Name: 在激活人类细胞中的基因表达的动态检测组蛋白修饰染色质免疫沉淀（ChIP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 了解染色质免疫共沉淀技术如何检测人类细胞中组蛋白修饰的动态变化。该方法通过γ干扰素诱导和实时定量PCR分析，帮助研究者揭示STAT1信号通路激活基因表达的表观遗传调控机制。

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本工作由弗吉尼亚大学、弗吉尼亚大学癌症中心以及托马斯·F·和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金资助。我们感谢洛克菲勒大学詹姆斯·E·达内尔实验室和福特汉姆大学罗伯特·罗斯实验室提供的细胞系。

规划
计划进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的前一天，应培养细胞以确保获得足够数量的细胞。假设每次ChIP检测需要约1-1.5 × 107个细胞。务必同时设置阴性对照（IgG）和阳性对照（pan组蛋白抗体），并进行重复实验。 
 提示 - 对于2FTGH细胞，每次ChIP检测大约需要一个直径15 cm、汇合度为80%的组织培养皿。
第一部分：制备染色质并进行染色质免疫沉淀（ChIP）
<ol>
 <li>移除培养基，并用含有5 ng/mL IFN-γ的20 mL 10% 天然小牛血清（CCS）/DMEM培养基诱导细胞，诱导时间按实验要求进行。同时，将未诱导组培养板中的培养基更换为20 mL 10% CCS/DMEM。</li>
 <li>在通风橱中，加入 540 μL 将37%甲醛加入15 cm培养皿的培养基中，至终浓度为1%（总体积20 mL）。 
 提示 - 倾斜培养板，将甲醛加入培养基液滴中，然后轻轻摇动培养板使其均匀分布。
 </li>
 <li>室温下孵育10分钟以完成交联反应。</li>
 <li>加入甘氨酸至终浓度为 0.125 M，以终止交联反应。</li>
 <li>吸除培养基，用10 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。</li>
 <li>用细胞刮在约 7 mL PBS 中收集细胞，并将来自 6 个培养板的经相同处理的细胞合并至一个 50 mL 离心管中，置于冰上。</li>
 <li>离心机（Beckman Coulter Allegra 12-R Centrifuge）在1800 rpm下离心 4°C 5 分钟后吸除 PBS。 
 提示 - 若在此处停止操作，需将细胞沉淀速冻，并于 -80°C.</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于4 mL裂解缓冲液（25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 1 mM DTT, 1×蛋白酶抑制剂）中。2，10 mM KCl，0.1% NP40。使用前加入1 mM DTT和Complete蛋白酶抑制剂，冰上预冷，转移至15 mL锥形管中。 
 提示 - 此裂解缓冲液体积适用于6孔板合并处理（约6-9 × 107 细胞）。缓冲液体积过多或过少都可能影响玻璃匀浆器的破碎效率。
 </li>
 <li>将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。</li>
 <li>将悬液转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器（Wheaton）中，用A型研杵匀浆20次。</li>
 <li>将经Dounce匀浆器处理的细胞转移回冰上的15 mL锥形管中。</li>
 <li>2500 rpm 离心 5 分钟，温度为 4°C 弃去上清液。</li>
 <li>重悬细胞核沉淀（约 200 μL 来自6个培养板）加入3 mL（15倍沉淀体积）超声缓冲液（50 mM HEPES pH 7.9，140 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS。使用前冰上预冷，并加入Complete蛋白酶抑制剂）。 
 提示 - 此超声缓冲液体积适用于6孔板合并处理（约6-9 x 107 细胞）。缓冲液体积过多或过少都可能影响超声处理效率。</li>
 <li>将细胞核悬液置于冰上，使用配备微探头的Misonix Sonicator 3000进行超声处理，共10个循环（每个循环20秒开启/40秒关闭，振幅设为8）。此过程通常可获得平均大小为200-1000 bp的染色质片段。 
 提示 - 由于不同超声破碎仪的性能存在差异，超声破碎效率必须通过实验经验确定。为此，取等分试样 20 μL 超声处理前及每个超声处理循环后。将这些样品加热 65°C 孵育4小时。加入DNA上样缓冲液，用标准的1%琼脂糖/TBE凝胶电泳检测DNA片段。 
 </li>
 <li>将超声处理后的样品转移至SS34离心管中，以20分钟离心 4°C 在SS34转子（Sorvall RC6 Plus离心机）中以13000 rpm离心，以沉淀通常为少量的细胞碎片。</li>
 <li>将上清液小心转移至预冷的15 mL锥形管中，置于冰上。</li>
 <li>预清除：通过添加 360 μL 鲑鱼精子DNA/蛋白A或G琼脂糖凝胶珠悬液及振荡处理 4°C 至少 30 分钟。 
 提示 - 此步骤可降低由非特异性结合事件引起的检测背景噪声。</li>
 <li>以1000 rpm离心 4°C 5 分钟以沉淀琼脂糖珠。</li>
 <li>将预清除的上清液转移至另一支预冷的15 mL离心管中，置于冰上。</li>
 <li>测定预清除染色质的 A260 单位，并用超声缓冲液调整体积至 4 个 A260 单位（假设 1 个 A260 单位 = 0.050 mg/mL，则相当于 0.2 mg/mL） 
 提示 - 为测定A260单位，需稀释 10 μL 预清除染色质的 190 μL 去离子水；空白分光光度计用 10 μL 超声缓冲液中 190 μL 去离子水 
 </li>
 <li>保存 75 μL 染色质（以4 A260单位计）作为输入样本并保存于 20°C 直至准备进行交联逆转。 提示 - 此步骤对于数据分析至关重要，切勿忽略取样输入等分试样。 </li>
 <li>将制备好的染色质在冰上分装至1.7 mL离心管中，每管1 mL。 提示 - 如果在此停止，将制备好的染色质在干冰上速冻，并于 -80°C 保存80°C注意：储存的染色质可能发生降解，导致结果不理想，因此应尽量避免使用。 </li>
 <li>将ChIP级抗体分别加入诱导和未诱导的样本组中，每组设两个重复。加入IgG（2 μg）以及全组蛋白 H3 抗体（15 μL作为诱导和未诱导样本组的阴性对照和阳性对照。 
 提示 - 抗体的使用量必须通过实验确定，或参考供应商提供的产品说明书中的建议用量。通常为1-2 μg 使用一种经染色质免疫沉淀（ChIP）验证的抗体效果良好。对于以血清形式提供的抗体，其合适用量必须通过实验确定。 
 </li>
 <li>将所有试管在摇床上过夜震荡 4°C.</li>
</ol>
第二部分：收集免疫复合物
<ol>
 <li>向所有试管中加入 60 μL 鲑鱼精子 DNA/Protein A 或 Protein G 琼脂糖珠悬液。 
 提示：兔多克隆抗体使用 Protein A，鼠单克隆抗体使用 Protein G。</li>
 <li>在 4°C 条件下振荡孵育至少 60 分钟。</li>
 <li>在 4°C 下以 2000 rpm 轻柔离心 3 分钟，沉淀免疫复合物（琼脂糖珠）。</li>
 <li>吸除上清液。</li>
 <li>依次用下列每种洗涤缓冲液在 4°C 振荡洗涤 10 分钟。每次洗涤后在 4°C 以 2000 rpm 离心 3 分钟，吸除上清液。样品始终保持在冰上。使用前立即加入 PMSF。
 <ul>
 <li>低盐洗涤液 - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF</li>
 <li>高盐洗涤液 - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF</li>
 <li>LiCl 洗涤液 - 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF</li>
 <li>TE 洗涤液 - 用 TE 缓冲液洗涤两次 - 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF</li>
 </ul>
 </li>
 <li>去除最后一次 TE 缓冲液洗涤液，向琼脂糖珠中加入 500 μL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS）。 
 提示 - 洗脱缓冲液应新鲜配制。 
 </li>
 <li>涡旋混匀琼脂糖珠与洗脱缓冲液，于 65°C 加热 30 分钟。 
 提示 - 在此 30 分钟期间，每 10 分钟至少涡旋一次各管。</li>
 <li>以 2000 rpm 离心 30 秒，将洗脱液转移至新的微量离心管中。 
 提示 - 洗脱过程中，将输入样品解冻，并向每个样品中加入 500 μL 洗脱缓冲液。后续所有步骤均需包含这些样品。 
 </li>
 <li>向所有样品中加入 5 M NaCl，使其终浓度为 200 mM，并涡旋混匀。</li>
 <li>在 65°C 孵育过夜（或至少 4 小时）。</li>
</ol>
第3部分：纯化染色质免疫沉淀的DNA和输入DNA
<ol>
 <li>将所有样品在微量离心机中离心30秒，以收集管盖上的冷凝液。</li>
 <li>向每管中加入1μL RNase A（10 U/μL），室温孵育15分钟。</li>
 <li>加入10 μL 0.5 M EDTA、40 μL 0.5 M Tris-Cl（pH 6.5）、2 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），并在45°C孵育60分钟。提示：可将上述试剂配制成主混合液，每管加入52 μL。</li>
 <li>用酚/氯仿/异戊醇抽提样品，随后再用氯仿/异戊醇抽提一次。</li>
 <li>加入2 μL糖原（25 μg/μL）和0.1倍体积的3M乙酸钠（pH 5.2），涡旋混匀。</li>
 <li>加入2.5倍体积的100%乙醇，涡旋混匀。</li>
 <li>在20°C孵育过夜。</li>
</ol>
第4部分：继续纯化染色质免疫沉淀DNA和输入DNA
<ol>
 <li>在 4°C 条件下，以 13000 rpm 离心样品至少 20 分钟，以沉淀 DNA/糖原沉淀物。</li>
 <li>用 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA/糖原沉淀物。</li>
 <li>将沉淀物空气干燥，或使用 DNA Savant 快速真空离心浓缩仪快速干燥。 
 提示 - 切勿过度干燥 DNA。</li>
 <li>将 DNA/糖原沉淀物重悬于 200 μL TE 缓冲液中。</li>
 <li>DNA（1 μL）可用于实时 PCR 定量。剩余 DNA 储存于 20°C。 
 提示 - 使用超过 1 μL 的 DNA 可能会抑制实时 PCR 反应，因此请谨慎增加用量。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果：
使用针对目标基因位点的特异性引物，通过实时PCR7,8（Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System）对ChIP和Input DNA样本进行定量。同时，可选用针对已知在所检测的组蛋白修饰中富集或缺失的基因组序列的引物作为阳性和阴性对照。数据以Input百分比（Percent of Input）表示。为确保所报告的组蛋白修饰变化具有统计学显著性，ChIP实验应完全重复三次生物学重复。
使用实时 PCR 定量 DNA 时，需考虑若干重要问题，包括引物设计、PCR 扩增效率，以及计算输入百分比和归一化处理的适当方法。在分析基因上组蛋白修饰占据情况时，所有引物对之间的 PCR 扩增效率必须保持一致。实时 PCR 系统的制造商可提供必要的信息和培训。
图1显示了由干扰素-γ（IFN-γ）触发的STAT1激活IRF1基因过程中染色质免疫沉淀的代表性结果9。
<img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="基因表达分析，H3K36me3，STAT1，Pol II，Pan H3；% 输入与引物位置关系图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. STAT1 激活 IRF1 基因过程中，STAT1、RNA 聚合酶 II 和 H3K36me3 的占据呈动态变化。（A, B, C） 对经干扰素-γ（IFN-γ）诱导30分钟（红色方块）、1.5小时（蓝色圆圈）、5小时（绿色三角形）或未诱导（黑色菱形）的2FTGH细胞提取的染色质进行ChIP实验，使用抗H3K36me3（α-H3K36me3）、抗STAT1（α-STAT1）和抗Pol II（α-Pol II）抗体。IgG为阴性对照（灰色十字）。（D） Pan H3为阳性对照，显示在诱导（蓝色圆圈）和未诱导（黑色菱形）条件下该基因座的组蛋白占据情况。-5 bp附近的信号下降是由于转录起始位点处常见的核小体耗竭所致。

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本实验方案中所述的染色质免疫沉淀（ChIP）方法已在实验室成功用于检测二十多种不同的组蛋白修饰。此外，我们还利用该方法表征了在多种干扰素-γ（IFN-γ）诱导基因上，转录因子、组蛋白修饰酶、识别组蛋白修饰的蛋白质以及RNA聚合酶II转录机器的占据情况变化。我们还应用该流程分析了癌症干细胞分化过程中组蛋白修饰的动态变化10。 ChIP 数据的质量最终取决于所用抗体的有效性，而不同抗体之间的效果存在较大差异。因此，未能通过 ChIP 检测到某种修饰，并不能解释为该修饰不存在。此外，在 ChIP 实验中观察到的某种特定修饰的变化，可能仅仅反映了由于邻近残基上其他组蛋白修饰的存在，导致抗体对表位识别能力的改变。因此，必须通过能够将组蛋白修饰的观察变化与生物学结果相关联的方法来验证 ChIP 结果。当做到这一点时，ChIP 就成为研究染色质相关机制如何参与基因表达调控的一种强有力手段。

<table><tbody><tr><td>37% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>氯仿/异戊醇</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>鲑精 DNA/Protein A 琼脂糖</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>鲑精 DNA/Protein G 琼脂糖</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>抗-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>抗-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>抗-RNA 聚合酶 II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

染色质免疫沉淀（chip）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

在多种细胞外配体的刺激下，STAT（信号转导子和转录激活子）转录因子会迅速从细胞质中的静息状态被招募至细胞表面受体，并在单个酪氨酸残基上发生磷酸化而被激活1。随后，它们形成二聚体并转入细胞核，驱动靶基因的转录，从而影响细胞生长、分化、稳态及免疫应答。鉴于STAT因子广泛参与正常的细胞生理过程，其功能失调与人类疾病密切相关，尤其是癌症2和自身免疫性疾病3。 已有充分证据表明，转录过程受到染色质模板改变的调控4,5。这些改变包括ATP依赖性复合物的活性，以及组蛋白的共价修饰和DNA甲基化6。由于STAT激活基因表达具有快速且短暂的特点，因此需要特定的机制来调控依赖STAT的基因位点上的染色质模板。为了明确这些机制，我们对响应STAT信号通路的基因位点上的组蛋白修饰及其产生这些修饰的酶活性进行表征。本实验方案描述了染色质免疫沉淀技术，该方法在研究STAT信号通路对活化基因表达中染色质的调控方面具有重要价值。

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

在响应多种细胞外配体时，STAT（信号转导子和转录激活子）转录因子会迅速被招募……

芯片实验用于监测在STAT1激活的基因表达改变过程中组蛋白修饰的动态变化，转录因子、组蛋白修饰复合物以及转录机器本身占据情况的变化也可通过此方法进行检测。实验开始时，用干扰素γ诱导细胞以激活STAT1信号通路，随后用甲醛对细胞进行交联并收集细胞。接着进行细胞核的分离和超声处理，将染色质剪切为约200至1000个碱基对的片段。下一步，加入针对目标蛋白或组蛋白修饰的特异性抗体，然后沉淀免疫复合物。免疫复合物经洗涤后，解除交联并纯化DNA。通过定量实时PCR对免疫沉淀的DNA进行分析，可确定组蛋白修饰的变化或特定基因区域蛋白质的招募情况。大家好，我是来自弗吉尼亚大学生物学系Melissa Hendrickson博士实验室的Lauren Borow。今天我们将向您展示一种染色质免疫沉淀的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究STAT1信号通路下游转录过程中发生的动态组蛋白修饰。现在让我们开始吧。开始本实验前一天，培养细胞以确保有足够的细胞数量用于此处的两个FTGH细胞。每次芯片实验准备一个直径15厘米、汇合度为80%的组织培养皿。每次实验均需包括阴性IgG对照、阳性pan histone抗体对照以及重复样本。开始此操作时，移除培养基，更换为 20 毫升添加了 10% 小牛血清并含有 5 纳克/毫升干扰素 γ 的 DMEM 培养基。同时，将未诱导组培养板中的培养基更换为 20 毫升 10% C-C-S-D-M-E-M 培养基。接下来在通风橱中操作。将15厘米的组织培养皿倾斜，向20毫升培养基中加入540微升37%甲醛溶液，然后轻轻摇动培养皿使其均匀分布。室温下孵育10分钟以进行交联反应。然后加入甘氨酸至终浓度为125毫摩尔/升，以终止交联反应。用真空泵吸去培养基，加入10毫升预冷的PBS缓冲液洗涤细胞一次，用细胞刮刀收集细胞于约7毫升PBS中，并将来自六个15厘米培养皿中经相同处理的细胞合并至一个50毫升锥形管中，置于冰上。最后，在 4°C 条件下以 1,800 RPM 离心收集的细胞 5 分钟，并吸除 PBS。如果在此处暂停实验，需迅速冷冻细胞沉淀，并在交联后于 -80°C 保存。下一步是制备染色质。首先，在冰上预冷的膨胀缓冲液中加入一毫摩尔的DTT和完全蛋白酶抑制剂。将六块培养板的沉淀重悬于四毫升膨胀缓冲液中，转移至15毫升锥形管。使用过多或过少的缓冲液可能会影响裂解效率。将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。冰上孵育完成后，将悬液转移至预冷的15毫升Dounce匀浆器中，用PEs A匀浆20次。匀浆后，将细胞重新转移至冰上的15毫升离心管中，在4°C下以2,500 RPM离心5分钟，弃去上清液，保留细胞核沉淀。将完全的蛋白酶抑制剂加入预冷在冰上的超声破碎缓冲液中。六块培养板可获得约 200 微升核沉淀重悬液。将沉淀物重悬于 15 倍沉淀体积或 3 毫升超声破碎缓冲液中。使用不同体积处理此数量的细胞可能会改变超声处理效率。超声处理效率应事先根据您实验室的设备进行确定。此处使用配备微芯片的 Miss Sonic 3000 超声仪。将细胞核悬液置于冰上，以8的振幅设置进行超声处理，每次超声20秒，间隔40秒，共循环10次。超声处理完成后，染色质片段的平均大小通常为200至1000个碱基对。将超声处理后的样品转移至SS 34离心管中，在4°C条件下以13,000 RPM离心20分钟。在SS 34离心转子中离心以沉淀细胞碎片，这些碎片通常量较少。小心将上清液转移至冰上的15毫升锥形管中。随后进行切胶操作，以降低非特异性结合事件带来的背景信号。首先，加入 360 µL 鲑鱼精子 DNA 蛋白 A 或 G 琼脂糖珠悬液，4 °C 条件下振荡孵育至少 30 分钟，以预先清除染色质样品。在 4 °C 下以 1000 RPM 离心 5 分钟，使琼脂糖珠沉淀。然后将预清除后的上清染色质转移至另一置于冰上的 15 mL 圆底离心管中。接下来，测定染色质在260纳米处的吸光度（A260单位）。取10微升预清除染色质，加入190微升双蒸水进行稀释。作为空白对照，将10微升超声破碎缓冲液与190微升双蒸水混合。用超声缓冲液将样品体积调整至4个A260单位。取75微升经预清除的染色质（浓度为4个A260单位）作为输入样品，保存于-20摄氏度，直至准备进行交联逆转。请记住，此步骤对于数据分析至关重要。因此，请务必取样后，将剩余的染色质样品分装至1.7毫升微量离心管中，每管1毫升，并置于冰上。如果在此处暂停实验，需迅速将制备好的染色质在干冰上速冻，并于-80°C保存。然而，由于储存的染色质可能发生降解，最好立即继续进行免疫沉淀。现在向诱导和未诱导的样本组中分别加入适用于染色质免疫沉淀的抗体，每组设两个重复。通常使用一到两微克的抗体效果较好，但具体用量需预先通过实验确定。在诱导和未诱导的样本组中，分别加入两微克IgG和15微升泛组蛋白H3抗体，作为阴性对照和阳性对照。此外，在加入抗体过夜孵育后，将所有管在4°C下轻轻摇动孵育过夜，然后继续进行免疫复合物的分离。向所有试管中加入 60 µL 鲑鱼精子 DNA 蛋白 A 或蛋白 G 琼脂糖珠悬液。在 4°C 下孵育至少 60 分钟，以使免疫复合物与琼脂糖珠结合。在4摄氏度下，以2000 RPM低速离心微珠3分钟，使结合有免疫复合物的琼脂糖珠沉淀，吸弃上清液。接下来进行一系列缓冲液洗涤，先用低盐缓冲液洗涤，随后用高盐缓冲液洗涤，然后用氯化锂缓冲液洗涤。最后，用每种洗涤缓冲液各进行两次 TE 洗涤。使用前立即加入 PMSF，每步用 1 毫升缓冲液在 4°C 条件下轻轻摇动洗涤 10 分钟，然后在 4°C、2000 转/分钟条件下离心 3 分钟，吸除上清液，并始终保持样本置于冰上冷却。在最后一次 TE 缓冲液洗涤去除后，向珠子中加入 500 微升 freshly prepared Lucian 缓冲液，涡旋混匀使 aros 珠子充分悬浮于 Lucian 缓冲液中，随后在 65°C 条件下加热 30 分钟。样品洗脱期间，每10分钟涡旋振荡一次，同时将输入样品解冻，并向每个样品中加入500 µL洗脱缓冲液。从后续所有步骤开始均需包含这些样品。待样品完成65 °C孵育后，以2000 ×g瞬时离心30秒，然后将EENT转移至新的微量离心管中。最后，进行交联逆转。向所有样品中加入五倍摩尔浓度的氯化钠，使其终浓度达到200毫摩尔，并在65摄氏度下涡旋振荡孵育至少4小时至过夜。当免疫复合物的交联完全逆转后，在65摄氏度孵育结束后即可回收结合的DNA。将样品在微型离心机中离心30秒。为收集管盖上的冷凝液，向每管中加入1微升RNAs A，在室温下孵育15分钟；随后对每管进行RNAs处理，加入10微升0.5摩尔EDTA、40微升0.5摩尔Tris氯化物（pH 6.5）和2微升蛋白酶K，或总共52微升的主混合液，并在45摄氏度下孵育60分钟。用苯酚-氯仿-异戊醇以及随后的氯仿-异戊醇对样品进行抽提。然后，为了沉淀DNA，向每个样品中加入2微升糖原和0.1倍体积的3摩尔醋酸钠（pH 5.2），涡旋混匀；再加入2.5倍体积的100%乙醇，涡旋混匀，并在-20摄氏度孵育过夜。取出样品，在4摄氏度、13,000转/分钟条件下离心20分钟以收集沉淀。用一毫升70%乙醇洗涤DNA糖原沉淀，并用空气干燥。可使用真空离心浓缩仪干燥沉淀，但切勿过度干燥。将沉淀重悬于200微升TE缓冲液中，并用实时定量方法测定浓度，取样量不超过一微升。此处展示的 PCR 结果来自一项芯片实验，用于研究 H3K36me3 的动态变化。在干扰素γ诱导 IRF1 基因表达的过程中，使用 H3K36me3 抗体对经干扰素γ诱导 30 分钟、1.5 小时和 5 小时的 2fTGH 细胞所提取的染色质进行免疫沉淀，以 IgG 作为阴性对照。同时在这些时间点检测了 STAT1 的占据情况以及 RNA 聚合酶 II 的占据水平。通过使用泛组蛋白三抗体，检测了IRF1基因位点在未诱导和诱导条件下组蛋白的占据情况，该抗体同时也作为阳性对照。在转录起始位点上游约负五碱基对处出现的凹陷，是由于转录起始位点处存在核小体耗竭所致。我们刚刚向您展示了染色质免疫沉淀实验的操作流程。该检测方法可用于观察基因激活转录过程中发生的染色质修饰。在进行此操作时，重要的是在开始ChIP实验之前，先针对您的染色质和抗体优化剪切条件。同时请记得采集输入样本。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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