Pseudofracture:急性周围组织的创伤模型

当长骨（如股骨或胫骨）发生骨折时，受损的肌肉和软组织会暴露于断裂的骨碎片和骨髓中。随后，机体将产生强烈的免疫反应以促进组织修复。通过获取股骨和胫骨，可建立用于研究此类暴露效应的模型。

取自供体小鼠。将骨骼碾碎以制备骨溶液，随后将其注射到受体小鼠受伤的大腿部位。通过监测免疫反应并评估远端器官损伤，以研究骨折所致创伤的长期影响。

与现有的外周组织创伤方法（如双侧股骨骨折模型）相比，该技术的主要优势在于，这种假骨折模型允许动物长期存活，且不会出现长时间麻醉或复杂骨折固定技术所导致的并发症，因此可用于研究创伤后期的免疫反应。在开始操作前，准备好以下物品：一个冰桶、聚维酮碘、手术器械、止血钳、研钵和研杵、镊子、20号针头、1 mL注射器、PBS麻醉剂以及异氟烷鼻罩。使用单只经安乐死处理的、年龄和体重相匹配的动物。

一只供体小鼠应能为三只受体提供足够的材料。将供体小鼠固定在有机玻璃板上，注意仅用胶带固定其足部末端。仔细剃除下肢的毛发。

然后用聚维酮碘和酒精完全覆盖以确保无菌，从下肢取出长骨，在腹股沟区域的皮肤上做手术切口，并沿肢体长度向下切至踝部，将皮肤牵开并从皮下筋膜和肌肉上解剖分离，包括内侧和外侧部分。然后将剪刀的一个刀片插入位于胫骨前方和外侧的肌肉下方。上下滑动刀片，将肌肉从下方骨骼上干净地剥离。

在胫骨后侧和内侧下方重复此操作，以分离位于胫骨下方的肌肉。当向远端滑动时，在腿部肌肉近端处将腓骨从胫骨上折断，此时在后侧应尽量减少额外用力。尽可能靠近肌腱止点处将其切断，并在向下牵拉整组肌肉的同时，将肌肉向远端推开，稍加牵拉即可使远端附着点从踝关节分离，随后用剪刀剪断踝关节。

此时不要将胫骨从股骨上分离，这一连接可提供额外的杠杆作用，有助于从髋关节解剖分离股骨。采用类似技术松解股骨上的肌肉。必要时在后侧以及内侧和外侧均进行操作。

切断这些肌群的远端附着点，以使其从膝关节松解。根据需要延长皮肤切口，以获得充分暴露，并在肌肉下方进行分离。为将股骨末端从髋关节中解剖出来，取出供体小鼠的股骨及附带的胫骨，并将其置于无菌纱布上。

通过分别用双手握住每根骨头，并沿其长轴轻轻反向扭转或旋转两根骨头，即可将膝关节处的两根骨头分开。为去除长骨上残留的肌腱附着物，可用一块4×4的纱布包裹住骨的全长，用力握紧后多次全程刮擦骨头，以清除表面残留的组织。

将收集的骨骼置于冰上的无菌 1.5 毫升微量离心管中。将供体骨骼运送至彻底消毒的生物安全柜中，用于骨组织悬液的制备。

应在超净台内准备好无菌敷料、无菌研钵和研杵、无菌镊子、无菌8毫升离心管、无菌PBSA、1毫升移液器及配套的移液器吸头、100微升移液器及配套吸头、1毫升注射器和20号针头。使用镊子将骨骼转移至研钵中，并用研杵轻轻研磨骨骼。向研钵中加入1毫升PBS，继续用环形运动研磨剩余的碎片，以确保充分重悬。

然后加入另一毫升 PBS，继续研磨以制备骨组织悬液，此时悬液应呈现粉红色。将悬液缓慢倒入 8 毫升离心管中，注意确保较大的残渣留在研钵内。将骨组织悬液转移至 1 毫升注射器中。

使用20号针头，骨组织溶液应保持在冰上。取一微升骨组织溶液滴加到麦康凯琼脂平板上，并均匀涂布于表面。将平板孵育24至48小时，以确保无菌状态。

通过脚趾夹捏法评估经戊巴比妥麻醉的小鼠的麻醉深度，以开始软组织损伤和骨内注射的手术操作。将小鼠仰卧固定于有机玻璃板上，使用奥斯卡五号电推剪（配40号刀头），将细条胶带粘面朝外松松地缠绕于各肢体远端，以固定动物。剃除小鼠腹部、腹股沟及大腿区域的毛发。

将小鼠转移至无菌手术区域。用碘伏擦拭手术部位，随后用酒精擦拭以进行消毒。

将一个鼻罩放在小鼠身上，鼻罩内放置一块含有1毫升99%异氟烷的纱布。当动物的呼吸开始减慢时，移除鼻罩。如果在操作过程中的任何阶段需要追加麻醉，可注射额外的戊巴比妥钠或给予异氟烷。

接下来，取一块无菌敷料，将其覆盖在小鼠身上，仅暴露其下肢和头部。该软组织损伤为双侧后肢挤压伤。确保小鼠后肢呈轻度外展和外旋位。

这有助于准确定位目标肌肉。将膝关节屈肌归为一组以进行挤压损伤操作，取一把较大的18厘米止血钳，将其凸面朝向股骨，夹住股骨后侧大腿肌肉的中点位置。仅锁定止血钳至第一声“咔哒”响，持续30秒。

将针头刺入皮肤2至3毫米，直至针尖斜面刚好接触股骨。在每侧压碎的大腿肌肉组织中各注入0.15毫升骨溶液。拔出针头，并迅速用无菌手套包裹的手指按压注射部位，防止骨溶液从伤口反流。

将手指保持在此位置数秒钟。将小鼠放回笼中，并在其麻醉效果逐渐消退后立即恢复其自由活动。适当给予镇痛处理，以应对小鼠苏醒时可能出现的疼痛。

该总体示意图显示了创伤后在零小时时间点的双相免疫反应。创伤发生后，随即出现早期高炎症反应，该反应在6小时达到峰值，通过全身性炎症和远隔器官功能障碍的评估进行测定。

创伤后免疫反应的第二个组成部分是迟发性免疫抑制，表现为免疫细胞功能障碍，并在约48小时处呈现低谷。该图为代表性的血浆炎症性细胞因子反应示意图，发生在创伤早期，是全身性炎症的一个实例。通过肝损伤评估发现，远隔器官功能障碍在相似的时间范围内升高。

此代表性示意图用于突出显示创伤后期免疫细胞功能障碍。在进行该操作时，重要的是要始终注意确保实验过程中的无菌状态和精确操作。该模型并非真实的骨折模型或伤口感染模型。