Name: IP - FCM:免疫沉淀，流式细胞仪检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学习免疫沉淀结合流式细胞术检测蛋白质相互作用的方法，无需基因工程即可分析天然蛋白复合物。该技术适用于小样本量，具有高灵敏度和信噪比优势。

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本研究由老鹰创新奖（Fraternal Order of Eagles）和梅奥基金会资助。

**本视频实验方案基于一篇相关出版物1： 通过流式细胞术实现对天然蛋白质-蛋白质相互作用及多蛋白复合物的高灵敏度检测与定量分析。Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang W. A. Schamel, Ed Palmer. Science's STKE 2007 (389): pl2, 2007年6月5日，[DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]。<a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">请点击此处查看该出版物</a>。
开始前，请准备以下水溶液储备液：
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>MES 偶联缓冲液：</td>
 <td>储存于 25°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES, pH 6.0</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>淬灭/封闭/储存（QBS）缓冲液：</td>
 <td>储存于 4°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>叠氮化钠</td>
 <td>0.02%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS, pH 7.4</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FCM 缓冲液：</td>
 <td>储存于 4°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris, pH 7.4</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>100 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>叠氮化钠</td>
 <td>0.02%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>5%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS, pH 7.4</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
使用前立即配制：
<table>
<tbody>
 <tr>
 <td>EDAC-MES：</td>
 <td>将 EDAC 粉末溶解于 MES 偶联缓冲液中，配制成 50 mg/mL 的溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin 溶液（2% w/v）：</td>
 <td>将 digitonin 粉末溶于 dH2O 中，95°C 加热 5 分钟，然后置于冰上冷却</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>裂解缓冲液：</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris, pH 7.4</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>150 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin 溶液</td>
 <td>1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蛋白酶抑制剂</td>
 <td>1×</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>置于冰上保存</td>
 <td> </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
 
1. 单克隆抗体与磁珠的偶联
<ol>
<li>通过将购买的磁珠原液用 PBS 稀释，并使用血细胞计数板进行计数，确定其浓度。计数时可先进行 1:10000 的稀释。</li>
<li>用移液器将 18 × 106 个磁珠转移至 1.5 mL 微离心管中。</li>
<li>用 0.5 至 1.0 mL MES 偶联缓冲液洗涤磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。</li>
<li>将磁珠重悬于 50 μL MES 偶联缓冲液中。</li>
<li>加入 20 μL 新鲜配制的 EDAC-MES 溶液，以活化磁珠表面的羧基基团。</li>
<li>在 25°C 下轻轻混匀 15 分钟，通过手动反复吹打实现混合。</li>
<li>用 0.5 至 1.0 mL PBS 洗涤活化后的磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。</li>
<li>将活化后的磁珠重悬于 50 μL PBS 中。</li>
<li>向活化磁珠溶液中加入 50 μL IP 用单克隆抗体（储存浓度为 0.2–1.0 mg/mL）。</li>
<li>将离心管置于振荡摇床中，在 25°C 下混合 3 至 4 小时，振荡速度应足够防止磁珠在管底沉积。</li>
<li>用 0.5 至 1.0 mL PBS 洗涤抗体偶联磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。</li>
<li>将磁珠重悬于 100 μL QBS 缓冲液中。此悬液可在 4°C 下保存。</li>
<li>充分重悬磁珠后，用 PBS 稀释 1:200 至 1:10,000，使用血细胞计数板进行计数。每批制备的磁珠均需测定浓度，以便精确控制每次免疫沉淀或拉下实验中所使用的磁珠数量。</li>
</ol>
2. 核上清裂解液的制备与免疫沉淀
裂解方法和最佳裂解条件取决于所研究的细胞类型和蛋白质-蛋白质相互作用。已有多种方案可供选择，并可根据具体应用进行调整。
<ol>
<li>在1.5 mL微量离心管中，将20 × 106 个“小”细胞（如淋巴细胞）或5 × 106 个“大”细胞（如巨噬细胞或肿瘤细胞）加入100 μL新鲜裂解缓冲液中，冰上裂解20分钟。根据需要调整裂解液体积。</li>
<li>为去除细胞核及不溶性细胞碎片，将裂解液在4°C下以20,000g离心10分钟。保留上清液，弃去沉淀。</li>
<li>向澄清的裂解液中加入0.5 × 105 至2.5 × 105 个抗体偶联磁珠，轻轻吹打混匀。单次免疫沉淀（IP）所用的最小体积为5 μL。</li>
<li>置于4°C冷藏室内的垂直旋转仪上，旋转4小时至过夜。设置适当的转速以防止磁珠沉降。低体积免疫沉淀反应中液体停留在管底是可接受的。</li>
</ol>
3. 使用荧光染料标记抗体检测磁珠捕获的蛋白质
<ol>
<li>用 0.2 至 1.0 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗 IP 磁珠两次，每次清洗后在 4°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。</li>
<li>将磁珠重悬于 100 μL FCM 缓冲液中，并将 20 μL 分装至五个或更多 1.5-mL 微量离心管或烟囱底板的孔中。</li>
<li>向样品中加入荧光染料偶联的单克隆抗体。根据试剂供应商的说明或经验确定的浓度进行 FCM 染色。作为起始参考，每管或每孔加入 0.2 至 1 μL 原液抗体溶液（浓度为 0.2–1.0 mg/mL），冰上孵育 40 分钟。</li>
<li>对于 1.5-mL 离心管中的染色磁珠，用 1.0 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗两次，每次清洗后在 4°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。每次离心后小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。对于烟囱底板，每次使用 0.2 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗，每次清洗后在 4°C 下以 1000g 离心 5 分钟。此步骤可使用多通道移液器操作。从烟囱底板的孔中去除上清液时，可将板快速甩动一次，然后在保持倒置状态下，用吸水纸轻拍孔边缘以吸去残留液滴。每个孔中残留的体积（含磁珠）约为 20 μL。</li>
<li>将每份样品的磁珠重悬于 200 μL FCM 缓冲液中，转移至已标记的 FACS 管中。样品现可进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
4. 流式细胞术数据采集
本方案中描述的CML磁珠直径为3至5 μm，约为静息小鼠淋巴细胞直径的一半。因此，可能需要手动增加前向散射（FSC）放大增益和侧向散射（SSC）电压，以使磁珠事件群落在图谱上正常显示。单个免疫沉淀磁珠应形成一个紧密聚集的单一细胞群。应调整仪器设置和设门范围，以排除磁珠双联体和碎片。
<ol>
<li>在运行微珠或微珠标准品之前，移除某些流式细胞仪样品入口周围用于防止液滴飞溅的套管。在样品之间让鞘液滴出，以清洗入口，防止微珠从一个样品携带到下一个样品中。</li>
<li>使用未标记微珠作为荧光阴性对照，以及彩虹校准微粒（Rainbow Calibration Particles, RCPs）作为荧光阳性对照，调整仪器设置，使阴性和阳性荧光信号的极端值同时显示在对数尺度的x轴上。这可确保实验样品的荧光信号也处于量程范围内。注意RCPs比CML微珠小，因此可能需要临时调整FSC和SSC参数以及设门位置以适应该样品。</li>
<li>完成RCPs校准后，恢复至未标记微珠的设置。若每个样品仅使用一种荧光探针，则无需进行荧光补偿。通常情况下，我们对每个流式细胞术（FCM）样品使用单一荧光素标记的单克隆抗体来检测多蛋白复合物，并通过平行染色多个微珠样品，分别使用针对不同亚基的特异性单克隆抗体，来分析多个相互作用组分。</li>
<li>采集并保存荧光数据文件。随后可使用CellQuest、FlowJo或CFlow等流式细胞术分析软件进行数据分析。</li>
</ol>
5. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="显示PE荧光的流式细胞术直方图；TCR-β、CD3-ε峰；细胞表面标志物分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. TCR/CD3多蛋白复合物的免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）分析。 来自BALB/c小鼠品系的T细胞在1%皂苷中裂解，裂解液使用抗CD3ε磁珠进行IP-FCM分析。捕获的复合物中含有大量TCR-β（紫色区域）以及共结合的CD3-ε（绿色），而其他蛋白如Thy1.2、CD45或H-2K(d)的信号接近背景水平（由无关免疫球蛋白探针定义，粉色曲线；分别为棕色、橙色和蓝色曲线）。参见此前发表的类似结果1-6。

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

蛋白质相互作用的信息对于分析多种细胞过程（如信号转导、谱系成熟、细胞周期进程和凋亡级联反应）具有重要意义。免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）提供了一种快速、定量且灵敏的方法，用于检测蛋白质间的相互作用，并鉴定多蛋白复合物中的成员，且可在其天然构象下进行分析。实验中可将微珠与细胞裂解液在一天内完成偶联和孵育，次日即可进行探针检测与分析。采用96孔板格式可实现高通量样本的同时检测，从而高效收集用于统计分析或筛选的数据。通过使用荧光微珠标准品，可估算每个微珠捕获的蛋白质分子数量。该方法对起始样本量需求极低，因此即使来源有限的样本或低丰度分析物也可用于多种相互作用的研究。尽管IP-FCM无需基因工程、表位标记、变性或 体外 在非生理环境中混合蛋白质时，可将其与这些及其他技术联用，使其成为一种适用于多种生物系统的有价值且易于使用的工具。
故障排除：
许多免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）实验在首次尝试时即可产生有价值的蛋白质相互作用数据。然而，优化IP-FCM可改善抗体与微珠的偶联、蛋白质复合物的捕获以及荧光探针的结合。
IP 抗体偶联的效率可通过直接使用抗免疫球蛋白抗体检测偶联后的磁珠来确定。如果偶联效率较低，可在偶联反应中提高抗体浓度，从而使更多的 IP 抗体结合到每个磁珠上。这可以增加 IP 磁珠批次的结合能力，进而增强对分析物的捕获和检测。偶联反应过程中不应存在其他含伯胺的分子（例如 Tris、牛血清白蛋白），因为这些分子会与单克隆抗体（mAb）竞争磁珠表面的结合位点，导致 mAb 偶联效率降低。如果由于其他原因导致 mAb 与磁珠的偶联困难，可改用将磁珠与亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）偶联，随后使用生物素标记的抗体通过非共价结合的方式进行免疫沉淀。
尽管抗体偶联效果良好，但最初检测到的微珠相关荧光信号可能较低。首先，复合物的捕获效率本身可能较低。由于免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）依赖于分析物的浓度，增加每单位裂解体积所裂解的细胞数量可提高分析物的捕获和检测水平。此外，通过减少与裂解液共同孵育的免疫沉淀微珠数量，可使捕获的复合物分布在更少的微珠上，从而在探针检测时提高每个微珠的平均荧光强度。其次，可能存在免疫沉淀抗体在空间位阻上阻碍探针抗体接近已捕获复合物的情况。此时，可通过更换不同的抗体用于捕获和/或检测来解决该问题。

<table><tbody><tr><td>羧基修饰的聚苯乙烯胶乳（CML）微珠（5mm 无表面活性剂）</td><td>试剂</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>4&amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td>彩虹校准微粒</td><td>试剂</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>4&amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td>2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDAC）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>-20&amp;#x00B0;C 干燥条件下保存。</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂通用混合液，含 AEBSF、Bestatin、Aprotinin、EDTA、E-64 和 Leupeptin</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 100 倍储存液。分装后于 -20&amp;#x00B0;C 保存。操作时佩戴手套。</td></tr><tr><td>PCR 板，96 孔，0.2 mL，无色，高壁</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>用于流式细胞术染色过程中替代微量离心管</td></tr></tbody></table>

ip-fcm：通过流式细胞术检测的免疫沉淀

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

流式细胞术检测免疫沉淀（IP-FCM）是一种高效检测和定量蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该方法的基本原理延伸自夹心ELISA，即被捕获的目标蛋白可与其在多蛋白复合物中物理结合的其他分子一同被检测。该操作流程包括：将针对目标蛋白的免疫沉淀单克隆抗体（mAb）共价偶联到聚苯乙烯乳胶微珠上，将这些微珠与细胞裂解液孵育，使用荧光染料标记的探针检测被捕获的蛋白复合物，并通过流式细胞术分析微珠相关的荧光信号。IP-FCM具有极高的灵敏度，允许分析蛋白质的天然（非变性）状态，适用于半定量或定量分析。此外，IP-FCM无需基因工程操作或除流式细胞仪以外的特殊设备，且易于扩展用于高通量应用。

本文介绍了IP-FCM方法，该方法无需基因工程或大量样本，即可对天然蛋白质-蛋白质相互作用进行灵敏、稳健的生化分析。

IP-FCM：通过流式细胞术检测的免疫沉淀

免疫沉淀结合流式细胞术（IP-FCM）是一种用于检测和定量蛋白质-蛋白质相互作用的高效方法。其基本原理……

在免疫沉淀流式细胞术（IP FCM）实验中，通过将蛋白质复合物捕获在微球上，以鉴定并研究相互作用的多种蛋白质。首先，将针对目标蛋白的特异性免疫沉淀抗体共价偶联到聚苯乙烯乳胶微球上。第二步，将这些微球与细胞裂解液孵育，使目标蛋白及其相互作用蛋白结合到微球上。将磁珠及其捕获的蛋白质进行洗涤，然后用针对可能与免疫沉淀蛋白相关的各种分子的荧光标记抗体进行孵育。最后，通过流式细胞术分析荧光标记的磁珠，以确定哪些蛋白质存在于捕获的复合物中，哪些不存在。该技术相较于其他方法（如免疫沉淀后进行蛋白质印迹）的优势在于，I-P-F-C-M 能够在无需基因工程操作或大量样本的情况下，评估天然状态下的蛋白质-蛋白质相互作用。I-P-F-C-M 即使在可用于分析的生物材料极少时也能产生高信噪比，因为它可以使用小体积和低浓度的分析物进行。开始此操作前，准备以下缓冲液：MES 偶联缓冲液、淬灭阻断储存缓冲液（简称 QBS）以及流式细胞术（FCM）缓冲液。通过将羧基修饰的聚苯乙烯乳胶微球（即 CML 微球）稀释于 PBS 中，并使用血细胞计数板计数，来确定其浓度。确定磁珠浓度后，用移液器将18 × 10⁶个磁珠转移至1.5毫升微量离心管中。用0.5至1毫升MES偶联缓冲液洗涤磁珠2至3次，每次在室温下以20,000 × g离心3分钟。每次洗涤过程中，磁珠离心时进行后续操作。制备新鲜的MES缓冲液，用于活化磁珠。完成洗涤后，将缓冲液置于室温或冰上保存。最后一次洗涤后，用50 µL MES偶联缓冲液重悬磁珠。然后向珠子悬浮液中加入 20 µL EEC MES。为了活化珠子上的羧基，需在室温下轻轻混匀，通过手动反复吹打持续 15 分钟。尽管此步骤较为耗时，但这种混合方法在混合后可获得最佳效果。将活化的磁珠用 0.5 至 1 毫升 PBS 离心洗涤两到三次，每次 20,000 × g，室温下离心 3 分钟。每次洗涤后以及最后一次洗涤后，将活化的磁珠重悬于 50 微升 PBS 中，用于将免疫沉淀抗体与磁珠偶联。加入 50 微升免疫沉淀单克隆抗体，抗体储存浓度为 0.2 至 1 毫克/毫升。确保除抗体外不存在含伯胺的分子。此类含胺分子（如Tris或牛血清白蛋白）会与抗体竞争结合磁珠。将磁珠-抗体悬液在室温下于振荡摇床上混合三至四小时。充分振荡以防止磁珠在管底沉淀。结合后，用0.5至1毫升PBS洗涤抗体偶联磁珠两到三次，每次在20,000 ×g下离心。每次洗涤后，在室温下离心重力作用三分钟。最后将磁珠重悬于 100 µL 的 QBS 缓冲液中。单克隆抗体与 CML 磁珠的偶联效果可通过使用荧光标记的抗 IgG 抗体对磁珠进行染色来检测。随后进行流式细胞术（FCM）分析，包被单克隆抗体的磁珠可在4°C保存，直至可用于免疫沉淀（IP）实验。首先充分重悬磁珠，用PBS按1:200至1:10,000的比例稀释，并使用血细胞计数板进行计数。每次制备批次均需测定浓度，以便精确控制每次IP实验中所使用的磁珠数量。接下来，用蒸馏水配制2%（重量/体积）的新鲜消化液。在95摄氏度加热5分钟，然后置于冰上冷却。稀释后，将样品以1%（重量/体积）的比例加入新配制的裂解缓冲液中，并置于冰上保存。根据所示表格确定用于裂解的细胞数量作为参考指南。然而，所需细胞数量取决于目标蛋白，必须通过实验经验确定。此处使用30 × 10⁶个来自小淋巴细胞肿瘤细胞系的细胞。将所需体积的细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，在20,000 × g条件下离心收集细胞。在 4°C 条件下离心 30 秒，吸除上清液。加入适量新配制的 Dig 裂解缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀沉淀。然后将细胞置于冰上裂解20分钟。需要注意的是，根据细胞类型及所研究的蛋白质-蛋白质相互作用，细胞裂解条件可能有所不同，必须通过实验经验确定裂解是否完全。通过以20,000 × g离心裂解液，去除细胞核和不溶性细胞碎片。重力作用下，在4°C条件下静置10分钟。保留上清液（SNA），弃去沉淀，以使目标蛋白与抗体包被的磁珠结合。将50,000至250,000个偶联单克隆抗体的磁珠加入澄清裂解液中，轻柔吹打混匀。用于单次免疫沉淀的裂解液体积最少为五微升。将澄清的裂解液与珠粒混合物置于低温室中，在设定适当转速的旋转垂直轮上孵育四小时至过夜，转速需足以防止珠粒沉降到管底；在旋转过程中，液体可始终位于管底。在目标蛋白与免疫沉淀抗体结合之后。接下来对免疫复合物进行荧光标记。用一毫升预冷的FCM缓冲液洗涤免疫沉淀珠两次，每次在4摄氏度下以20,000 × g离心三分钟。每次洗涤后，将珠子重悬于100微升FCM缓冲液中，并分装20微升至五个或更多样品管中。1.5 毫升微量离心管或烟囱底板的孔。两者均在图中显示。向样品中加入荧光染料偶联的单克隆抗体。按照试剂供应商的说明或根据经验确定的起始浓度进行流式细胞术染色。每管或每孔加入 0.2 至 1 微升浓度不低于 0.1 毫克/毫升的抗体原液，在冰上孵育 40 分钟。用 1 毫升预冷的缓冲液在 1.5 毫升离心管中将标记的微球洗涤两次。FCM缓冲液，4°C下以20,000 × g离心3分钟。每次洗涤后，轻轻去除上清液，注意不要扰动磁珠。或者，对于烟囱式板，用 0.2 毫升预冷的 FCM 缓冲液在 4°C 下以 1000 × g 离心 5 分钟，洗涤底部板两次。每次洗涤后，每次洗涤后。为去除磁珠上的上清液，将板轻弹一次，然后在板仍处于倒置状态时，用吸水纸吸去孔边缘的液滴。每个含有珠子的孔中残留体积约为20微升。每份样品用200微升FCM缓冲液重悬珠子，转移至标记好的离心管中。样品现可进行流式细胞术或Becton Dickinson流式细胞仪检测。移除可能包裹在样品入口或吸管口周围的液滴防溅套。在样品之间让吸管口自然滴落，以防止微珠从一个样品携带到另一个样品。此处使用的CML微珠直径为三到五微米，约为静息小鼠淋巴细胞直径的一半。因此，可能需要手动增加前向散射放大增益和侧向散射电压，以便使微球事件群体能够在流式细胞仪上被检测到。此处使用未标记或空白微球进行该操作。在读取前，通过调整Gating设置以排除微球、双联体和碎片。实验样本可确保荧光信号处于合适量程。未标记的微球作为荧光的阴性对照，而彩虹校准微粒（RCPs）可作为荧光的阳性对照。由于RCPs比CML微球小，因此在检测该样本时，可能需要临时调整前向散射和侧向散射参数以及门控位置。完成这些校准后，负值和正值荧光极端值将在对数轴上显示。使用校准微球完成校准后，需恢复至未标记微球的前向散射和侧向散射设置。只要每个样本仅使用一种荧光探针（如此处所示实验），则无需进行荧光补偿。现在采集并保存荧光数据文件，随后使用流式细胞术分析软件（如 Cell Quest 或 FlowJo）进行分析。以下是小鼠 T 细胞 LY 在 1% digitonin 中进行免疫沉淀流式细胞术（IP FCM）分析的结果。TCR-CD3 非蛋白复合物使用抗 CD3ε 磁珠进行沉淀。捕获的复合物中含有大量的TCRβ以及共相关的CD3ε。通过使用无关免疫球蛋白探针或针对TH1.2、CD45或H2KD蛋白的抗体检测发现，其他蛋白的水平接近背景值。该技术相较于免疫沉淀后进行蛋白印迹等其他方法的优势在于，I-P-F-C-M能够在无需基因工程改造或大量样本的情况下，用于评估天然状态下的蛋白质-蛋白质相互作用。即使可用于分析的生物材料极少，I-P-F-C-M仍能实现高的信噪比，因其可在小体积和低分析物浓度条件下完成。

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。...

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

本文介绍了一种通过从脂肪组织中分离免疫细胞，并随后使用流式细胞术进行分析，以检测脂肪组织中免疫细胞成分的方法。...

利用流式细胞术对人体脂肪组织中的免疫细胞进行表征

成像流式细胞术为在单细胞和群体水平上检测细胞的形态学和功能改变提供了理想方法。通过结合基因表达的转录组学分析与蛋白质转运的形态学示证，揭示了暴露于污染物的人树突状细胞在脂质抗原呈递中的内吞功能受损。...

整合成像流式细胞术与转录组学分析以评估内吞性CD1d运输的改变

本方案描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定可抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。...

一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。...

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

学习免疫沉淀结合流式细胞术检测蛋白质相互作用的方法，无需基因工程即可分析天然蛋白复合物。该技术适用于小样本量，具有高灵敏度和信噪比优势。

IP-FCM：通过流式细胞术检测的免疫沉淀

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