Name: 差分成像生物结构与双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 学习使用三台同步短脉冲激光生成相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）信号的技术。该方法通过差分成像增强弱拉曼信号的检测灵敏度，实现生物结构的化学特异性成像。

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我们感谢 Iwan Schie 和 Sebastian Wachsmann-Hogiu 在开发 DR-CARS 技术方面所做的贡献。Tyler Weeks 感谢劳伦斯利弗莫尔国家实验室的劳伦斯学者计划提供的支持。Thomas Huser 感谢美国心脏协会通过资助项目（Grant-in-Aid）提供的支持。本研究还部分得到了美国国家科学基金会的资助。生物光子学中心是美国国家科学基金会（NSF）科学与技术中心之一，由加利福尼亚大学戴维斯分校根据合作协议编号 PHY 0120999 进行管理。同时感谢美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）资助的加利福尼亚大学戴维斯分校临床转化科学中心（UCD Clinical Translational Science Center）在资助号 UL1 RR024146 下提供的支持。

1. 生成CARS和DR-CARS信号
为了同时产生CARS和DR-CARS信号，需要三个可调谐且同步的短脉冲激光光源。
<ol>
 <li>为了获得三个同步脉冲，我们从一台10 W的激光器（PicoTrain，HighQ Laser, Inc.）开始。该激光器的波长固定为1064 nm，脉冲宽度固定为7 ps，重复频率固定为76 MHz。</li>
 <li>通过一系列半波片和偏振分束立方体，将光束分为三部分。结合使用半波片和偏振分束立方体，可调节每束光的功率，同时不改变其传播方向。通常将两束光分别调节至约4.5 W，第三束光则包含剩余的1 W。</li>
 <li>随后将两个高功率光束分别导入两个独立的光学参量振荡器（OPO，Avante，APE GmbH，柏林，德国）。OPO利用差频产生过程，将一个高能光子转换为两个具有不同波长的低能光子。通过控制实现该效应所用晶体的温度，可将生成光子的波长控制在0.1 nm范围内。通过对这些信号进行倍频，原本波长固定的1064 nm激光可转变为波长在780 nm至910 nm范围内可调的激光束。通过使用同一1064 nm光源泵浦两个独立的OPO，我们获得了两个独立可调的激光源，且它们自动与原始泵浦激光同步。</li>
 <li>来自1064 nm泵浦激光的第三束（最低功率）光束通过二向色镜组合绕过OPO，以便后续将三束光（两束来自OPO，一束来自泵浦激光）重新合并。为了高效产生相干拉曼信号光子，合并后的脉冲必须在时间和空间上完全重叠。由于OPO包含环形谐振腔，使每个激光脉冲多次通过晶体，因此经过OPO的光束传播距离更长，相对于原始泵浦光束产生显著延迟。必须通过第三束光补偿这一距离差异，即引入额外的反射镜，使该光束在通过二向色镜重新合并前，传播距离与其他两束光相同。</li>
 <li>为了精确调节每束光所经路径的长度，我们在每条光路中引入了基于棱镜后向反射器的可调延迟装置。</li>
 <li>在每束光路中额外添加另一组半波片和偏振分束立方体，以便独立调节每束光的功率，而不影响OPO的输入。</li>
 <li>使用二向色镜首先将两个OPO输出的光束合并，再与1064 nm光束合并。必须确保各光束精确重叠（即共线且发散角相似）。可通过比较光束在靠近（几厘米内）和远离（约1 m）二向色镜位置的重叠情况来验证。</li>
 <li>使用脉冲激光的优势在于，每个脉冲在样品处可具有高峰值能量，从而高效产生相干拉曼信号，同时仍保持较低的平均光强。高平均光强可能损伤样品。因此，为了在不牺牲峰值能量的前提下进一步控制平均光强，将合并后的三束光通过一个电光调制器（Pockel's cell，ConOptics），其作为脉冲选择器，可调节到达样品的脉冲重复频率，从而控制平均光强。</li>
 <li>合并后的激光束随后耦合至一台倒置显微镜，并使用高数值孔径（NA）物镜。该物镜通常为60倍水浸物镜，数值孔径（NA）为1.2，且已针对OPO可调范围及1064 nm光束的色差进行了校正。高NA物镜产生的紧密聚焦可在微米尺度上最有效地激发相干拉曼信号。</li>
 <li>为充分填充显微镜物镜的后端口，需对合并后的光束进行扩束。通过充分填充物镜后端口，可在显微系统中实现最佳聚焦条件，从而获得最优空间分辨率。</li>
 <li>显微镜的物镜安装在XYZ压电平台上，通过逐点扫描光束在样品上的位置实现成像，类似于商用光束扫描共聚焦显微镜。</li>
</ol>
2. 三种短脉冲激光的使用
使用三束短脉冲激光会产生多个相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）信号，这些信号来自两两激光组合的多种组合方式，以及三束激光共同作用产生的三色CARS和差频四波混频（DR-FWM）信号。
<ol>
 <li>信号的波长在光谱上可能彼此非常接近。当信号靠得较近时，使用固定波长的带通滤光片和二向色镜难以将其分离以进行分析。因此，我们将信号导入成像光谱仪（SpectraPro 2300i，Acton Research），该仪器还可作为高效的单色仪，将不同波长的信号在空间上分离开来。</li>
 <li>光谱仪内部装有一个电子驱动的翻转镜，当其处于下降位置时，可将信号引导至背照式深耗尽电荷耦合器件（CCD）相机，从而在整个信号范围内获取光谱信息，使我们能够识别并优化各种相干拉曼信号。</li>
 <li>为了选择用于成像的信号，我们只需使用厂商提供的控制与数据采集软件（WinSpec，Princeton Instruments）调节光谱仪内的光栅旋转，使目标峰位对准CCD相机中心，然后改变翻转镜的位置，将该信号重定向至第二个出射端口，该端口连接有一个单光子计数雪崩光电二极管（APD）。</li>
 <li>随后对物镜进行光栅扫描，利用数据采集软件（SymPhoTime，Picoquant GmbH，Berlin，德国）显示每个像素的光子计数率，将APD记录的信号生成图像。</li>
 <li>我们对每个所需的相干拉曼信号重复此成像过程，以便在后期处理中对信号进行比较。</li>
</ol>
3. 样品制备
为了获得清晰且可重复的图像，在制备样品时必须格外注意。
<ol>
 <li>样品通常制备在约150微米厚的玻璃盖玻片上。这种盖玻片足够薄，可使用通常采用的1.2数值孔径（NA）物镜进行高分辨率成像。</li>
 <li>当激光通过微小透明物体发生衍射时，可对介电物体产生光镊效应。使用 tightly focused（高度聚焦）、高峰值功率、短脉冲的激光束可能会拖拽微小细胞或细菌，导致图像模糊或拖影。为避免此现象，可通过旋涂法在玻璃盖玻片表面先涂覆一层聚-L-赖氨酸，以将样品固定在盖玻片表面。</li>
 <li>对于培养细胞，可使用玻璃底培养皿，从而无需将细胞从原细胞培养皿中分离即可直接成像。</li>
 <li>本研究中为演示目的，首先将经甲醛固定的C. elegans线虫置于玻璃盖玻片上。</li>
 <li>然后向线虫加入20 μL的5 M氘代葡萄糖溶液。氘代葡萄糖溶液可提供独特且强烈的拉曼背景信号。</li>
</ol>
4. 样品分析
为了充分利用双共振增强效应，必须已知两种拉曼共振物质的拉曼光谱。
<ol>
 <li>样品在盖玻片上制备完成后，使用共聚焦拉曼显微镜进行分析，以获取相关的自发拉曼光谱并识别合适的特征峰。</li>
 <li>为了进行双共振相干反斯托克斯拉曼散射（DR-CARS）实验，我们确定与脂质相关的CH伸缩振动模式和与氘代葡萄糖相关的CD伸缩振动模式的光谱位置分别为2845 cm-1和2121 cm-1。</li>
 <li>当两束激光的频率差与分子振动频率相匹配时，即可实现相干拉曼散射。通过将一个光学参量振荡器（OPO）调谐至817 nm，与1064 nm激光束组合后可探测2845 cm-1的CH振动模式；将另一个OPO调谐至868 nm，与1064 nm激光束组合后可探测2121 cm-1的特征峰。</li>
 <li>通过在CARS显微镜上对样品进行光栅扫描，我们现在可以观察到三个感兴趣的相干拉曼信号：探测CH伸缩振动的CARS信号、探测CD伸缩振动模式的CARS信号，以及同时探测两者的DR-CARS信号。</li>
 <li>我们按照第2.3节所述方法选择每个峰，并如上所述采集图像。</li>
</ol>
5. 图像处理
基于这三幅图像提取额外信息现在需要一些相对简单的图像处理方法。
<ol>
 <li>首先需要对图像进行归一化处理。理论上，可以通过校正每个信号生成过程中所用激光的强度来实现归一化。但在实际操作中，这种方法并不总是有效，主要原因在于二向色镜、探测器和光栅的光谱响应不均匀。</li>
 <li>一种实用的归一化方法基于以下事实：在纯脂质主导信号的区域，CD共振不应贡献任何信号；同样，在纯葡萄糖溶液区域，CH共振也不应贡献任何信号。基于这一原理，我们将氘代葡萄糖溶液在CD共振处获得的DR-CARS图像和CARS图像归一化至线虫C. elegans体外一个应无CH共振的区域。</li>
 <li>然后，在CH共振CARS图像中识别线虫体内富含脂质的区域，并将其归一化至已归一化的DR-CARS图像中对应区域。为使该方法有效，我们假设在此区域深处不存在氘代葡萄糖，这一假设是合理的，因为脂质具有疏水性，不会与溶液混合。</li>
 <li>现在，通过从归一化的DR-CARS图像中减去归一化的CH共振CARS图像，即可得到仅包含增强的CD共振信号。</li>
 <li>类似地，通过从归一化的DR-FWM图像中减去归一化的CD共振CARS图像，即可得到仅包含增强的CH共振信号。</li>
</ol>
6. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="光激发示意图；包含OPO、泵浦激光器、用于瞬态吸收研究的光谱仪。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1：如上所述的DR-CARS显微成像系统示意图。 
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="线虫C. elegans的显微图像，明场显微镜，生物学研究，生物体分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2：玻璃盖玻片上置于氘代葡萄糖溶液中的秀丽隐杆线虫（C. elegans）的白光图像，已准备就绪用于成像。 
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="瞬态吸收分析中的发射峰光谱图，光谱数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3：含有炔基修饰（碳-碳三键基团）的改性油酸（一种不饱和脂肪酸）的拉曼光谱。 在2845 cm-1处的强CH共振峰和在2100 cm-1处的炔基共振峰均与指纹区（峰密集区域）良好分离，使其成为相干拉曼成像的理想标记物。
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="共振光谱示意图；CH/CD共振CARS/DR-CARS峰S1-S3；光谱分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4：当三束短脉冲激光在样品内重叠时产生的相干拉曼信号的典型光谱。 箭头指向由能级图表示的每种信号对应的过程。在本图中，虚线箭头表示来自激光器和光参量振荡器（OPO）的光子，实线箭头表示产生的信号。实心水平线表示拉曼振动的能量，直观地说明在DR-CARS中，同时混合相同的三个输入光子可探测两种不同的拉曼振动。
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="CARS光谱成像分析；原始图像、归一化图像和差值图像；CH、CD共振信号。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
 图5：利用DR-CARS和CARS对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行成像的典型结果。 第一行使用图4所示的三种信号对浸于氘代葡萄糖溶液中的线虫进行成像。第二行为经过适当归一化处理的图像，第三行为将每幅CARS图像从DR-CARS图像中相减后得到的差值图像。

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

声明无利益冲突。

拉曼光谱和基于拉曼的成像技术是生物科学中强大的新兴工具。目前，这些技术尤其适用于在脂质的加工与储存过程中，对细胞代谢及代谢紊乱进行活体（in vivo）和体外（in vitro）研究。大多数生物大分子含有大量相似的、主要是碳基的分子键，因此从细胞和生物体获得的拉曼光谱通常是来自脂质、蛋白质、核酸、糖类等成分贡献的叠加。由于脂质倾向于形成致密的液滴或双分子层，并且含有大量脂肪族CH键的长链结构，因此相对容易从这些复杂的光谱中分离出来。然而，在复杂的细胞环境中，我们对特定蛋白质、氨基酸、RNA或DNA的识别能力却非常有限，特别是当这些目标分子的浓度仅为微摩尔（μM）甚至更低时。在此背景下，利用我们新引入的差分受激拉曼散射（DR-CARS）成像技术探测微弱拉曼共振信号的能力，为这些分子的化学微分析与成像提供了潜在的强大手段。诚然，该实验方案中最复杂的部分在于激光系统的准直与同步。从零开始时，脉冲的同步——即确保脉冲尽管经过不同光路仍能在时间上重叠——可通过使用脉冲自相关仪来简化。一旦实现空间和时间上的重叠，CARS和DR-CARS信号应可被轻易检测到。然而，初次准直通常较为粗糙，导致信号较弱。最佳的系统准直实践是首先产生微弱信号，然后通过轻微调节各光路中的反射镜以及使用延迟装置优化时间重叠，逐步增强信号强度。尽管光谱仪/单色仪能有效屏蔽环境光，但要获得最干净的结果，仍建议在关闭室内照明的条件下操作，并使用窗帘或镜头遮光管，以最大限度减少来自其他光源（如计算机显示器、指示灯、LED等）的背景干扰。 我们特定的实验装置采用单光子计数雪崩光电二极管（APD）探测器和时间相关单光子计数（TCSPC）硬件进行检测5。这使我们能够以相对较低的噪声检测到极微弱的信号，但许多研究团队在进行类似测量时发现，使用增益可调的光电倍增管（PMT）更具优势。PMT 的优势在于其增益可调，并且具有更大的探测面积，这可以简化探测器的光路对准。此外，我们的装置利用压电位移台移动物镜，以实现光束扫描。这种方法的优势在于，我们能够以很高的精度返回此前扫描图像中的任意位置，并进行额外测量，包括自发拉曼光谱。其他研究团队已成功采用扫描镜组件，甚至完整的共聚焦扫描系统（如 Olympus FluoView 系统），后者可实现更快的成像速度，但在精确返回图像中任意位置方面能力有限。 将激光器调节至与拉曼共振匹配也是关键步骤，可能需要进行一些优化。尽管拉曼峰的位置可能已知，但由差频拉曼相干反斯托克斯拉曼散射（DR-CARS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）获得的最大光谱峰强度并不一定对应于自发拉曼峰的峰值位置。这是由于四波混频产生的信号存在固有的干涉，导致出现非共振背景信号与CARS信号叠加，从而使CARS光谱相对于自发拉曼光谱发生畸变。CARS信号峰的光谱位置可以计算得出，但更实用的方法是在预期拉曼共振位置附近，以多个较小的光谱步长调节光学参量振荡器（OPO）。该过程应能获得一个明显的信号最大值。事实上，为了从差频四波混频（DR-FWM）中获得最高的灵敏度，必须将两个共振均调节至该最大值处。 还有一点关于DR-CARS方法的潜在问题需要讨论，即DR-CARS信号依赖于拉曼活性放大分子的均匀分布。对于大多数生物样品而言，这种放大分子可能是水中广泛存在且几乎无处不在的宽OH共振峰。然而，水会被细胞内的疏水区域（如脂滴）排除在外，因此若利用水的共振峰来放大脂质振动模式，会导致所获得信号的失真。在我们的示例中，我们使用了氘代葡萄糖溶液，以在生物样品中产生一个易于检测且信号强烈的响应。类似地，也可以使用重水（氘代水）或氘代生物缓冲液（如d-HEPES）。在本例中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内的脂滴足够小，始终能保证在系统聚焦激光光斑范围内同时包含氘代葡萄糖溶液和脂质成分。然而，这种情况并不具有普遍性。一个典型的反例是脂肪细胞，其细胞质内会形成较大的脂滴。这意味着，任何采用DR-CARS技术开展的实验都需要进行仔细的样品制备和对照实验，以验证结果的可靠性。

<table><tbody><tr><td>60倍水浸物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>普克尔斯盒</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>皮秒泵浦激光器</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>光学参量振荡器</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1.5号玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>半波片</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>偏振分光棱镜立方体</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 或 PBS053</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪/单色仪</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>雪崩光电二极管</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>XYZ压电载物台</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>此为XY载物台与Z轴物镜 holder 的组合</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>这些特定的二向色镜并非关键，任何具备合适透射/反射特性的组合均可满足要求。</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>用于合并不同的近红外激光束</td></tr><tr><td>时间相关单光子计数（TCSPC）板卡</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Symphotime成像软件</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（cars）对生物结构的差异成像

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

过去十年中，由于相干拉曼成像技术有望实现具有高分子特异性的无标记光学成像，该领域的研究活动显著增加1。然而，这些技术的灵敏度比荧光低数个数量级，通常需要毫摩尔级别的分子浓度才能检测1,2。本文介绍一种可通过利用强信号或高丰度拉曼散射分子的信号来放大弱信号或低浓度拉曼活性分子信号的技术。短脉冲激光与生物样品相互作用时，会产生多种相干拉曼散射信号，每种信号均携带有关样品的独特化学信息。通常仅使用其中一种信号（例如相干反斯托克斯拉曼散射，CARS）生成图像，而其余信号则被舍弃。然而，当收集并比较其他信号（包括三色CARS和四波混频，FWM）与CARS信号时，便可提取原本难以检测的信息3。例如，双共振CARS（DR-CARS）是由两个共振信号之间的相长干涉所产生的结果4。我们展示了如何调节产生DR-CARS信号所需的三束激光，使其分别对应脂质中2845 cm-1的CH伸缩振动和氘代分子（如氘代糖类、脂肪酸等）中2120 cm-1的CD伸缩振动，从而同时探测这两个拉曼共振。在此条件下，除了来自每个共振的CARS信号外，还会生成一个同时探测两者的组合型DR-CARS信号。我们进一步说明，通过检测DR-CARS信号与来自高丰度分子振动的放大信号之间的差值，可增强对弱信号的探测灵敏度。我们还证明，该方法甚至可扩展至两种信号分别来自不同分子的应用场景，例如利用溶剂的强拉曼信号来增强稀溶液中溶质的弱拉曼信号。

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

相干拉曼成像技术在过去十年中发展迅速，因其有望实现无标记光学成像而备受关注。

本视频演示了一种利用相干拉曼散射信号对与生物结构相关的两种拉曼共振进行差分成像的方法。首先，将三束同步的短脉冲激光在时间和空间上重叠。然后将重叠后的脉冲导入一台标准的倒置显微镜，从而实现从微小物体产生相干拉曼信号。使用商业软件将信号转换为图像，以比较产生的不同拉曼信号。结果表明，双共振与单共振拉曼信号所获得的图像之间的差异可提高对弱拉曼信号的检测灵敏度。大家好，我是来自加州大学戴维斯分校生物光子学中心的Tyler Weeks。我是来自加州大学戴维斯分校生物光子学中心和内科学系的 Thomas ER。今天我们将向您展示一种利用双共振相干反斯托克斯拉曼散射来生成细胞化学特异性图像的实验方法。我们采用该方法来检测那些仅靠相干反斯托克斯拉曼光谱难以直接探测到的微弱分子信号。那么，让我们开始。为了同时生成CARS和DR-CARS信号，需要三个可调谐且同步的短脉冲激光光源来获得这些同步脉冲。首先使用一台输出功率为10瓦、固定波长为1064纳米、固定脉冲宽度为7皮秒、重复频率为76兆赫的短脉冲激光器。通过使用一系列半波片和偏振分束立方体，将光束分成三部分。半波片与偏振分束立方体结合，可在不改变光束方向的情况下调节光束中各组分的功率。通常，将两束光的功率分别调节至约 4.5 瓦，第三束光则包含剩余的 1 瓦功率。然后将两束高功率光束分别导入两个独立的光学参量振荡器（OPO）。OPO利用不同的频率生成方式，将一个高能光子转换为两个具有不同波长的低能光子。通过控制用于实现该效应的晶体温度，可将所产生的光子波长控制在0.1纳米范围内。通过将这些信号进行倍频，原本波长固定的1064纳米激光器现在可以通过使用同一1064纳米光源泵浦两个独立的OPO，产生波长在780纳米至910纳米范围内可调的激光束。由此获得两个可独立调谐的激光源，且自动与原始泵浦激光器同步。来自1064纳米泵浦激光器的第三束光则通过介质镜组合绕过OPO，使得这三束光之后能够重新合并。为了高效产生相干的拉曼信号光子，必须在时间和空间上精确重叠复合后的脉冲，因为光学参量振荡器（OPO）包含环形谐振腔，使每个激光脉冲多次通过晶体，导致通过OPO传输的光束比原始泵浦光束多传播一段额外距离，从而产生显著延迟。该距离需通过引入第三束光进行补偿，即增加额外的反射镜，迫使该光束在通过二向色镜复合之前，传播与其他两束光相同的距离，以实现光路长度的精细调节。每束光均通过可调延迟装置传输，从而实现对不同激光脉冲时间重叠的调节。在每束光路中加入另一组半波片和偏振分光立方体，以独立调节每束激光的功率。使用二向色镜首先将来自两个光参量振荡器（OPO）的光束合并，然后再引入1064纳米的光束，必须注意确保各光束在空间上精确重叠。可通过比较二向色镜附近几厘米处的光束重叠情况与距离二向色镜约一米处的重叠情况来验证重叠精度。由于高平均功率激光束的照射可能损坏样品，因此将三束组合激光通过一个作为脉冲选择器的电光调制器，从而调节到达样品的脉冲重复频率，进而控制平均功率。随后，将组合后的激光束耦合至配备高数值孔径（NA）物镜的倒置显微镜中。高NA物镜产生的紧密聚焦可在微观尺度上最有效地产生相干拉曼信号。显微镜的物镜安装在X、Y、Z压电平台上，该平台可通过光束在样品上进行光栅扫描来获取图像，类似于商用光束扫描共聚焦显微镜。现在我们来看看如何生成CARS和D-R-F-W-M信号：当三束短脉冲激光在样品处相互作用时，会通过两束激光的各种组合产生多种四波混频信号，例如CARS信号，以及三束激光共同作用下产生的三色CARS和DR CARS信号。当这些信号的波长较为接近时，可能难以将其分离以便分析。因此，信号被送入一台成像光谱仪，该光谱仪同时用作单色仪或带通滤波器，以在空间上分离不同波长的信号。光谱仪内部装有一个由电子控制的翻转镜，当其处于下降位置时，可将信号引导至背照式深耗尽电荷耦合器件（CCD）相机，从而获取整个信号范围内的光谱信息，并使我们能够识别和优化各种相干拉曼信号，进而选择用于成像的信号。只需使用厂商提供的控制与数据采集软件调节光谱仪内的光栅旋转，即可将感兴趣峰的峰值对准CCD相机中心。然后改变翻转镜的位置，将信号重定向至第二个出口端口，该端口连接单光子计数雪崩光电探测器（DDE）或光电探测器（PD）。对物镜进行光栅扫描，随后利用在APD上记录的信号，通过数据采集软件显示每个像素的光子计数率来生成图像。针对每个所需的相干拉曼信号重复此成像过程，以便在后期处理中对信号进行比较。现在让我们了解如何正确制备样品，以获得清晰且可重复的图像。在制备样品时需格外小心。样品通常制备在约150微米厚的玻璃盖玻片上。这些盖玻片足够薄，可允许使用实验中常用的高数值孔径（NA）水浸或油浸物镜进行高分辨率成像。为了演示典型样品的制备过程，我们制备了固定在显微镜载玻片上的小鼠肌肉组织切片，厚度约为20微米。向样品中加入20微升5摩尔的氘代葡萄糖溶液。氘代葡萄糖溶液提供了一种独特且强烈的拉曼背景信号。在样品上方放置玻璃盖玻片，并用指甲油固定，适用于细胞和培养物。也可使用玻璃底培养皿，从而无需将细胞从其培养皿中分离即可进行成像。现在让我们了解如何确定 Dr cars 的合适拉曼峰。为了充分利用双共振增强效应，必须已知两种拉曼共振物质的拉曼光谱。通常，这两种峰分别为与脂质相关的 2,845 cm⁻¹ 和与氘代葡萄糖相关的 CD 伸缩振动模式的 2,121 cm⁻¹。当两束激光的频率差与分子振动频率相匹配时，即可实现相干拉曼散射。通过将一个OPO调谐至817纳米，与1064纳米激光束结合后，可探测2,845 cm⁻¹的C-H振动模式；将另一个OPO调谐至868纳米，与1064纳米激光束结合后，可探测2,121 cm⁻¹的振动模式。在光谱模式下，CAR显微镜可观察到三种感兴趣的相干拉曼信号：一种CAR信号用于探测C-H伸缩振动，另一种CAR信号用于探测C-D伸缩振动，以及一种DR-CAR信号可同时探测这两种振动模式。如图所示，虚线箭头表示来自OPO中激光的光子，实线箭头表示产生的信号。水平实线表示拉曼振动的能量，直观地展示了在双共振（DR）汽车中，同时混合相同的三个输入光子可以探测两种不同的拉曼振动。每个峰的信号强度都需要在这些峰位附近通过微调来优化。在此，我们选择每个峰，并对海藻酸蠕虫在稀释葡萄糖溶液中的样本成像，基于这三个单独获取的图像提取额外信息需要一些较为简单的图像处理。首先，图像必须进行归一化处理。一种实用的归一化方法基于脂质具有疏水性这一特性。这意味着在脂质密度较高的区域，葡萄糖的圆二色性（CD）共振信号对双共振信号的贡献应非常小。相反，在纯葡萄糖溶液区域，脂质的 CH 共振信号也应贡献极小。基于这一点，将 DR car 图像和在氘代葡萄糖溶液 CD 共振上获得的 car 图像归一化至 CL egan 蠕虫体外的一个区域，该区域应无 CH 共振信号。接下来，在 CH 共振 car 图像中识别蠕虫体内富含脂质的区域，并将其归一化至归一化后的 DR car 图像中对应的区域。为了使该方法正常工作，假设在此区域深处不存在氘代葡萄糖。这一假设是合理的，因为脂质具有疏水性，不会与溶液混合。现在，通过从归一化的DR羧基图像中减去归一化的CH共振羧基图像，仅剩下放大的CD共振信号；同样，通过从归一化的Dr.FWM图像中减去归一化的CD共振羧基图像，也可得到相同结果。此处仅保留了放大的 CH 共振信号。图中显示的是经过炔基修饰的油酸的拉曼光谱，2,845 cm⁻¹ 处强烈的 CH 共振峰以及 2,121 cm⁻¹ 处的炔基共振峰均与指纹区（即峰密集重叠的区域）良好分离，因此非常适合作为相干拉曼成像的理想标记。这是当三束短脉冲激光在样品内重叠时产生的相干拉曼信号的典型光谱。箭头所指为各信号对应的过程，以能级图表示。这些是使用 DR cars 和 cars 对 C Elgin 的线虫进行成像所获得的典型结果。第一行使用了刚刚展示的三种信号，对处于低浓度葡萄糖溶液中的线虫进行成像。第二行图像经过了适当的归一化处理，第三行图像则是通过将每张 car 的图像从 DR car 的图像中减去而得到的差分图像。我们刚刚向您展示了如何基于双共振相干反斯托克斯拉曼显微技术进行拉曼差分成像。进行此操作时，请记住，确保光束正确重叠并同步非常重要。此外，在切换不同相干信号时，务必避免触碰或移动样品，因为这会影响分析结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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差分成像生物结构与双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）

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