36-499</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;#8221; 钢柱</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT36-503</td><td></td></tr><tr><td>12/pk 内六角螺钉，1/4-20 × 1/2&quot;</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-644</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>载玻片加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>多种选择</td><td></td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃，外径：1.0 mm，内径：0.05 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>1cc 胰岛素注射器 U-100 27G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>自动夹施加器</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>9毫米自动夹（用于闭合皮肤切口）</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>5.0 丝线缝合线</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-1173</td><td></td></tr><tr><td>无菌润滑眼膏</td><td>Fera 药物公司</td><td>48102-012-35</td><td></td></tr><tr><td>MB-10 或同等效力的消毒剂</td><td>Quip labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 次氯酸钠溶液</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;子宫内存活手术可实现对小鼠发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于在早期胚胎发生阶段子宫壁不透明，将显微注射针靶向胚胎特定部位的能力受到极大限制。幸运的是，高频超声成像能够生成实时图像，可用于引导显微注射针进入目标胚胎区域。本文描述了利用此类成像技术，在胚胎第9.5天（E9.5）将逆转录病毒载体注射至小鼠前脑脑室系统的方法。该方法通过剖腹手术暴露子宫角，并使用特制的培养板，使宿主胚胎在成像和注射过程中保持在生理盐水中。成功的手术通常可使大部分或全部注射胚胎存活至后续任意关注的时间点（胚胎期或出生后）。文中所述原理经轻微调整后，亦可用于在胚胎第8.5天（E8.5）将病毒颗粒注射至羊膜腔（从而感染尚未闭合的神经管全长，从前端至后端），或在胚胎第10.5至11.5天（E10.5/11.5）注射至脑室系统。此外，在神经发生中期（约E13.5），超声成像还可用于引导将病毒或细胞移植直接注射至特定脑区。利用超声成像引导小鼠子宫内注射是一种极为强大的技术，可实现对小鼠胚胎的分子与细胞水平操控，而这些操作若无该技术则将极为困难甚至无法实现。&quot;&gt;&quot;以下超声背向散射显微镜之一可用于本实验。尽管视频中使用的是 Paradigm-Medical 公司的 P40 型号，但该型号目前已不再 commercially available，已被 P60 取代；P60 价格相近，且适用于相同的应用。所述用于载物台构建的附加材料适用于 Paradigm-Medical 设备。Vevo 2100 配备有用于小动物成像的设备。&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;&lt;strong&gt;P60 超声生物显微镜&lt;/strong&gt; （UBM）来自 Paradigm-Medical&lt;br/&gt;(&lt;a href=&quot;http://www.paradigm-medical.com/ubms.html&quot;&gt;http://www.paradigm-medical.com/ubms.html&lt;/a&gt;).&lt;/li&gt;&lt;li&gt;&lt;strong&gt;Vevo 2100&lt;/strong&gt; 来自 VisualSonics（&lt;a href=&quot;http://www.visualsonics.com/&quot;&gt;http://www.visualsonics.com/&lt;/a&gt;)&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;麻醉剂与镇痛剂&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;子宫内存活手术可实现对小鼠发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于在早期胚胎发生阶段子宫壁不透明，难以准确靶向胚胎特定部位进行显微注射。幸运的是，高频超声成像能够生成实时图像，可用于引导显微注射针进入胚胎的目标区域。本文描述了利用该成像技术引导将逆转录病毒载体注射至小鼠前脑脑室系统（胚胎第9.5天，E9.5）的方法。该方法通过剖腹手术暴露子宫角，并使用特制培养板，使宿主胚胎在成像和注射过程中保持在生理盐水中。成功的手术通常可使大部分或全部注射胚胎存活至后续任意关注的时间点（胚胎期或出生后）。本文所述原理经适当调整后，亦可用于在胚胎第8.5天（E8.5）将病毒颗粒注射至羊膜腔（从而感染尚未闭合的神经管全长，包括前后轴向区域），或在胚胎第10.5至11.5天（E10.5/11.5）注射至脑室系统。此外，在神经发生中期（约E13.5），超声成像还可用于引导将病毒或细胞移植至特定脑区。利用超声成像引导小鼠子宫内注射是一种极为强大的技术，可实现对小鼠胚胎进行分子与细胞水平的操控，而此类操控若无该技术则将极为困难甚至无法实现。&quot;&gt;戊巴比妥钠溶液（50 mg/mL 可注射用，由 Abbott Laboratories 生产）可从 Bulter Schein Animal Health 公司获取。请注意，此为二类管制药品，需持有美国药品执法局（DEA）许可证方可获取。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;子宫内存活手术可实现对小鼠发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于在早期胚胎发生期间子宫壁不透明，将显微注射针靶向胚胎特定部位的能力受到极大限制。幸运的是，高频超声成像能够生成实时图像，可用于引导显微注射针进入目标胚胎区域。本文描述了利用此类成像技术，在胚胎第9.5天（E9.5）将逆转录病毒载体注射至小鼠前脑脑室系统的方法。该方法通过剖腹手术暴露子宫角，并使用特制的培养板，使宿主胚胎在成像和注射过程中保持在生理盐水中。成功的手术通常可使大部分甚至全部注射后的胚胎存活至后续任意关注的时间点（胚胎期或出生后）。文中所述原理经轻微调整后，亦可用于在胚胎第8.5天（E8.5）将病毒颗粒注射至羊膜腔（从而实现沿尚未闭合的神经管全长感染），或在胚胎第10.5至11.5天（E10.5/11.5）注射至脑室系统。此外，在神经发生中期（约E13.5），超声成像还可用于引导将病毒或细胞移植至特定脑区。利用超声成像引导小鼠子宫内注射是一种极为强大的技术，可实现对小鼠胚胎进行分子与细胞水平的操控，而这些操作若无该技术则将极为困难甚至无法实现。&quot;&gt;布比卡因溶液（0.25%；由Hospira, Inc.等公司生产）可从包括Moore Medical在内的多家经销商处获得。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

超声引导下小鼠前脑微注射 子宫内 在e9.5时

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

在子宫内 小鼠的存活手术可实现发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于早期胚胎发生期间子宫壁不透明，将显微注射针靶向胚胎特定部位的能力受到极大限制。幸运的是，高频超声成像能够生成实时图像，可用于引导显微注射针进入目标胚胎区域。本文描述了利用此类成像技术，在胚胎第9.5天（E9.5）将逆转录病毒载体注射至小鼠前脑脑室系统的方法。该方法通过剖腹手术暴露子宫角，并使用一种特殊设计的载片，使宿主胚胎在成像和注射过程中保持在生理盐水中。成功的手术通常可使大多数或全部注射后的胚胎存活至后续任意关注的时间点（胚胎期或出生后）。本文所述原理经轻微调整后，亦可用于在E8.5胚胎的羊膜腔内注射（从而在尚未闭合的神经管全长范围内实现感染），或在E10.5/11.5时注射至脑室系统。此外，在神经发生中期（约E13.5），超声成像还可用于引导将病毒或细胞移植直接注射至特定脑区。利用超声成像引导小鼠胚胎宫内注射是一项极为强大的技术，使得对小鼠胚胎进行分子与细胞水平的操控成为可能，而此类操控若无该技术则将极为困难甚至无法实现。

in utero 胚胎存活手术可实现对小鼠发育过程中基因表达的分子操控。本文中，我们描述了如何利用高频超声成像引导在胚胎第（E）9.5天将逆转录病毒载体注射到小鼠脑内。

超声引导下小鼠前脑微注射 子宫内 在E9.5时

小鼠胚胎在体存活手术可实现发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于子宫壁不透明……

本实验的总体目标是在小鼠前脑神经发生开始之前，将逆转录病毒载体递送至该区域。该方法可实现将目的基因转导至生发区细胞。此外，也可利用此方法注射其他病毒载体或细胞。首先对麻醉后的怀孕小鼠进行剖腹手术，以暴露胚胎。该操作的第二步是将怀孕小鼠放置在超声探头下方的注射台上，然后将胚胎置于注射板上以进行注射。该操作的第三步是利用实时超声图像引导显微注射针到达注射靶位。胚胎需依次注射，直至完成预定数量。操作的最后一步是将小鼠从注射装置上取出，并缝合体壁、肌肉和皮肤的切口。随后让动物恢复。最终，可通过检测组织切片中特定报告基因的表达，并结合细胞类型特异性标记物的染色，获得感染细胞的位置及其表型特征的结果。大家好，我是来自约翰斯·霍普金斯大学医学院神经再生项目Nick Guyano实验室的Taryn Pier Fois。今天，我们将向您展示一种利用超声成像引导在胚胎发育第9.5天（E9.5）对小鼠胚胎大脑进行逆转录病毒载体显微注射的技术。我们在实验室中采用该方法研究在脑发育早期调控基因表达对神经干细胞和前体细胞行为以及细胞命运特化的影响。现在就开始吧。如果注射液含有基因工程病毒载体，则操作应在生物安全二级柜中进行。将麻醉后的怀孕小鼠仰卧放置。使用精细的手术剪在腹中线处沿纵轴方向剪开约2.5厘米的切口。剪除切口周围皮肤与肌肉之间的结缔组织。接着，用镊子在腹肌上做一个稍短的切口。轻柔地将子宫角拉出。记录每侧的胚胎数量。将动物转移至有机玻璃注射台上，以保护胚胎。将大部分子宫角放回动物体内，仅留下两个相邻的胚胎暴露在外。使用一个直径10厘米的培养皿，其上有两个小的图钉孔和一个位于中心、直径2厘米的孔，中心孔用一片封口膜密封，以保持胚胎湿润。用一对镊子轻轻穿过封口膜。将培养皿置于母体上方。当培养皿下降时，抓住所选两个胚胎之间的子宫组织，并在培养皿接种时轻轻将它们拉过膜。用两个图钉穿过较小的孔并插入石蜡中将其固定。向培养皿中加入 37 摄氏度的 1×PBS，以保持胚胎湿润。将胚胎沿母体的长轴方向平行排列。将注射台置于超声探头下方。将探头降低至距离胚胎约两到三毫米的位置。为了获得清晰的超声图像，关键在于探头头部在前后振荡时不得接触到胚胎。采集图像时，将针头连接至安装在手动推注/回吸泵上的25微升微量注射器。将带有斜面并已 sharpened 的微量注射针插入移液器 holder 中。对位于三通阀上部、装有矿物油的10毫升注射器施加轻微压力，使油液流入管路、微量注射针 holder 及针头，并将油吸入微量注射器中。确保不要引入气泡。将针头中吸入一段1至2毫米长的气泡。为保持矿物油与病毒溶液的分离，使用退液泵小心地将病毒溶液注入针头中。平稳缓慢地吸取溶液，并注意避免堵塞。将装有溶液的针头放置到注射区域的显微操作仪位置，注意不要触碰到胚胎或超声探头而造成损坏。将注射针移动至距离子宫壁一到两毫米的位置。以大约45度的角度，通过超声探头生成的图像将在视频监视器上显示。针尖在屏幕上表现为最亮的点。确保探针的振荡方向与针头的长度方向平行。利用视频监视器上的超声图像，调整胚胎位置，使目标区域（本例中为第四脑室）清晰可见且便于针头进入。将目标脑区与针头推进方向对齐。使用显微操作仪将针尖轻触子宫壁。迅速向前刺入针头以穿透子宫组织。可能需要多次类似的穿刺，以穿透羊膜囊并进入胚胎脑内，注入适当体积的病毒。注射成功时，可见微粒状雾进入脑室，且脑室空间可能略有扩张；在注射下一个胚胎前，先将针头回撤约五毫米。两个胚胎注射完毕后，用镊子将接下来的两个胚胎穿过卵黄膜拉出，并将已注射的胚胎放回腹腔内。当完成预定数量胚胎的注射并将其推回腹腔后，将小鼠移出注射位置，放置到吸水垫上。为了闭合切口，将动物置于洁净且保温的笼子中使其恢复。此图是来自E9.5小鼠胚胎的实时超声图像的屏幕截图，显示了可用于引导注射的各种解剖结构。其中V为心室，as为羊膜囊，uw为子宫壁。注射针位于图像右侧的亮点处。在此图像中，注射了表达A-P-L-A-P病毒的胚胎显示出发育中的脑内PLAP阳性的病毒转染细胞。感染后数周，报告基因的表达可用于观察细胞形态和细胞位置，并进行克隆分析。我们刚刚向您展示了如何在胚胎发育第9.5天（E9.5）通过超声引导将逆转录病毒载体微量注射到小鼠胚胎的子宫内。进行该操作时，需注意动作迅速，因为手术过程中对小鼠的操作时间越短，胚胎存活的可能性越高。同时，使用逆转录病毒载体等生物危害性材料时，务必小心谨慎。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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