Name: 确定失调卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习使用免疫组织化学双重标记技术检测卡波西氏肉瘤肿瘤组织中的病毒蛋白和宿主细胞蛋白，通过抗原修复、一抗孵育和显色反应实现可视化定位，为识别KSHV感染引起的失调宿主基因和开发潜在治疗靶点提供方法学支持。

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我们感谢梅哈里医学院的 James E.K. Hildreth 对本手稿提出的建议和审阅。我们还感谢 Diana Marver 对手稿的编辑工作。本研究得到了梅哈里范德比尔特艾滋病研究中心（NIH 资助号 P30 AI054999-05）、艾滋病健康差异研究中心（NIH 资助号 5U54 RR019192-05）、梅哈里临床研究中心（NIH 资助号 P20RR011792）以及 NIH 资助号 P01 CA113239 的支持。D.J.A 部分经费来自范德比尔特-梅哈里艾滋病研究中心（CFAR）和梅哈里临床研究中心（CRC）的试点资助项目。

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本报告中使用的方法可在多种实验室环境中进行，但需要一些特殊设备或核心设施的使用权。进行涉及传染性病毒病原体（如KSHV）的实验时，必须采取适当的预防措施，此类实验可能需要在生物安全三级（BSL-3）设施中操作。组织样本的获取还必须获得相应机构审查委员会（IRBs）的批准。
这些方法共同为鉴定表达失调的基因提供了基础 体外 并提供明确的方法 体内 验证内皮细胞中基因表达谱的改变以及基因递送策略。综合这些发现可能有助于阐明受KSHV感染以及特定病毒基因影响的生物化学通路。了解卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）等致癌病毒如何干扰特定分子通路，可为新型治疗手段的开发提供重要线索。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ bullet kits 补充剂</td></tr><tr><td>DMVEC 细胞 (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>腔室载玻片</td><td>Nalge Nunc International</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>KSHV LANA 单克隆抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 稀释/IFA</td></tr><tr><td>半乳糖凝集素-3 山羊多克隆抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 FITC 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 Rho 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 稀释/IFA</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield 含 DAPI</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊偶联抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Western 显色底物</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗山羊抗体</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-链霉亲和素偶联物</td><td>Dako</td><td>K 0492 (试剂盒)</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 和 DNase 的试剂套装</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler 扩增仪</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Photometer 分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>RC 6 Plus 离心机</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Optima L-90K 超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>MYiQ iCycler 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>TE 2000S 荧光显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200 显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

鉴定卡波西肉瘤相关疱疹病毒（kshv）诱导的失调基因

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

目前，卡波西肉瘤（KS）是非洲南部地区最 prevalent 的与艾滋病相关的恶性肿瘤，因此也是全球范围内最 prevalent 的此类肿瘤。1,2 它被定义为血管内皮细胞的血管增殖性肿瘤，并以胸腔积液淋巴瘤（PEL）和某些类型的多中心型Castleman病的形式产生罕见的B细胞淋巴增殖性疾病。3-5 卡波西肉瘤（KS）病灶中仅有1-5%的细胞能够主动支持与KS相关的卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的裂解复制，显然，在肿瘤发生及肿瘤进展过程中，细胞因子必须与病毒因子相互作用。6,7 鉴定促进卡波西肉瘤病理过程的新型宿主因子对于开发用于肿瘤进展和转移的预后标志物，以及研发治疗卡波西肉瘤的新型疗法至关重要。8 配套视频详细介绍了我们在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染后的皮肤微血管内皮细胞（DMVEC）以及卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织中，鉴定宿主细胞基因表达程序变化所采用的方法。9 通过微阵列分析鉴定出表达失调的基因后，利用免疫印迹和双标记免疫荧光法验证蛋白表达的变化。表达失调基因的转录水平变化也得到确认 体外 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行验证。 体外 使用存档的卡波西肉瘤肿瘤组织，通过双标记免疫组织化学和组织微阵列进行研究。8,10 我们鉴定卡波西肉瘤肿瘤组织微环境中失调基因的方法将有助于开发 体外 随后 体内 用于发现和评估卡波西肉瘤新型潜在治疗手段的模型系统

宿主细胞因子在卡波西肉瘤（KS）的发生和维持过程中起着关键作用。我们概述了鉴定在KSHV感染的DMVEC细胞及KS肿瘤组织中发生改变的宿主细胞因子的方法。病毒所改变的细胞基因可作为新型治疗手段的潜在靶点。

鉴定卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的失调基因

目前，卡波西肉瘤（KS）是非洲南部地区最 prevalent 的与 HIV/AIDS 相关的恶性肿瘤，因此也是全球范围内最 prevalent 的此类肿瘤。1,2 其特征为血管增生性……

本实验的总体目标是通过免疫组织化学方法对卡波西肉瘤肿瘤组织进行双重标记，以同时检测病毒蛋白和宿主细胞蛋白。首先通过加热暴露抗原，完成第一步。实验的第二步是应用与生物素偶联的一抗。该操作流程的第三步是加入链霉亲和素-酶结合物。最后一步是在组织中加入酶底物以进行显色反应。最终，可通过免疫组织化学染色获得结果，显示肿瘤组织中病毒蛋白和宿主细胞蛋白的定位情况。该方法可解答病理学领域的关键问题，例如在同一标本中鉴定感染性病原体以及异常调控的细胞基因。在通风橱内，将最多八张化学八联载玻片（每张含有固定石蜡包埋组织的5 µm切片）放入盛有二甲苯的 Coplin 瓶中。孵育10分钟，以去除石蜡并为双标记免疫组织化学染色做准备。将组织切片依次浸入100%、95%和70%的乙醇溶液中，每种浓度各5分钟进行复水。在抗原修复（即抗原去封闭）前，将切片转移至水中至少10分钟。将切片浸入盛有新鲜配制溶液的塑料容器中，置于95摄氏度条件下。将50毫摩尔柠檬酸盐缓冲液放入微波炉中加热，保持95摄氏度沸腾15分钟。立即将载玻片转移至盛有室温蒸馏水的共平面染色缸中。随后将载玻片转移至装有新鲜配制淬灭溶液的洁净共平面染色缸中。室温孵育30分钟以淬灭内源性过氧化物酶。用1倍PBS在室温下洗涤三次，每次洗涤5分钟。将切片从PBS洗涤液中取出，甩去多余液体，每张切片加入200微升冰上预冷的封闭液，并用石蜡膜覆盖以防止干燥。将切片置于湿盒中，在室温下孵育一小时。移除石蜡条，轻轻振去多余的封闭液，加入50至100微升冰浴的抗KSHV LANA一抗溶液（用封闭缓冲液稀释），覆盖组织。用新的石蜡条重新覆盖组织，置于湿盒中孵育一至两小时。用1倍XPBS清洗载玻片三次，每次5分钟。每次清洗时加入50至100微升用1倍XPBS稀释的生物素化二抗，在室温湿润环境中孵育30至45分钟。在载玻片孵育的同时，配制辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。使用daco动画二联试剂盒，将10 µL溶液A加入含有1 mL 1×PBS的1.5 mL离心管中，涡旋混匀。再加入10 µL溶液B，再次涡旋，于室温孵育30分钟。用1×PBS将载玻片洗涤3次，每次5分钟。同前，向切片中加入 100 至 200 微升辣根过氧化物酶偶联的strippin。在湿盒中室温孵育 30 至 45 分钟。再次用 1 倍 PBS 洗涤切片三次，每次洗涤 5 分钟。在清洗结束前五分钟，将一粒DAB试剂片加入含有20毫升1×PBS和25微升3%过氧化氢的50毫升锥形管中。使用0.45微米注射器滤器过滤DAB溶液，每次处理一张切片。在明场照明的光学显微镜下，用1毫升DAB溶液覆盖组织。当感染细胞中KSHV LANA的显色达到理想程度时，观察显色情况。将切片浸入蒸馏水中，持续五分钟，以终止双重标记反应。随后按照随文所述方法，再次在95摄氏度的柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，并进行染色。采用相同步骤，使用Permount封片剂封固组织，并在明场照明下加盖盖玻片进行成像。通常需要将多个包埋在石蜡块中的独立样本打孔取出，排列成组织微阵列，以便进行进一步的统计分析。细胞蛋白PCAM-1（CD31）阳性的棕色细胞（以灰色箭头指示）在血管周围成簇分布。表达病毒蛋白的红色细胞。黑色箭头标记的Lana细胞表示感染了卡波西肉瘤相关疱疹病毒的细胞。此处为表达细胞蛋白pcam的棕色细胞的低倍放大图像。在血管周围区域，一个 CD31 以灰色箭头标示。红色细胞对病毒蛋白呈阳性。以黑色箭头标示的 Lana 表明感染了卡波西肉瘤相关疱疹病毒的细胞。这是一例卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织活检样本，位于肿瘤组织微阵列上，呈棕色的细胞对病毒蛋白呈阳性。Lana 标记物指示感染了与卡波西肉瘤相关的疱疹病毒的细胞，并显示部分梭形细胞形成。这是另一例卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织活检样本，位于肿瘤组织微阵列上，呈棕色的细胞对病毒蛋白呈阳性。Lana 指出，感染卡波西肉瘤相关疱疹病毒的细胞会高度形成纺锤形细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何在福尔马林固定石蜡包埋组织上进行双标记免疫组织化学染色。在进行该实验时，必须在显微镜下密切观察显色过程，并及时用水终止反应。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

确定失调卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的基因

我们描述了一种用于鉴定宿主信号分子在模式疱疹病毒——γ疱疹病毒68（γHV68）裂解性复制中关键作用的实验方案。通过利用基因修饰小鼠品系和胚胎成纤维细胞进行γHV68的裂解性复制，该方案可同时实现对病毒-宿主相互作用的表型特征分析和分子水平研究。...

解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

本文描述了一种在活细胞中观察单个DNA分子的方法。该技术基于荧光标记的lac阻遏蛋白与已构建到目的DNA上的结合位点之间的结合。此方法可被用于在活细胞中随时间追踪多种重组DNA。...

通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

人类内源性逆转录病毒（HERV）占据了人类基因组的8%，虽然其编码能力极为有限，但却含有约十万个长末端重复序列（LTRs）。为此，研究人员设计了一种定制的Affymetrix微阵列，用于鉴定单个HERV位点的表达情况，并以前列腺癌组织作为概念验证，为未来的临床研究奠定基础。...

基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

我们描述了一种用于检测感染了模型疱疹病毒——小鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV-68）的小鼠体内抗病毒细胞因子产生的实验方案。γHV68），该病毒与人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）密切相关。利用基因修饰的小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们评估了抗病毒细胞因子的产生情况 体内 和...

解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的天然免疫信号传导

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

卡波西肉瘤（KS）是一种由致癌病毒人类疱疹病毒8型/卡波西肉瘤相关疱疹病毒（HHV-8/KSHV）感染引起的肿瘤。此处描述的内皮细胞培养模型特别适用于研究KSHV转化宿主细胞的机制。...

一个 体外 研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的模型

病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位...

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

本方案描述了一种 体外 用于建模的系统 从头合成...

建立与定量 从头合成 游离型卡波西肉瘤相关疱疹病毒对细胞的裂解性感染

学习使用免疫组织化学双重标记技术检测卡波西氏肉瘤肿瘤组织中的病毒蛋白和宿主细胞蛋白，通过抗原修复、一抗孵育和显色反应实现可视化定位，为识别KSHV感染引起的失调宿主基因和开发潜在治疗靶点提供方法学支持。

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