Name: 如何以文化，记录和刺激神经网络的微电极阵列（多边环境协定） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习在微电极阵列上培养、记录和刺激神经元网络的方法，使用大鼠胚胎皮层神经元进行长期体外培养。该技术为研究神经网络活动、学习与记忆提供了可控的实验平台。

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我们感谢Potter团队成员对本方案提供的宝贵意见。本研究由美国神经病学学会基金会临床研究培训奖学金资助CMH，由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS；<a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a>）资助JDR（GM08169），美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（NS054809）资助，JDR获得露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（NS060392），美国国家科学基金会EFRI资助（0836017），库尔特基金会转化研究奖，以及JDR获得的转化研究奖学金（NS007480）。

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH 没有需要披露的内容。 JDR 和 SMP 是 Axion Biosystems 的付费顾问。 本文及视频的投稿费用和视频处理费用由 Multi-Channel Systems 慷慨赞助。

本方案介绍了如何在微电极阵列上培养和维持神经元网络，以及记录和刺激神经元网络的基本方法。MEA 故障排除部分还讨论了使用 MEA 进行记录时一些常见问题。在整个方案中提及了一些偶尔的步骤变异，这些调整通常用于优化特定实验设计所需的条件。
尽管此处介绍的记录与刺激系统由我们自行设计的 NeuroRighter15 与 MCS 前置放大器组成，但还有多种其他系统也可提供与神经元网络的接口。具体选择何种装置取决于实验的具体需求。
本方案提供了简化的记录与刺激示例，但基于微电极阵列的神经元培养体系可用于探究突触活动及神经元网络连接性等复杂问题。如上所述，目前已有研究利用该技术探索细胞可塑性、发育过程、兴奋性毒性及神经退行性变等生物学过程。6-10 例如，我们实验室最近发表的一项研究展示了可重复的目标导向学习 体外 根据当前神经网络活动进行实时闭环刺激3.
尽管MEA培养物通常较为敏感且脆弱，但由于其结构简单且易于操作（相较于完整的动物模型），它们为在神经网络水平上研究神经元活动提供了一个强有力的模型。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;耗材&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;一次性瓶顶过滤器（150 ml，0.2 μm）&amp;#x03BC;m 孔径；Nalgene #565-0020&lt;/li&gt; &lt;li&gt;妊娠18天的雌性大鼠&lt;/li&gt; &lt;li&gt;微电极阵列&amp;#8211;微电极阵列（见方案B1中的描述）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;微电极阵列&amp;#8211;电极阵列盖子（见方案B3中的描述）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;尼龙细胞筛（40&amp;#x03BC;m，BD Falcon，#352340&lt;/li&gt; &lt;li&gt;聚丙烯圆锥形离心管（无菌，15 ml）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;聚苯乙烯培养皿（无菌，35 mm 和 100×15 mm）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;移液器吸头（无菌，20&amp;#x03BC;1, 200&amp;#x03BC;1 和 1000&amp;#x03BC;l)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;血清移液管（5 ml）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;生物安全柜/层流罩&lt;/li&gt; &lt;li&gt;细胞计数器&lt;/li&gt; &lt;li&gt;离心&lt;/li&gt; &lt;li&gt;冰盒&lt;/li&gt; &lt;li&gt;解剖剪和镊子（已灭菌）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;超净工作台中的解剖显微镜&lt;/li&gt; &lt;li&gt;手持式电动移液器 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;血细胞计数板&lt;/li&gt; &lt;li&gt;异氟烷和气体室&lt;/li&gt; &lt;li&gt;光学显微镜&lt;/li&gt; &lt;li&gt;手持式移液器（P-20（20&amp;#x03BC;升），P-200（200&amp;#x03BC;l), P-1000 (1000&amp;#x03BC;l))&lt;/li&gt; &lt;li&gt;MEA记录系统（见方案D1中的描述）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;啮齿类动物断头器&lt;/li&gt; &lt;li&gt;三气培养箱（见方案 B15 中的描述）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;通风橱内连接抽吸器的真空瓶&lt;/li&gt; &lt;li&gt;涡旋震荡&lt;/li&gt; &lt;li&gt;水浴（35-37 ℃）&amp;#x00B0;C)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液与试剂：&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;BSA 溶液：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 将5% BSA（Sigma A-9418）溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，并通过0.2 μm滤膜过滤&amp;#x03BC;m. 该溶液可预先配制，并在 4℃ 保存&amp;#x00B0;可维持数月。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;细胞培养基：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 将90 ml Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基（Irvine Scientific 9024），10 ml 马血清（Gibco 16050），1 ml 丙酮酸钠（100 mM，Gibco 11360），250 &amp;#x03BC;l GlutaMAX（Gibco 35050）和胰岛素（终浓度 2.5） &amp;#x03BC;g/ml，Sigma I-5500），然后经 0.2 μm 滤膜过滤 &amp;#x03BC;m 滤器。22 使用前将细胞培养基在培养箱中预热并平衡。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;用于制备木瓜蛋白酶溶液的解离溶液：&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;解剖液（100 ml 储存液）&lt;/td&gt; &lt;td&gt;按顺序混合，0.22 微米滤膜过滤 &amp;#x03BC;m，并在4℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;组分&lt;/td&gt; &lt;td&gt;体积 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;终浓度（mM）&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;双蒸水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;91.175&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.58&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5.8 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1 M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.025&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.25 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;0.5 M HEPES&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.32&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.6 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;0.5% 酚红&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;(0.001%)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;0.1 N NaOH&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.2 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2 M Na2SO4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4.5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;90 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1 M K2SO4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;3.0&lt;/td&gt; &lt;td&gt;30 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;0.1 M 犬尿烯酸&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.0&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;5 mM APV&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.0&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.05 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;该溶液可预先配制，并在4℃保存&amp;#x00B0;数月&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;DNAse I：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; Invitrogen (#18047019)。50&amp;#x03BC;l aliquots 经速冻后于 -80 保存&amp;#x00B0;C. 在开始细胞解离过程之前，于超净工作台中解冻一份 aliquot。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;汉克&amp;rsquo;平衡盐溶液：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; Sigma（#4891）。使用去离子水配制1X溶液，并通过0.2 μm滤膜无菌过滤。&amp;#x03BC;m 并在 4 ℃ 下保存&amp;#x00B0;C.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Hibernate溶液：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 于培养当天配制。将98 ml L-15培养基（Invitrogen 11415）与2 ml B-27添加剂（50倍浓度，Invitrogen #17504）混合，并通过0.2 μm滤膜过滤 &amp;#x03BC;m&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;层粘连蛋白溶液：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 培养当天准备。稀释20&amp;#x03BC;l 的层粘连蛋白（1 mg/ml，Sigma L-2020）加入 980 &amp;#x03BC;l 细胞培养基，终浓度为 0.02 mg/ml。20 &amp;#x03BC;laminin（1 mg/ml）的 aliquots 储存于 -80 ℃&amp;#x00B0;C，并在使用前立即解冻。解冻应在实验台面上进行，而非水浴中，因为快速解冻有时会导致层粘连蛋白（laminin）发生凝胶化。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;木瓜蛋白酶溶液：&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 将10 ml解剖液（上述）加热至30–32℃&amp;#x00B0;C. 加入200单位木瓜蛋白酶（Sigma P-4762）和1.6 mg L-半胱氨酸（Sigma C-7880）。用约14 &amp;#x03BC;0.1 N NaOH 溶液。孵育约 30 分钟，直至溶液变澄清，经 0.2 μm 滤膜过滤 &amp;#x03BC;m，用液氮将2 ml分装至15 ml聚丙烯无菌锥形管中速冻，并于-80℃保存&amp;#x00B0;C. 在35-37℃下解冻一份样品&amp;#x00B0;开始实验方案前的 C。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;聚乙烯亚胺（PEI）溶液：&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 100 &amp;#x03BC;将1毫升PEI（50% w/v，Sigma P-3143）溶于100毫升硼酸钠缓冲液（0.1 M，pH 8.4，Sigma B-9876）中，终浓度为0.05% w/v。使用0.2 μm滤膜无菌过滤。 &amp;#x03BC;m。可预先配制，并在4℃保存&amp;#x00B0;数月 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;无菌去离子水：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 高压灭菌，使用前冷却至室温。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;胰蛋白酶（0.25% 含 EDTA，Gibco 25200）：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1 ml 分装样品经快速冷冻后，于 -80 保存&amp;#x00B0;C. 将分装样品在35-37℃下解冻&amp;#x00B0;使用前将水浴预热至 C。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

如何在微电极阵列（meas）上培养、记录和刺激神经元网络

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

近一个世纪以来，全球许多神经科学家毕生致力于研究神经元网络的工作机制，以及其在多种疾病中为何会停止正常运作。相关研究包括神经病理学观察、结合遗传标记的荧光显微镜技术，以及对分离神经元和脑片制备样本进行的细胞内记录。本实验方案介绍另一种技术，即在微电极阵列（也称为多电极阵列，MEAs）上培养分离的神经元细胞。
与其它技术相比，使用该系统具有多种优势。在微电极阵列（MEA）上培养的离体神经元网络提供了一个简化的模型，可通过阵列中的多个电极施加电刺激序列来调控网络活动。由于网络规模较小，刺激的影响局限于可观测区域，而在完整组织制备中则无法实现这一点。细胞以单层形式生长，便于利用多种成像技术监测其形态变化。最后，MEA上的培养物在体外可存活一年以上，从而消除了其他培养技术所固有的明确时间限制。1
我们的实验室及全球其他实验室正在利用这项技术来探究关于神经元网络的重要问题。本实验方案的目的是提供在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的必要信息。In vitro 网络为在神经网络和细胞水平上提出具有生理相关性的问题提供了途径，有助于更深入地理解大脑功能及其功能障碍。

本方案提供了在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的全部信息。In vitro 神经网络能够在网络和细胞水平上提出具有生理相关性的问题，从而增进对脑功能及脑功能障碍的理解。

如何在微电极阵列（MEAs）上培养、记录和刺激神经元网络

在过去的一个世纪里，全球许多神经科学家毕生致力于研究神经元网络的工作机制，以及它们在各种疾病中为何会停止正常运作。研究方法包括神经病理学观察、遗传标记的荧光显微镜成像，以及对分离神经元和脑片标本进行的细胞内记录。本实验方案介绍另一种技术，即在微电极阵列（也称为多电极阵列，MEAs）上培养分离的神经元细胞。相比其他技术，该系统具有多项优势。MEA上的分离神经元培养提供了一个简化的模型，可通过阵列中的多个电极施加电刺激序列来调控网络活动。由于网络规模较小，刺激的影响局限于可观测区域，而在完整组织标本中则无法实现这一点。细胞以单层形式生长，便于利用多种成像技术监测形态学变化。最后，MEA上的培养物可在体外存活超过一年，从而消除了其他培养技术所固有的明确时间限制。本实验室及全球其他实验室正利用该技术探究神经元网络的重要科学问题。本实验方案旨在提供在MEA上建立、维护、记录和电刺激神经元培养所需的全部信息。体外神经网络为在细胞和网络水平上提出具有生理相关性的问题提供了途径，有助于更深入地理解大脑功能及其功能障碍。

本实验的总体目标是在微电极阵列上培养、记录并刺激神经元网络。首先需准备培养所需的试剂和微电极阵列，以完成培养前的准备工作。实验的第二步是从第18天的大鼠胚胎中分离皮层神经元。该实验步骤的第三步是将神经元接种到微电极阵列上，并培养两到三周。最后一步是通过微电极阵列对神经元网络进行刺激和记录，开展实验。最终，通过在微电极阵列上精细的细胞培养，结合记录与刺激软件，可以获得神经元网络的自发活动及刺激诱发活动的结果。您好，我是 Steve Potter 教授。我是佐治亚理工学院生物医学工程系神经工程实验室的主任。该系与埃默里大学医学院共同设立。我是查德·黑尔（Chad Hales），波特博士实验室的博士后研究员。我同时也是埃默里大学医学院神经病学系的认知行为学研究员。今天我们将向您展示如何在多电极阵列上培养和护理神经元。例如这些。我们利用它们在体外研究学习记忆以及神经网络的信息处理。现在开始操作：在超净工作台中，准备多通道系统微电极阵列（MEA），取100微升聚乙烯亚胺加入洁净无菌的MEA中央，该MEA置于100毫米培养皿中，注意避免损伤电极。切勿用固体物体触碰MEA表面。用带有透气聚四氟乙烯膜的无菌盖轻轻盖住培养皿，并在生物安全柜中孵育30分钟。聚四氟乙烯膜盖可实现气体交换，同时减少蒸发，使培养可在较低湿度环境中进行。较低的湿度允许在培养箱中使用精密电子设备，并降低污染率。用一到两毫升无菌去离子水将MEA冲洗三次，每次冲洗后吸除液体。在超净台中敞盖干燥至少30分钟，或直至完全干燥。按照本方案文本部分所述，完成 E 18 皮层神经元的分离。分离后对细胞进行过滤。将细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中，并小心地用细胞培养基将细胞悬液体积补至 4 毫升。在细胞悬液下方铺一层500微升的5% BSA溶液，于200 ×g离心6分钟。细胞离心期间，检查MEA是否完全干燥。小心地将20微升包被溶液移至MEA的中央。避免引入气泡，并确保所有电极均被覆盖。将聚四氟乙烯（Teflon）盖轻轻放置在微电极阵列（MEA）上，以防止层粘连蛋白（laminin）蒸发。放置盖子时，MEA 应置于完全水平的表面上。否则，压力可能会导致阵列的玻璃底部破裂。将培养皿置于35至37摄氏度、5%二氧化碳、9%氧气和65%湿度条件下孵育20分钟。现在将离心后的细胞转移至超净台中。应可见细胞沉淀位于管底。若沉淀不完全，移除上清液并保留备用。轻柔地重悬沉淀。在血细胞计数板上对10微升悬浮液中的细胞数量进行计数，并用细胞培养基将悬浮液稀释至所需浓度，通常为每微升1000至3000个细胞。当阵列的贴壁孵育完成后，立即吸除液滴。用移液器将15至20微升细胞悬液滴加到MEA的层压涂层区域上。用聚四氟乙烯盖子盖住培养皿，并放入培养箱中静置30分钟。在相差显微镜下检查培养皿，确保细胞已贴壁并覆盖所有电极。如果覆盖不完全，添加更多细胞并重新孵育。缓慢加入一毫升预热的平衡细胞培养基，浸没培养皿。盖上聚四氟乙烯盖子，将培养皿放回培养箱中孵育24小时。第二天，在相差显微镜下检查培养的细胞是否已贴壁，并确认在适当的护理和喂养条件下，碎片和细胞死亡的数量有限。如正文所述，以这种方式培养的神经元可存活一年以上。经过两到三周后，培养物的活动已达到稳定状态，可以进行记录。本视频将演示如何使用定制的 Neuro Writer 程序进行记录。将培养皿再次转移至记录用培养箱中，培养箱条件保持在35至37摄氏度、5%二氧化碳、9%氧气和65%湿度。为维持理想的温度和pH值，在移动培养皿时应将其保持与地面平行，并避免快速移动，以防细胞从基质上脱落。将MEA从培养皿中取出，并放入多通道系统中的记录前置放大器，确保内部接地与前置放大器的接地正确匹配。前置放大器置于帕尔帖装置上，其作用是如文中所述散发热量，此处前置放大器已从培养箱中移出。更好地展示培养皿的正确放置。使用经70%乙醇润湿的擦拭纸清洁阵列周边的电极接触点。确保MEA已正确放入较低位置，并扣紧盖子。必要时使用棉签对准阵列的电极接触点。在Neuro Writer软件中选择适合实验的设置。记录开关必须拨向上方。要将数据写入文件，请单击开始按钮以开始记录。此时，尖峰记录界面将显示持续运行的活动轨迹和背景噪声，偶尔会出现动作电位和活动簇。如果某个电极噪声过大，可能是由于前置放大器盖上的针脚未对齐、存在微小杂物、一滴培养基、电极表面退化，或盖子上透明膜重叠导致接触不良所致。检查接触针，必要时用浸有70%乙醇的棉签进行调整。单击“尖峰波形”标签，将屏幕视图切换至尖峰检测模式，动作电位将以静态的三毫秒长窗口显示。为刺激MEA上的神经网络，请在“记录设置”标签下训练salpa算法以减少刺激伪影，并在“在线设置”标签中激活salpa。开始记录后，点击 STEM 选项卡，设置合适的刺激范式，使用开环程序刺激一个电极，并观察培养皿中的反应。在开环部分选择适当的设置，然后按下开始。在主峰形选项卡和峰形波形选项卡中查看反应。本视频展示了在微电极阵列（MEA）上生长并形成连接网络的体外培养第七天的神经元和胶质细胞，微电极清晰可见。图中为神经网络两分钟内自发活动的点阵图，每个黑点代表一个动作电位。蓝色箭头指示了两次活动爆发。多个电极上的响应取决于神经网络的连接性。以下是16秒刺激诱发活动的点阵图。红色星号代表刺激。红色箭头显示了五个成功在多个电极上诱导出突触活动簇的刺激。偶尔，某些刺激不会引发簇状放电。在此蓝色箭头处，我们刚刚向您展示了如何在微电极阵列上培养、记录和刺激神经元网络。可能最重要的注意事项是防止培养物受到污染，并减少蒸发。如果使用带有半透膜的盖子（如此处所示），它们能够密封并防止蒸发和感染，您或许可以将培养物维持数月，甚至可能超过一年。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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如何以文化，记录和刺激神经网络的微电极阵列（多边环境协定）

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器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

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构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

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本视频展示了从小鼠原代螺旋神经节神经元（SGN）培养物中，在多电极阵列（MEA）上记录自发性和刺激依赖性神经元活动的方法。该过程包括MEA的清洗与准备、记录自发性神经元活动，以及施加可控的电刺激以识别刺激依赖性神经元活动。...

使用多电极阵列分析小鼠原代螺旋神经节神经元的神经活动

本视频展示了使用多电极阵列（MEA）设备记录的脊髓切片器官型共培养物的电生理信号。这些记录用于评估切片之间的神经元再生情况。观察到的同步电活动证实了神经再生的成功。...

用于评估共培养脊髓切片中神经元再生的电生理记录

本视频演示了使用多电极阵列（MEA）在三维共培养球体中测量突触生理学的实验步骤。该方法有助于理解三维球体内的神经网络动态以及突触网络簇状放电活动。...

利用多电极阵列测量三维共培养球体中的突触生理学

本视频展示了建立神经元-星形胶质细胞共培养体系以记录神经元网络活动的方法。将运动神经元与星形胶质细胞共培养于多电极阵列（MEA）培养板上后，利用MEA对外记录神经元网络的同步节律性电活动。...

记录神经元-星形胶质细胞共培养体系中神经网络的电生理活动

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

我们介绍一种在多电极阵列上培养原代小鼠螺旋神经节神经元外植体的方案，用于研究神经元的反应特性并优化刺激参数。此类研究旨在改善人工耳蜗植入体的神经元-电极界面，从而提高患者的听力效果，并降低设备的能量消耗。...

螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列电生理记录

在多电极阵列上培养的小鼠神经元细胞在接受电刺激后表现出反应增强。本方案演示了如何培养神经元、如何记录其活动，以及如何建立一种训练网络以响应特定刺激模式的实验方案。...

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将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

学习在微电极阵列上培养、记录和刺激神经元网络的方法，使用大鼠胚胎皮层神经元进行长期体外培养。该技术为研究神经网络活动、学习与记忆提供了可控的实验平台。

如何在微电极阵列（MEAs）上培养、记录和刺激神经元网络

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