Name: 弓形虫囊肿壁形成激活骨髓衍生的巨噬细胞和Bradyzoite条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习在体外诱导和可视化Toxoplasma gondii囊肿壁形成的方法，利用骨髓来源的巨噬细胞和成纤维细胞。该技术通过pH应激或巨噬细胞激活触发寄生虫应激反应，结合荧光凝集素标记和免疫荧光显微镜观察，为研究宿主-寄生虫相互作用和弓形虫生物学提供可靠的实验手段。

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本研究由威斯康星大学麦迪逊分校Herman I. Shapiro杰出研究生奖学金（C.M.T.）、美国国立卫生研究院资助项目AI072817（A.M.P.）以及美国心脏协会资助项目0840059N（L.J.K）提供支持。

1. 人包皮成纤维细胞（HFF）包被盖玻片的制备
<ol>
<li>	将无菌圆形玻璃盖玻片放置于24孔细胞培养板各孔底部。</li>
<li>	从融合的150 cm2 培养瓶中收集人包皮成纤维细胞（HFFs）时，用1× PBS冲洗培养瓶两次，加入2.5 ml 0.025%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育5–10分钟。</li>
<li>	轻轻敲击培养瓶侧面，使其贴壁细胞脱落。待细胞完全脱落之后，加入150 ml HFF培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基），并用该培养基冲洗培养瓶以收集细胞悬液。</li>
<li>	将1 ml细胞悬液分别加入含盖玻片的各孔中。</li>
<li>	将细胞置于37°C、5% CO2 条件下培养至完全融合。</li>
</ol>
2. 准备用于 BMC 发育的 L929 条件培养基（CM）
<ol>
<li>	L929 是一种小鼠非整倍体纤维肉瘤细胞系，在达到完全汇合后长期培养可分泌巨噬细胞集落刺激因子。这种分泌特性使得 L929 细胞的条件培养基（CM）可用于在细胞培养中诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞1。</li>
<li>	待 L929 细胞达到汇合后，继续培养 7–9 天，直至细胞呈圆形并开始从培养瓶表面脱落。收集上清液，并在 425 × g 离心 10 分钟以沉淀脱落的细胞。此上清液即为条件培养基（CM）。</li>
<li>	一个 150 cm2 培养瓶的 L929 细胞可产生 30 ml 条件培养基（CM），用于制备 150 ml 骨髓细胞（BMC）培养基。BMC 培养基由 DMEM 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、20% 条件培养基（CM）、1% 青霉素-链霉素和 1% L-谷氨酰胺组成。</li>
</ol>
3. 骨髓分离与骨髓细胞的细胞培养
<ol>
<li>	通过 CO 处死一只 C57BL/6 小鼠2 窒息后用70%乙醇表面消毒。</li>
<li>	通过提起靠近腿部的腹部皮肤并用剪刀剪开，暴露腹膜。注意避免刺破腹膜腔。沿腿部向下剪开，暴露胫骨和股骨。用剪刀剪除腿部骨骼上的肌肉组织。</li>
<li>	为取下股骨，在膝关节下方和髋关节附近各切割一次。将骨骼置于含有冷的1×PBS的细菌培养用培养皿中。这些步骤中切勿使用组织培养处理过的培养皿，因为骨髓细胞（BMCs）会永久黏附。使用解剖刀刮除多余的肌肉组织。在膝关节上方稍作切割以暴露骨髓。 </li>
<li>	重复步骤 (b) 和 (c)，以采集第二根股骨中的骨髓。</li>
<li>	使用装有冷的1×PBS的10 ml注射器和25号针头，将骨髓冲入50 ml锥形管中。骨髓完全移除后，骨骼应呈现纯白色。 </li>
<li>	将PBS/骨髓混合液通过22号针头，以分散任何骨髓团块。 </li>
<li>	以 425 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
<li>	将沉淀重悬于8 ml BMC培养基中。取1 ml细胞悬液与9 ml BMC培养基加入8个细菌学培养皿中。</li>
<li>	孵育于 37°C，5% CO₂2.</li>
<li>	第5天，向每块培养板中加入10 ml BMC培养基。至第7天，细胞将完全发育。成熟后的BMC可传代培养1-2周。</li>
<li>	为分离BMCs，移除培养基并向每个培养皿中加入5 ml预冷的1X PBS。孵育于 4°C 孵育30分钟，直至细胞开始脱落。用无菌移液管将骨髓细胞从培养板上冲洗下来。 </li>
<li>	将BMCs收集至50 ml锥形管中，425 × g离心10分钟以形成沉淀。 </li>
<li>	将沉淀重悬于10 ml BMC培养基中，用血细胞计数板计数。在底部放置圆形玻璃盖玻片的24孔板中，每孔接种2×10⁵个BMC细胞。于感染前让BMC细胞贴壁过夜。 T. gondii 多余的BMC可重新接种于培养皿中以备后续使用。</li>
</ol>
4. 用T. gondii感染细胞
<ol>
<li>	用 2×106 个 T. gondii 感染一个 25 cm2 的融合 HFF 培养瓶，并培养至细胞开始裂解（约 2–3 天）。</li>
<li>	使用细胞刮刀从组织培养瓶中刮下被感染的宿主细胞单层，然后将脱落的单层细胞通过 27 号针头反复推注，以释放宿主细胞内的寄生虫。</li>
<li>	使用血细胞计数板确定培养基中寄生虫的数量。</li>
<li>	每孔接种 105 个寄生虫，感染来自方案 1 的 HFF 单层细胞（带盖玻片）或来自方案 3 的 BMCs。在 37°C、5% CO2 条件下孵育 3 小时，使寄生虫侵入细胞。</li>
</ol>
5. 通过环境胁迫诱导T. gondii 慢殖子发育
<ol>
<li>	在HFF细胞中通过提高培养基pH值并剥夺CO2诱导缓殖子发育
<ol class="lalpha">
<li> 准备发育培养基。发育培养基包含无碳酸氢盐的RPMI 1640培养基、1% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和42 mM HEPES。调节pH至8.0，并过滤除菌。</li>
<li> 移除感染的HFF细胞中的DMEM培养基，用1× PBS洗涤一次，然后加入1 ml发育培养基。</li>
<li> 在37°C、常压空气条件下孵育3天。</li>
</ol></li>
<li>	骨髓来源巨噬细胞（BMCs）的激活
<ol class="lalpha">
<li> 准备用于激活BMCs的培养基。激活培养基为BMC培养基中添加100 U/ml IFN-γ和100 ng/ml LPS。使用前将LPS在水浴中超声处理2分钟，以破坏其聚集体。</li>
<li> 移除孔板中的BMC培养基，更换为1 ml激活培养基。</li>
<li> 在37°C、5% CO2条件下孵育3天。</li></ol></li>
</ol>
6. 免疫荧光检测
<ol>
<li> 用 1X PBS 将感染的孔洗涤三次。</li>
<li> 加入 200 μl 3% 多聚甲醛固定单层细胞，作用 20 分钟。</li>
<li> 移除固定液，并用 1X PBS 洗涤孔。</li>
<li> 向孔中加入 200 μl 0.1 M 甘氨酸，静置 5 分钟。</li>
<li> 移除甘氨酸溶液，并用 1X PBS 洗涤孔。</li>
<li> 加入 250 μl 含 3% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 溶液，以透化并封闭单层细胞，作用 30 分钟。</li>
<li> 移除封闭液，并用 1X PBS 洗涤孔。</li>
<li> 加入 50 μl 刀豆素 Dolichos biflorus 凝集素（以含 3% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 溶液按 1:250 稀释）。</li>
<li> 盖好培养板，置于平台摇床上，室温孵育 1 小时。</li>
<li> 在平台摇床上用含 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。</li>
<li> 使用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 VectaShield 封片剂封片。</li>
<li> 使用荧光显微镜，在罗丹明滤光片下以 100 倍放大倍数观察染色的 T. gondii。</li>
</ol>
7. 代表性结果
图1显示了在pH应激条件下，T. gondii在活化的BMM和HFF中典型的DBA染色结果。两者均在含寄生虫空泡周围显示出DBA染色，表明存在包囊壁成分。活化BMM的图像显示DBA染色与空泡表面一致。在pH应激的HFF中，T. gondii的横切面显示包囊壁被染色，而内部结构未见染色。
<img src="/files/ftp_upload/2091/2091fig1.jpg" alt="相差干涉与DBA荧光显微镜对比HFFs与BMMs。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 应激条件下T. gondii的DBA染色。 处于应激条件下的胞内寄生虫，包括活化的BMMs或pH应激的HFFs，使用罗丹明标记的DBA（红色）进行染色。微分干涉相差（DIC）图像显示了包囊的轮廓，黑色标尺代表2 μM。

动物实验
动物实验按照威斯康星大学动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。

<ol><li>Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+factor+inducing+differentiation+of+mouse+myeloid+leukemic+M1+cells+from+conditioned+medium+of+mouse+fibroblast+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells.</a> J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).</li>
<li>Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+differentiation+mutants+in+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>J, P., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Toxoplasma+gondii+development+mutants+identifies+a+potential+proteophosphogylcan+that+enhances+cyst+wall+formation.+Molecular+and+Biochemical+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology.</a> 169 (2), 120-123 (2010).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Bradyzoite-Specific+Toxoplasma+gondii+Antigens+in+Gamma+Interferon-Treated+Mouse+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages.</a> Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).</li>
<li>Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Cyclophilin+18-Mediated+Production+of+Nitric+Oxide+Induces+Bradyzoite+Conversion+in+a+CCR5-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).</li>
<li>Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+tachyzoite-bradyzoite+interconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion.</a> Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).</li>
<li>Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors+2%2C+3%2C+and+4%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).</li>
<li>Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patatin-like+protein+protects+Toxoplasma+gondii+from+degradation+in+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages.</a> Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+of+Toxoplasma+gondii+is+necessary+for+induction+of+bradyzoite-specific+antigens%3A+a+possible+role+for+nitric+oxide+in+triggering+stage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion.</a> Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管缓殖子发育的机制尚未完全阐明，但对T. gondii在组织培养中阶段转化的分子遗传学分析已促使人们发现了参与缓殖子包囊形成的基因2,3,4。这些分析还发现，在其他长期应激条件下，部分缓殖子标志物也会表达，例如在活化的巨噬细胞中生长时5,6。上述方法描述了如何在骨髓来源的巨噬细胞（BMCs）和人包皮成纤维细胞（HFFs）中培养T. gondii，并诱导产生DBA阳性的包囊壁结构。这些结果表明，不同的应激刺激均可诱导包囊发育通路的激活。
由于T. gondii几乎可以在所有温血宿主的有核细胞中生长，因此多种细胞类型均可用于体外培养T. gondii。本实验方案选用HFFs，因为它们是一种具有接触抑制特性的细胞系。由于细胞培养条件下缓殖子的发育需要三天时间，使用不会过度生长的细胞系更为方便。HFFs是原代细胞，无法无限传代。HFFs在组织培养中传代次数越多，对高pH培养基的耐受性越低，因而越不适合用于诱导缓殖子转化。为获得最佳效果，宿主细胞应选用低代次细胞，并在达到汇...

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>罗丹明标记的&lt;em&gt;Dolichos biflorus&lt;/em&gt; 凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（16%）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;#947;</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-05</td><td>分装保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>分装保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基粉末（含 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢盐）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VectaShield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

toxoplasma gondii 在活化骨髓来源巨噬细胞及缓殖子条件下包囊壁的形成

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii 是一种专性胞内寄生虫，能够侵入任何温血动物的有核细胞。在感染过程中，T. gondii 以快速增殖的形式——速殖子——进行播散。速殖子通过一种尚未充分阐明的信号通路转化为缓慢生长的包囊形式，即缓殖子。在动物体内，缓殖子包囊主要存在于中枢神经系统和肌肉组织中，代表感染的慢性阶段。在体外培养中，可通过 CO2 饥饿、使用高 pH 培养基或添加干扰素 γ（IFNγ）来模拟向缓殖子的转化。缓殖子的特征之一是具有包囊壁，该结构可与植物凝集素 Dolichos biflorus 凝集素（DBA）结合。荧光标记的 DBA 可用于观察在人包皮成纤维细胞（HFFs）中生长的寄生虫的包囊壁，这些细胞被置于低 CO2 和高 pH 培养基中。同样，在经 IFNγ 和脂多糖（LPS）激活的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中寄生的虫体，其包囊壁也可通过 DBA 检测到。本实验方案将演示如何通过使用低 CO2 和高 pH 培养基诱导 T. gondii 转化为缓殖子，并通过激活 BMMs 促进该过程。宿主细胞将被培养在盖玻片上，接种速殖子后，分别加入 IFNγ 和 LPS（BMMs）或置于高 pH 培养基（HFFs）中培养三天。感染完成后，宿主细胞将被固定、通透化并封闭。利用罗丹明标记的 DBA 通过荧光显微镜观察包囊壁。

弓形虫（Toxoplasma gondii）在应对环境应激时会转化为包囊形式，该过程可在组织培养模型中模拟。本视频展示了通过激活骨髓来源的巨噬细胞或改变成纤维细胞培养基的pH值来诱导包囊壁形成的实验技术。

Toxoplasma gondii 在活化骨髓来源巨噬细胞及缓殖子条件下包囊壁的形成

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生虫，能够侵入任何温血动物的有核细胞。在感染过程中，T. gondii……

本实验的总体目标是在体外诱导并观察弓形虫（Toxoplasma gondii）包囊壁的形成。首先通过培养巨噬细胞和成纤维细胞来实现这一目标。然后，通过用寄生虫感染这些宿主细胞，并对成纤维细胞施加pH冲击或激活巨噬细胞，可在体外诱导速殖子向包囊的转化，从而形成包囊壁。最后，向培养物中加入荧光标记的凝集素，该凝集素可结合包囊壁，使得包囊可通过免疫荧光显微镜进行观察。大家好，我是Crystal Tobin，来自威斯康星大学麦迪逊分校医学微生物学与免疫学系Laura Noel博士的实验室。我是 Angela Pollard，也来自 No 实验室。今天我们将向您展示一种在体外进行弓形虫囊壁形成的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究寄生虫对胁迫条件的反应。那么，让我们开始。首先，在24孔组织培养板的每个孔底部放置一片无菌圆形玻璃盖玻片，然后在高pH和二氧化碳饥饿条件下，诱导弓形虫刚地株在人包皮成纤维细胞中转化为缓殖子。实验起始使用一个汇合度达到100%的150平方厘米人包皮成纤维细胞培养瓶，在组织培养罩内进行操作。用一倍体积的XPBS将汇合的人包皮成纤维细胞培养瓶冲洗两次，然后加入2.5毫升0.025%胰蛋白酶EDTA。将培养瓶置于37°C孵育5至10分钟。孵育5至10分钟后，轻轻敲击培养瓶数次，使细胞从塑料表面脱落。接下来，加入150毫升HFF培养基或添加补充剂的Delcos改良Eagle培养基，并用该培养基冲洗培养瓶以收集细胞。将1毫升细胞悬液分别加入含有盖玻片的24孔板的每个孔中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，使细胞达到汇合状态。随后，细胞即可用于感染弓形虫Gandhi株。在组织培养罩内，用2×10⁶个寄生虫感染一个25平方厘米的汇合人包皮成纤维细胞培养瓶，并在37°C下孵育，直至细胞开始脱落。约两到三天后，使用细胞刮刀将感染的包皮成纤维细胞单层从组织培养瓶中刮下。然后通过27号针头将脱落的单层细胞反复吹打，使寄生虫从宿主细胞中释放出来。使用血细胞计数板测定培养基中寄生虫的数量，随后将10的5次方个寄生虫接种至每孔已长满的人包皮成纤维细胞的24孔板中，细胞此前已预先准备好。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3小时，以允许寄生虫侵入宿主细胞。随后诱导寄生虫转化为缓殖子阶段。移除感染的人包皮成纤维细胞中的DMEM培养基。用一份XPBS冲洗，然后加入一毫升培养基。该培养基为不含碳酸氢盐、pH值调至8的RPMI培养基。将细胞在37摄氏度、常压空气条件下培养三天。细胞现已准备好用于检测布氏子孢子（Brady zos）的存在。通过使用荧光标记的凝集素docos（DBA，荧光麦芽蛋白）来确定布氏子孢子的存在，该凝集素可结合弓形虫（Toxoplasma Gandhi is）的辅助壁，从而为感染细胞的荧光成像做准备。用1倍PBS缓冲液将孔板洗涤三次。接下来，加入 200 微升 3% 多聚甲醛固定细胞单层，固定 20 分钟。移除固定液，用 1 倍磷酸盐缓冲液（XPBS）清洗孔板。向孔板中加入 200 微升 0.1 摩尔甘氨酸溶液，静置 5 分钟。去除甘氨酸，并用一份 XPBS 洗涤孔板，以封闭并透化细胞。加入 250 微升封闭液。将细胞孵育 30 分钟。除去封闭液，用一倍浓度的磷酸盐缓冲液（XPBS）冲洗各孔。向各孔中加入50微升以1:250比例稀释的DBA（与雨明素偶联的凝集素）。盖上培养板，在平台摇床上室温震荡孵育一小时。孵育结束后，用含0.2% Triton X-100的1×PBS在摇床上洗涤盖玻片三次，每次五分钟，以去除荧光标记的DBA，最后使用含dpi的β封固剂封片。可采用荧光显微镜，配合适用于罗丹明的滤光片，在100倍放大倍数下观察T Gandhi染色结果。作为诱导布氏锥虫体形成的一种替代方法，可使用干扰素-γ和脂多糖（LPS）激活感染的骨髓来源巨噬细胞。首先，开始制备L929条件培养基以用于此过程。L 9 29 是一种经过改造的纤维肉瘤细胞系，可在长期达到汇合状态后分泌巨噬细胞集落刺激因子。这种条件培养基可用于在细胞培养中将小鼠骨髓细胞诱导分化为巨噬细胞。准备条件培养基时，将1 150平方厘米培养瓶中的L 9 2 9细胞在37摄氏度下培养至完全汇合，随后继续孵育额外7至9天，直至细胞呈现球形并开始从培养瓶表面脱落。将培养基及任何脱落的细胞收集至50毫升离心管中，在420 ×g条件下离心10分钟。所得上清即为条件培养基；一个150平方厘米培养瓶的L 9 29细胞可产生30毫升条件培养基，此体积恰好用于制备150毫升BMC培养基。请记得使用将用于BMC培养的L 9 29细胞来制备BMC用DMEM培养基。如需查看分离骨髓细胞方法的详细视频方案，请在收获骨髓细胞（BMCs）并培养五天后，观看以下针对小鼠股骨的视频方案。在细菌学培养皿中，每皿加入10毫升含L 9 2 9细胞条件培养基的BMC培养基，继续培养两天，此时细胞将完全发育成熟。成熟的骨髓来源巨噬细胞或骨髓来源单核细胞（BMS）在成熟后可传代培养一至两周。传代时，先吸去培养基，加入5毫升预冷的1×PBS，于4摄氏度孵育30分钟，直至细胞开始脱落。用无菌移液管将细胞从培养皿上冲洗下来。将BMS收集至50毫升锥形管中，在420.5×g离心10分钟以沉淀细胞。将沉淀重悬于10毫升BMC培养基中，然后使用血细胞计数板测定细胞密度，每孔接种2 × 10⁵个BMS细胞。在底部放置圆形玻片的24孔板中，让细胞过夜贴壁，随后用T Gandhi进行感染。多余的细胞可回收至培养皿中以备后续使用。为激活BMS，需制备激活培养基：将LPS置于水浴中超声处理两分钟，以破坏可能存在的聚集体。随后，在BMC培养基中加入100纳克/毫升LPS和100单位/毫升IFNγ。最后，从孔中移除BMC培养基，并替换为一种激活培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天。BMC可参照之前所示的包皮成纤维细胞染色方法进行染色。在这些示例中，人包皮成纤维细胞中的弓形虫慢殖子被荧光标记的DBA标记。在pH应激条件下，如该体外囊肿横截面所示，囊壁经IFN-γ和L-P-S-D-V-A激活后呈现荧光标记。染色也出现在液泡表面，如此处所示。我们刚刚向您展示了如何对体外培养的弓形虫刚地株囊体在成纤维细胞和活化巨噬细胞中进行染色。进行此操作时，重要的是要确保寄生虫和宿主细胞在同一天准备好。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

弓形虫囊肿壁形成激活骨髓衍生的巨噬细胞和Bradyzoite条件

本研究描述了一种改良的氯化铯方法，可轻松从感染猫的粪便中纯化出适用于分子生物学和组织培养操作的刚地弓形虫卵囊...

通过不连续氯化铯梯度获得高纯度Toxoplasma gondii卵囊

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。...

分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

本视频展示了一种用于定量检测寄生虫在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）内生长的实验方法。巨噬细胞被运动型和非运动型侵袭期寄生虫感染，...

一种体外定量检测寄生虫在巨噬细胞内生长的实验方法

基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（Toxoplasma gondii）

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。...

骨髓来源巨噬细胞的制备

通过本方案，我们能够对感染了弓形虫（Toxoplasma gondii）的小鼠脑组织切片（厚度达160...

受感染神经元的三维成像与分析 体内 与 弓形虫（Toxoplasma gondii）

正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞，特别是巨噬细胞，来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma...

使用巨噬细胞进行正向遗传学筛选，以鉴定在抵抗干扰素-γ依赖性细胞自主免疫中起重要作用的Toxoplasma gondii基因

本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。...

同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。...

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

学习在体外诱导和可视化Toxoplasma gondii囊肿壁形成的方法，利用骨髓来源的巨噬细胞和成纤维细胞。该技术通过pH应激或巨噬细胞激活触发寄生虫应激反应，结合荧光凝集素标记和免疫荧光显微镜观察，为研究宿主-寄生虫相互作用和弓形虫生物学提供可靠的实验手段。

Toxoplasma gondii 在活化骨髓来源巨噬细胞及缓殖子条件下包囊壁的形成

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