Name: 使用微阵列的细菌基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: 学习使用微阵列技术进行细菌基因表达分析，通过间接标记法比较野生型与突变体样本的差异表达。该方法采用Cy3和Cy5荧光染料标记cDNA，可在单张芯片上同时检测约4000个基因的表达水平，为大规模基因表达谱研究提供可靠的技术方案。

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逆转录反应
将加热块调至70-80°C和42°C。此步骤也可使用水浴。若使用加热块，请加入适量水以确保受热均匀。
<ol>
<li>预变性反应<ol>
<li>取 3 μg RNA</li>
<li>用无RNase的水将体积调至 13 μl</li>
<li>加入 2.5 μl 随机六聚体引物（2mg/mL）</li>
</ol></li>
<li>充分混匀，于 70–80°C 孵育 8 分钟，随后置于冰上冷却 5 分钟。</li>
<li>配制反转录（RT）反应液（每反应 14.5 μl）： 
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>组分 </td>
<td>体积</td>
</tr>
<tr>
<td>5X 第一链缓冲液</td>
<td>6 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 M DTT </td>
<td>3 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>25X 氨基烯-dNTP 混合物</td>
<td>1.2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript II RT（200U/µl）</td>
<td>2.3 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>水 </td>
<td>2.0 μl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 * 对于 n 个反应，建议配制 n+0.5 份的总反应液（Master Mix），以确保用量充足。 </li>
<li>向已冷却的反应体系中加入 14.5 μl RT 反应液。</li>
<li>轻轻混匀（切勿涡旋），于 42°C 孵育 3–4 小时。</li>
<li>如需保存，样品可置于 -20°C 条件下。</li>
</ol>
水解 RNA
<ol>
<li>向每个样品中加入 3 µl 的 1 N NaOH 和 0.6 µl 的 0.5 M EDTA。（终浓度 = 100 mM NaOH，10 mM EDTA）</li>
<li>混匀后于 65°C 孵育 10 分钟。</li>
<li>加入 33.6 μl 的 1 M HEPES（pH = 7.0）进行中和（终浓度 = 500 mM HEPES）</li>
<li>如有需要，样品可在 -20°C 保存。</li>
</ol>
反应纯化：去除未掺入的 aa-dUTP 和游离胺
注意：本纯化方案经由Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒方案修改而来。磷酸洗涤缓冲液和洗脱缓冲液替代了Qiagen提供的缓冲液，因为Qiagen的缓冲液含有游离胺，会与Cy染料偶联反应竞争。也可使用该试剂盒中的离心柱。
<ol>
<li>将cDNA反应产物与300 µl（或5倍反应体积 = 336 μl）缓冲液PB（Qiagen提供）混合，转移至QIAquick柱中。</li>
<li>将柱子放入2 ml收集管（Qiagen提供）中，以约13,000 rpm离心1分钟。弃去收集管中的废液。</li>
<li>洗涤时，向柱中加入750 µl磷酸盐洗涤缓冲液（非Qiagen提供），以约13,000 rpm离心1分钟。</li>
<li>弃去收集管中的废液，重复一次750 µl洗涤缓冲液的洗涤及离心步骤。</li>
<li>弃去收集管中的废液，将柱子在最大转速下再离心1分钟。</li>
<li>将柱子转移至一个新的1.5 mL微量离心管中，小心加入30 µl磷酸盐洗脱缓冲液。（参见溶液配制部分）</li>
<li>室温孵育1分钟。</li>
<li>以约13,000 rpm离心1分钟进行洗脱。</li>
<li>重复步骤6–8，用另外30 µl磷酸盐洗脱缓冲液进行第二次洗脱，收集至同一管中。最终洗脱体积应约为60 µl。</li>
<li>此时可对cDNA量进行定量：        cDNA含量（ng）=（稀释倍数）×（OD260）×（37）×（从柱子中洗脱的总体积）</li>
<li>在45°C条件下使用真空浓缩仪干燥样品。</li>
<li>如需长期保存，样品可存放于-20°C。</li>
</ol>
将氨基酸-cDNA与Cy染料酯偶联
<ol>
<li>如有必要，用 10 μl 50 mM Na-碳酸氢盐缓冲液（pH = 9.0）重悬氨基烯基标记的 cDNA。（该缓冲液应每两周新鲜配制一次）</li>
<li>在避光环境中操作，将探针加入适量的 Cy 染料管中。用移液器吹打数次以充分重悬染料。</li>
<li>在室温避光条件下孵育反应体系 1 小时。（孵育时间最长可达两小时）</li>
</ol>
反应纯化 II：去除未偶联的染料
<ol>
<li>向反应体系中加入 35 µl 100 mM NaOAc（pH 5.2），充分混匀。</li>
<li>向每个样品中加入 250 µl（或 5 倍反应体积 = 225 μl）Buffer PB（Qiagen 提供），通过移液器上下吹打混匀。</li>
<li>将 QIAquick 离心柱放入一个 2 mL 收集管（Qiagen 提供）中，将样品加入离心柱中，以约 13,000 ×g 离心 1 分钟。弃去收集管中的液体。</li>
<li>洗涤步骤：向离心柱中加入 0.75 mL Buffer PE（Qiagen 提供），以约 13,000 ×g 离心 1 分钟。</li>
<li>重复步骤 4。</li>
<li>弃去收集管中的液体，将离心柱在最大转速下额外离心 1 分钟。</li>
<li>将离心柱放入一个干净的 1.5 mL 微量离心管中，小心地将 30 µl Buffer EB（Qiagen 提供）加至离心柱膜的中心位置。</li>
<li>室温孵育 1 分钟。</li>
<li>以约 13,000 rpm 离心 1 分钟，进行洗脱。</li>
<li>重复步骤 7–9，将洗脱液再次收集至同一离心管中。最终洗脱体积应约为 60 µl。</li>
</ol>
标记反应的分析
此时可以对cDNA和标记物的量进行定量：
<ul>
<li>测定 OD 260、550 和 650（空白对照为水），使用 Nanodrop 微阵列程序。</li>
<li>根据下方提供的公式计算染料掺入的 pmol 数、DNA 的 pmol 数以及核苷酸/染料比值：                  核苷酸 pmol 数 = [OD260 × 体积 (μL) × 37 ng/μL × 1000 pg/ng] / 324.5 pg/pmol</li>
</ul>
注意：cDNA 的 1 OD260 = 37 ng/μL；dNTP 的平均分子量为 324.5 pg/pmol         Cy3 的 pmol 数 = OD550 × 体积 (μL) / 0.15         Cy5 的 pmol 数 = OD650 × 体积 (μL) / 0.25         核苷酸/染料比例 = cDNA 的 pmol 数 / Cy 染料的 pmol 数
如果使用 Nanodrop，它会直接给出每种染料的 pmol/μl 值。您只需将该数值乘以体积，即可得到染料标记的总 pmol 数。
注意：&gt;150–200 pmol 的染料掺入量（每样本）且每染料分子对应的核苷酸少于20个的比率，适用于杂交反应。
<ul>
<li>样品可在 -20°C 避光保存。
<ul>
<li>将要杂交的探针混合，并在 42°C 下用真空浓缩仪干燥。</li>
<li>样品可在 -20°C 保存，直至准备进行杂交。</li>
</ul>
</li>
</ul>
杂交前玻片
<ol>
<li>将载玻片正面朝下放置在洁净的红色载片架中，浸入100 mL室温水中，浸泡3-5分钟</li>
<li>将载玻片正面朝上置于100°C加热板上数秒，快速干燥——注意观察直至冷凝水完全消失</li>
<li>以250 mJoules进行紫外交联（在紫外交联仪中输入2500）</li>
<li>将载玻片浸入预热至42°C的水中进行水合，然后在室温下以700 RPM转速离心5分钟</li>
<li>将载玻片放入含有预热杂交前阻断液（5XSSC、1% BSA、0.1% SDS）的50 mL Coplin染色缸中，于42°C孵育至少45分钟；必要时可延长孵育时间。 50 mL 杂交前阻断液配方：12.5 mL 20x SSC，10 mL 5% BSA，0.5 mL 10% SDS，27 mL 水 </li>
<li>将载玻片浸入预热的42°C水中，轻轻振荡数分钟，以彻底去除杂交前阻断液</li>
<li>用异丙醇冲洗载玻片，并在室温下以700 rpm转速离心5分钟，使其干燥</li>
</ol>
准备用于杂交的样品
<ol>
<li>将探针重悬于水中（体积如下所示） 
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>总体积 = 30 μl </td>
<td>总体积 = 35 μl </td>
<td>总体积 = 40 μl </td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>19.8 μl 水 </td>
<td>23.55 μl 水 </td>
<td>27.2 μl 水 </td>
<td> </td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 μl</td>
<td>1.5 μl</td>
<td>1.5 μl</td>
<td>10 mg/ml 鲑鱼精DNA（Invitrogen）</td>
</tr>
<tr>
<td>1.2 μl</td>
<td>1.2 μl</td>
<td>1.2 μl</td>
<td>12.5 mg/ml tRNA</td>
</tr>
<tr>
<td>4.5 μl</td>
<td>5.25 μl</td>
<td>6 μl</td>
<td>20X SSC（终浓度为3X）</td>
</tr>
<tr>
<td>3 μl</td>
<td>3.5 μl</td>
<td>4 μl</td>
<td>1% SDS</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 注意：试剂的添加顺序至关重要。请勿配制预混液。 </li>
<li>煮沸&nbsp;5 分钟，然后在 14,000 rpm 下离心 5 分钟。在室温下冷却&nbsp;2 分钟。</li>
</ol>
杂交
<ol>
<li>在杂交室每侧边缘及中间的孔中加入 10–12 µl 的 3X SSC。</li>
<li>将洁净的盖玻片置于玻片的适当区域，并轻轻加入杂交溶液（30–40 μl）。盖玻片两侧应有少量样品溢出。</li>
<li>将玻片放入杂交室中，拧紧螺丝，然后置于 65°C 水浴中过夜。切勿将杂交室直接放置在水浴底部。在最上层的杂交室上方放置一个支撑块以固定所有组件。保持水浴盖子关闭，以保护对光敏感的样品。</li>
</ol>
杂交洗涤
<ol>
<li>配制以下缓冲液：
<ul>
<li>1X SSC，0.05% SDS</li>
<li>0.06 X SSC</li>
</ul>
</li>
<li>孵育结束后，打开杂交室。将载玻片从杂交室中取出，注意不要扰动盖玻片。</li>
<li>为去除盖玻片，将载玻片浸入盛有温热的1X SSC、0.05% SDS洗涤缓冲液的培养皿中，使盖玻片面朝向培养皿底部。通过左右移动载玻片，盖玻片将自行脱落。</li>
<li>去除盖玻片后，将载玻片放入装有新鲜温热1X SSC、0.05% SDS缓冲液的染色架中，振荡数分钟。</li>
<li>将载玻片连同染色架转移至0.06 X SSC的缓冲液浴中。</li>
<li>将载玻片转移至另一含有新鲜染色架的0.06 X SSC缓冲液浴中，在放入新缓冲液前，先用纸巾轻压载玻片以尽可能去除含SDS的缓冲液。</li>
<li>振荡载玻片数分钟。</li>
<li>立即在&nbsp;室温下以700 rpm离心5分钟，随后载玻片即可进行扫描。在扫描前需避光保存。</li>
</ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-氨基烯丙基)-2&amp;rsquo;脱氧尿苷-5&amp;rsquo;三磷酸</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP 混合液，PCR 级</td></tr><tr><td>随机六聚体引物</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3 mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200 U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>标记后反应性染料试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制 1 M 磷酸盐缓冲液（KPO4，pH 8.5–8.7）：取 9.5 mL 1 M K2HPO4 与 0.5 mL 1 M KH2PO4 混合</td></tr><tr><td>磷酸盐洗涤缓冲液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制 100 mL 磷酸盐洗涤缓冲液（5 mM KPO4，pH 8.0，80% EtOH）：混合 0.5 mL pH 8.5 的 1 M KPO4、15.25 mL MilliQ 水和 84.25 mL 95% 乙醇。缓冲液将略显浑浊。**重要提示：磷酸盐洗涤缓冲液需每日新鲜配制。</td></tr><tr><td>磷酸盐洗脱缓冲液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>用无菌水将 pH 8.5 的 1 M KPO4 稀释至 4 mM</td></tr><tr><td>碳酸钠缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>（Na2CO3）：0.5 M，pH 9.0。将 4.2 g NaHCO3 溶于 80 mL 无菌水中，用 10 N NaOH 调节 pH 至 9.0，再用无菌水定容至 100 mL。用于染料偶联反应时，用水稀释 10 倍得到 50 mM 溶液。注意：碳酸盐缓冲液会随时间改变组成，建议每两周至一个月新鲜配制一次。</td></tr></tbody></table>

使用微阵列进行细菌基因表达分析

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

大家好，我叫Ena，我们在实验室常规进行基因表达谱分析。我们使用这种技术来监测甲基化型与野生型之间差异表达的基因。今天，我准备了野生型和甲基化型的RNA样本，接下来我们将首先进行cDNA合成。我们采用间接标记方法，该技术的优势在于可避免直接标记中可能出现的视觉偏差。为此，我们准备了RNA样本，并选择将3微克RNA溶于13微升总体积中。随后，向我们的反应体系中加入2.5微升随机引物（random hexamers）。将样品在75°C下孵育8分钟，以使RNA变性。随后加入逆转录反应体系，其中包含dNTP混合物、逆转录缓冲液以及逆转录酶，混匀后于42°C孵育4小时。4小时后取出样品即可。现在试管中含有 cDNA 和 RNA 的混合物。接下来需要通过加入氢氧化钠和 EDTA 来水解 RNA，其中氢氧化钠的终浓度应为 100 摩尔，EDTA 的终浓度应为 5 摩尔。现在将样品在65摄氏度的水浴中孵育10分钟。孵育完成后，通过加入pH 7的HEPES缓冲液，使样品终浓度达到500摩尔。此时，可将样品储存于-20摄氏度，或继续进行纯化步骤。为了纯化cDNA，我们使用KaiGen PCR纯化试剂盒。然而，由于Bush缓冲液和离子缓冲液含有游离成分，因此我们不使用试剂盒中的这两种缓冲液，而是自行配制fate Bush缓冲液和fate离子缓冲液。接下来，加入300 µL的PPI，并缓慢吸取该溶液，然后将混合物转移至纯化柱中。在最高转速下离心一分钟，弃去流出液。随后，加入750 µL磷酸盐洗涤缓冲液，再次离心；之后再加入相同体积的洗涤缓冲液重复洗涤一次。因此，我们将再次离心，以确保完全收集到所有沉淀物。然后将这些管中的样品转移至空的离心管中。接着，我将加入30 µL磷酸盐E缓冲液，该缓冲液为pH 8.5的0.4 mol/L磷酸钾溶液。此时，您只需确保将所有物质加入到柱子的中心位置，并在室温下孵育一分钟。随后再次离心一分钟，然后加入 30 µL 洗脱缓冲液，在室温下孵育。之后取出柱子，最终得到的总体积为 60 µL 的 CDA 溶液。一旦我们纯化了cDNA，就可以将其在-20°C下保存；我们也可以将其干燥后再储存，例如可通过真空离心将cDNA干燥。现在离心管中的cDNA已呈干燥状态，且经过了修饰。接下来的操作是，我将用溶液重新悬浮该干燥样品。我将用10 μL pH为9的15 mmol/L碳酸氢盐缓冲液重悬样品。在此步骤中，只需上下吹打即可，这一步非常重要，必须充分重悬cDNA。为了确保标记反应顺利进行，该反应应在避光条件下进行，因为荧光标记物对光敏感。然而，这些来自生命科学领域的选项是单独包装的。S5 带有紫色盖子，而侧边的 3 号带有橙色盖子；此外，S5 在悬浮时呈现青色，Cary 呈现品红色。因此，我将在暗室中将这些样品转移至染料管中，重新悬浮染料，然后再将其转移回我原有的试管

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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