双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

本视频演示了一种利用相干拉曼散射信号对与生物结构相关的两种拉曼共振进行差分成像的方法。首先，将三束同步的短脉冲激光在时间和空间上重叠。然后将重叠后的脉冲导入一台标准的倒置显微镜，从而实现从微小物体产生相干拉曼信号。

利用商业软件将信号转换为图像，以比较所产生的不同拉曼信号。结果表明，双共振与单共振拉曼信号所获得的图像之间的差异可提高对弱拉曼信号的检测灵敏度。大家好，我是来自加州大学戴维斯分校生物光子学中心的Tyler Weeks。

我是来自加州大学戴维斯分校生物光子学中心和内科学系的 Thomas ER。今天我们将展示一种利用双共振相干反斯托克斯拉曼散射来生成细胞化学特异性图像的方法。我们使用该方法来检测那些仅通过相干反斯托克斯拉曼光谱难以直接检测到的分子信号。

那么，让我们开始吧。为了同时生成CARS和受激拉曼信号，需要三个可调谐且同步的短脉冲激光光源，以获得这些同步脉冲。首先使用一个输出功率为10瓦的短脉冲激光器，其波长固定为1064纳米，脉冲宽度固定为7皮秒，重复频率固定为76兆赫兹。

通过使用一系列半波片和偏振分光棱镜，将光束分成三部分。半波片与偏振分光棱镜组合可调节光束中各组分的功率大小，同时不改变其传播方向。通常，将两束光的功率分别调节至约 4.5 瓦，第三束光则包含剩余的 1 瓦功率。

然后将两束高功率光束分别导入两个独立的光学参量振荡器（OPO）。OPO利用不同的频率生成方式，将一个高能光子转换为两个具有不同波长的低能光子。通过调节用于实现该效应的晶体温度，可将所产生的光子波长控制在0.1纳米范围内。

通过将这些信号进行倍频，原本波长固定的1064纳米激光现在可以通过同一束1064纳米光源泵浦两个独立的OPO，从而转化为波长可在780纳米至910纳米范围内调谐的激光束。由此获得两个可独立调谐的激光源，且自动与原始泵浦激光同步。来自1064纳米泵浦激光的第三束光则通过介质镜组合绕过OPO，使得三束光后续可重新合并。

为了高效产生相干的拉曼信号光子，必须在时间和空间上使重组后的脉冲完全重叠，因为光学参量振荡器（OPO）包含环形谐振腔，允许每个激光脉冲多次通过晶体，导致通过OPO传输的光束比原始泵浦光束多传播一段额外距离，从而产生显著延迟。必须通过引入第三束光并增加额外的反射镜，使该光束在使用二向色镜进行重组前传播与其他两束光相同的距离，以补偿这一额外距离，从而实现光路长度的精细调节。每束光均通过可调节延迟装置传输，以便调节不同激光脉冲之间的时间重叠。

在每束光路中加入另一组半波片和偏振分光立方体，以实现对每束激光功率的独立调节。使用二向色镜首先将来自两个OPO的光束合并，然后合并1064纳米的光束，必须注意确保各光束在空间上精确重叠。可通过比较二向色镜附近几厘米处的光束重叠情况与距离二向色镜约一米处的重叠情况进行验证。

由于样品暴露于高平均功率激光束下可能造成损伤，因此将三束组合的激光通过一个作为脉冲选择器的电光调制器，从而调节到达样品的脉冲重复频率，进而调节平均功率。随后，组合后的激光束被耦合至一台倒置显微镜，并通过高数值孔径（NA）的物镜进行聚焦。高NA物镜产生的紧密聚焦能够在微观尺度上最高效地产生相干拉曼信号。

显微镜的物镜安装在压电驱动的X、Y、Z三维样品台上，可通过光束在样品上进行光栅扫描来获取图像，其原理类似于商用的束扫描共聚焦显微镜。现在我们来看如何生成相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和差频拉曼四波混频（D-R-F-W-M）信号：当三束短脉冲激光在样品处相互作用时，会通过两束激光的不同组合产生多种四波混频信号，例如CARS信号，以及通过三束激光共同作用产生的三色CARS和DR CARS信号。当这些信号的波长较为接近时，对其进行分离以供分析可能会非常困难。

因此，信号被导入一台成像光谱仪，该光谱仪同时用作单色仪或带通滤光片，以在空间上分离不同波长的信号。光谱仪内部装有一个电子驱动的翻转镜，当其处于下降位置时，将信号导向背照式深耗尽电荷耦合器件（CCD）相机，从而获取整个信号范围内的光谱信息，并使我们能够识别和优化各种相干拉曼信号，进而选择用于成像的信号。只需使用厂商提供的控制与数据采集软件旋转光谱仪中的光栅，即可将感兴趣峰的中心对准CCD相机。

然后改变翻转镜的位置，将信号重定向至第二个出口端口，该端口连接有单光子计数雪崩光电探测器（DDE）或光电探测器（PD）。对物镜进行光栅扫描，随后利用在APD上记录的信号，通过数据采集软件显示每个像素的光子计数率来生成图像。针对每一个期望的相干拉曼信号重复此成像过程，以便在后期处理中对信号进行比较。

现在让我们了解如何正确制备样品，以获得清晰且可重复的图像。在制备样品时需格外小心。样品通常制备在约150微米厚的玻璃盖玻片上。

这些盖玻片足够薄，可允许使用实验中常用的高数值孔径（NA）水浸或油浸物镜进行高分辨率成像。为了演示典型样本的制备过程，我们制备了固定在显微镜载玻片上的小鼠肌肉组织切片，厚度约为20微米。向样本中加入20微升5摩尔的氘代葡萄糖溶液。

氘代葡萄糖溶液提供了独特且强烈的拉曼背景信号。在样品上方放置玻璃盖玻片，并用指甲油固定，适用于细胞和培养物。也可使用玻璃底培养皿，便于直接成像，无需将细胞从其培养皿中分离。

现在让我们看看如何为 Dr cars 确定合适的拉曼峰。为了充分利用双共振增强效应，必须已知两种拉曼共振物质的拉曼光谱。通常，这些峰分别为与脂质相关的 2,845 cm⁻¹ 和与氘代葡萄糖的 CD 伸缩振动模式相关的 2,121 cm⁻¹。

当两束激光的频率差与分子振动频率相匹配时，即可实现相干拉曼散射。通过将一个OPO调谐至817纳米，与1064纳米激光束结合后，可探测2,845 cm⁻¹的C-H振动模式；而将另一个OPO调谐至868纳米，与1064纳米激光束结合后，则可探测2,121 cm⁻¹的振动模式。在光谱模式下，CAR显微镜可观察到三种感兴趣的相干拉曼信号：一种CAR信号用于探测C-H伸缩振动，另一种CAR信号用于探测C-D伸缩振动，以及一种DR-CAR信号可同时探测这两种振动模式。如图所示，虚线箭头表示来自OPO中激光的光子，实线箭头表示产生的信号。

水平实线表示拉曼振动的能量，直观地展示了在DR汽车中，同时混合相同的三个输入光子可以探测两种不同的拉曼振动。每个峰的信号强度都需要在这些峰位置附近通过微调进行优化。在此，我们选择每个峰，并对海藻酸蠕虫在稀释葡萄糖溶液中的样本成像，基于这三个单独获得的图像提取额外信息需要一些较为简单的图像处理。

首先，图像必须进行归一化处理。一种实用的归一化方法基于脂质具有疏水性这一特性。这意味着在脂质密度较高的区域，葡萄糖的圆二色性共振对双共振信号的贡献应非常小。

相反，在纯葡萄糖溶液区域，脂质的 CH 共振信号也应贡献极小。基于这一点，将 DR car 图像和在氘代葡萄糖溶液 CD 共振上获得的 car 图像归一化至 CL egan 蠕虫体外的一个区域，该区域应无 CH 共振信号。接下来，在 CH 共振的 car 图像中识别蠕虫体内富含脂质的区域，并将其归一化至归一化后的 DR car 图像中对应的区域。

为了使该方法正常工作，假设在此区域深处不存在氘代葡萄糖。这一假设是合理的，因为脂质具有疏水性，不会与溶液混合。现在，通过从归一化的 DR car 图像中减去归一化的 CH 共振 car 图像，仅剩下放大的 CD 共振信号；同样，通过从归一化的 Dr.FWM 图像中减去归一化的 CD 共振 car 图像，也可得到相同结果。

此处仅保留了放大的 CH 共振信号。图中显示的是经过炔基修饰的油酸的拉曼光谱，2,845 cm⁻¹ 处强烈的 CH 共振峰和 2,121 cm⁻¹ 处的炔基共振峰均与指纹区（即峰密集重叠的区域）良好分离，因此非常适合作为相干拉曼成像的理想标记。这是当三束短脉冲激光在样品内重叠时产生的典型相干拉曼信号光谱。箭头所指为各信号对应的能量能级过程，由能级图表示。

这些是使用 DR cars 和 cars 对 C Elgin 的线虫进行成像所获得的典型结果。第一行使用了刚刚展示的三种信号，对处于稀释葡萄糖溶液中的线虫进行成像。第二行的图像经过了适当的归一化处理，第三行则通过将每张 cars 图像从 DR cars 图像中减去，生成了差分成像结果。我们刚刚向您展示了如何基于双共振相干反斯托克斯拉曼显微术（doubly resonant coherent anti-Stokes Raman microscopy）进行拉曼差分成像。

进行此操作时，请记住，确保光束正确重叠并同步非常重要。此外，在切换不同相干信号时，切勿触碰或移动样品，以免影响分析结果。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。