从啮齿动物的神经元和非人类灵长类动物的脑片DiOLISTIC标签

我们展示了基因枪的使用，引入神经元在不同年龄段的啮齿类动物和非人类灵长类动物的大脑切片的荧光染料，如直接投资收益，。在这种特殊情况下，我们使用成年小鼠（3-6个月以上）和成人cynomologus猴子（9-15岁）。这项技术，最初是由实验室博士李奇曼（甘

我叫 Gail Siebel，是美国国家酒精滥用和酒精中毒研究所 Veronica Alvarez 博士实验室的博士后研究员。这项工作是与俄勒冈灵长类动物中心的 Kathleen Grant 博士和 Andrew Wow 博士以及维克森林大学的 James Dene 博士合作进行的，他们提供了本研究中使用的非人灵长类动物组织。该程序的大修目标是将荧光染料引入神经元并标记来自不同物种的大脑切片，例如任何年龄的啮齿动物和灵长类动物。

为了研究树突和树突棘的形态，这是通过首先用亲脂性染料（如 D 眼）包被 T 和珠子来实现的。该程序的第二步是在管道上铺上 D 眼涂层的珠子，并将其切成小块，作为 Helios 基因枪系统的子弹。该程序的第三步是使用基因枪将 D 眼涂层的珠子射入脑切片。

该程序的最后一步是可选的，因为风格可以与免疫染色相结合，以同时定位其他标志物。最终，可以获得结果，显示神经元的稀疏荧光标记，适用于高分辨率成像，例如共聚焦或双光子显微镜，以及树突分支和树突棘形态的研究。与我们现有的方法相比，这种技术的主要优点是文体学可以应用于所有物种、年龄和基因型的动物的大脑切片。

它可以与免疫染色结合使用，并在制造子弹之前产生适合高分辨率显微镜的稀疏荧光标记。在化学通风橱中用亲脂性染料涂覆钨珠，将 450 毫升二氯甲烷涂布到 13.5 毫克亲脂性染料染料眼中，最终浓度为 30 毫克/毫升。取一根含有 300 毫克钨珠的 pre Eloqua 管，加入 300 微升二氯甲烷，用力管道重悬珠子并制成均匀溶液。

每个子弹组仅使用 100 毫克钨珠，上下移液以保持珠子重悬，将 100 毫升珠子和溶解的模具眼添加到载玻片上，并将它们彻底混合在一起。使用移液器吸头，让其完全风干，直到珠子变成浅灰色。使用干净的赛车刀片在滑梯下方放置一张干净的打蜡白纸 对于每种颜色的子弹，将珠子从玻璃上刮下来，滑行并将它们切成细粉。

将涂有涂层的珠子刮到乳清纸上，然后将它们放入 15 毫升锥形管中。加入 3 毫升水，在室温下在水浴中超声处理 10 至 30 分钟，以彻底破坏任何团块。剪下 0.7 米长的蓝绿色管，一端有角度，使用管接头将另一端连接到 12 毫升注射器，将自由端放入含有 10 毫升/毫升 10 毫克聚乙烯基苯乙烯或 PVP 溶液的管中，然后将溶液完全通过管子吸入注射器。

用注射器泵送时涡旋珠子溶液，使混合物均匀，快速工作以避免珠子沉淀，将溶液完全吸入管道中。避免引入任何气泡，这将防止珠子附着在该位置的管子上，同时从两端拉紧管子。将其从一侧倾斜到另一侧以均匀倾斜。

分布珠子。将管路送入制备站，让珠子沉淀 30 到 60 秒。使用注射器缓慢但平稳地注射。

去除水，留下珠子。立即断开注射器并开始旋转管道。将制备站上的氮气流量调整为 4 到 5 LPM，干燥 10 到 20 分钟，直到水滴不再可见。

从准备站拆下管子，用管子切割器将子弹切成 13 毫米长，在好的子弹上，内部会均匀地覆盖一层淡淡的灰色雾霾。将子弹放入含有干燥剂（如无水硫酸钙）的铝箔包裹的闪烁瓶中。将其存放在室温下，直到准备好拍摄。

Diic 标记可用于对不同物种和年龄的脑组织中神经元进行染色，并使用各种方法保存。将切片之前或之后固定的大脑切片放入 24 的孔中。孔板。

将切片放入一个 XPB S3 中洗涤 5 到 10 分钟，每次洗涤 5 到 10 分钟。吸取 PBS，使用画笔将切片置于孔中居中。在基因枪枪管衬管末端的两个金属扩散网之间放置一块 3.0 微米的过滤器。

握住基因枪，使枪管衬管的末端距离样品 1.5 厘米。用 120 至 180 PSI 的氦气压力将珠子射入切片中。用 1 个 XPBS 快速冲洗切片 3 次，以去除多余的染料。

确保在所有液体处理步骤中保持切片的喷射表面朝上。将切片在 PBS 中储存 3 到 6 小时，让 DAI 沿着树突蔓延，并用箔纸覆盖。由于 dai 对光敏感，因此可以在此阶段安装切片，或按照下一节中的详细说明使用抗体进一步染色，以便在 300 至 500 微升含有 0.01%TRITTON X 100 的渗透溶液中对每个切片进行染色，在室温下孵育整整 15 分钟。

从孔中取出渗透液，将切片封闭在含有 10% 山羊血清和 0.01% tritan X 100 的溶液中，在一个 XPBS 中，在室温下孵育 30 分钟。向每个容器中加入 300 至 500 μL 在封闭溶液中稀释的一抗。在室温下孵育 1 至 2 小时或过夜，根据抗体洗涤切片与 1 个 XPBS 一起孵育 3 次，每次洗涤 5 至 15 分钟，从孔中取出溶液。

向每个容器中加入 300 至 500 μL 用封闭溶液稀释的二抗。像以前一样，用一个 XPBS 充分洗涤 4 次，每次洗涤 5 到 15 分钟，将切片贴在带有荧光封固剂的载玻片上，并用 18 x 18 毫米的盖子盖上。盖玻片在室温下干燥 6 到 12 小时，然后用透明指甲油密封边缘，存放在黑暗中或在 4 摄氏度下覆盖。

此处显示了标记的脑切片的示例图像。需要寻找的两个重要特征是低放大倍率下的稀疏标记模式和识别单个细胞成分的能力。子弹制备不正确或组织过度固定会导致标签错误，如图所示。

此处的文本中提供了故障排除提示。有一张 TAL 培养基从小鼠大脑中旋转神经元及其复杂的树突分支模式的共聚焦图像。使用共聚焦显微镜时实现的光学切片允许在组织切片中分离单个标记细胞。

高倍率图像显示了来自啮齿动物大脑和非人灵长类动物大脑的树突节段。请注意，当将 ICS 与免疫染色相结合时，使用该技术实现的高强度荧光染色会产生轮廓分明的树突棘。该图显示了红色 D 眼标记与绿色 GFP 表达的免疫染色共定位的示例。

该图像对应于在 D one 多巴胺受体启动子下表达荧光蛋白 GFP 的转基因小鼠的 sal 切片。看完这个视频，你应该对如何准备子弹和使用晶枪对付荧光染料稀疏敏感的神经元有了很好的了解。该技术可以清晰地可视化神经元形态并研究 dite 分支和棘。