小鼠胰岛的分离和包膜下肾移植的方法

孔眼移植已被提议作为 1 型糖尿病的潜在治疗方法。然而，两个主要限制使它无法成为广泛的临床现实。首先，每个收件人需要大量的孔眼。

由于孔眼是从器官捐献者那里获得的，因此潜在受体的数量受到严重限制。第二次移植需要终生使用强免疫抑制剂进行治疗，这会使患者，尤其是儿科人群面临恶性肿瘤、感染和肾功能衰竭的风险。在小鼠肾包膜下进行孔眼移植以研究改善临床移植结果的策略。

从健康供体小鼠中分离的孔眼分组并准备移植。然后将孔移植到肾脏的包膜下间隙。在糖尿病受体小鼠中，通过监测血糖水平来评估移植物的孔眼功能，结果显示大约 250 至 350 个孔眼将在移植后 24 小时内恢复 20 克受体小鼠的血糖。

这种方法的目视演示对于插管步骤至关重要。胆总管和孔眼向肾脏包膜下间隙的转移很难学习。这些步骤需要识别组织结构、稳定的手以及使用可最大限度地减少组织损伤的技术。

将安乐死的小鼠仰卧在解剖镜的纸巾上，并用 70% 乙醇喷洒腹部。用剪刀从耻骨区域到双前腿用 V 形切口打开腹部。鼠标位于解剖范围下方。

放置它，使头部指向观察者。用止血钳找到胆总管的十二指肠入口，即胆总管的十二指肠开口。止血钳的位置应使其在压缩时正好沿着胰肠边界运行。

这里将演示两种胆管插管的方法。徒手法和镊子辅助法对胆管进行插管。使用徒手方法，将夹在十二指肠上的止血钳从鼠标头部拉向尾部，使胆总管变得绷紧。

靠近肝脏的胆管汇合处，从胆囊排出的胆汁和来自肝脏的酶汇合在一起 在进入肠道之前，拉紧胆管，露出 V 形位置的内部。将弯曲的 27 号针头连接到 5 毫升注射器上，使针头直接滑过 V 形并直接插管导管的下部。将针头滑出斜口末端几毫米，以防止回流到肝脏和胆囊中。

插管成功后，从注射器中抽出 2 毫升 liase 灌注胰腺。观察胰腺在胃上的扩张，作为最佳插管的迹象。或者，可以插管胆管。

使用镊子囊肿法。将夹在十二指肠上的止血钳 C 从鼠标头部拉向小鼠尾部，使胆总管变得曲折。然后使用连接到 5 毫升注射器的弯曲 27 号针头，刺穿靠近肝脏的胆总管下方的筋膜。

在针头仍在原位的情况下，使用针头从导管中清除筋膜。放下止血钳并拿起一对镊子。使用打开的镊子的一只臂支撑胆管，针头已经清除了筋膜，同时向前拉动导管和镊子。

使用镊子作为逆止器，将针头滑入导管。成功的插管表明胃顶部的胰腺区域均匀扩张。胰腺灌注后，从十二指肠中取出止血钳。

然后用镊子抬起十二指肠，用第二对镊子将胰腺与肠道分开。接下来，将胰腺从胃和脾脏的顶部拉出。最后，将胰腺从腹部中取出，并将其从剩余的筋膜连接到肠道、胃和脾脏中切开。

将胰腺放入 50 毫升锥形管中，然后放在冰上。根据随附的书面方案中的说明，在 37 摄氏度下孵育胰腺。孵育后，向试管中加入 20 毫升培养基，并在 10 秒内剧烈摇动试管 40 次以解离组织。

此步骤对于紫罗兰的最佳回收至关重要。旋转单元每分钟旋转 800 次。Resus 在 15 毫升培养基中浸泡并浓缩样本。

将重悬的浆液倒入 0.419 毫米的金属丝网中，并将其倒入新的 50 毫升锥形管中。用另外 10 毫升含有 10% 胎牛血清的培养基冲洗第一管，然后倒入金属丝网，通过离心沉淀细胞，在 5 毫升室温下弯曲沉淀，使其不透明 10 77。然后轻轻涡旋几秒钟，在管内侧再加入 5 毫升他的不透明物质，以洗掉管壁上的孔眼，缓慢移液，以每 10 秒 1 毫升的速度将 10 毫升无血清 RPMI 沿管侧面覆盖。

清晰的界面应该是明显的。然后将样品在摇篮离心机中以 20 摄氏度和 900 倍重力旋转 20 分钟，离心后加速非常缓慢且无制动，使用一次性 10 毫升血清移液管将胰岛与外分泌细胞分离。将孔眼从 histo Paque 培养基接口转移到新的 50 ml 锥形管中。

此时可以汇集几根试管以去除孔眼残留物，他的不透明填充管中含有血清的培养基，并通过以每分钟 800 转的速度离心试管 2 分钟来沉淀胰岛。然后将胰岛悬浮在新鲜培养基中。重复此步骤至少两次。雷乌斯。

托拍悬浮在 5 毫升培养基中。将 0.1 毫米尼龙细胞过滤器倒置在 15 毫升锥形管上。用移液管将重悬的细胞浆液移过它以收集孔眼。

然后用另外 6 mL 的培养基冲洗 50 mL 试管，并将其通过过滤器。将 3 毫升培养基滴入 10 厘米的培养皿中。倒置细胞过滤器并将其浸入培养基滴中以收集孔眼，通过过滤器再吸取 5 到 7 毫升培养基到培养皿中。

要在四倍物镜下从过滤器中收集任何剩余的孔眼，请使用 P 200 移液器单独挑选孔眼并将它们转移到 1.5 毫升微量离心管中。这些图像显示了从 12 周龄 C 57 black 6 只小鼠中分离出的孔眼。完成分离程序后，可以在显微镜下估计孔眼的纯度和质量。

例如，此处显示的两张图像显示了存在碎片和外分泌细胞污染的代表性区域。为实验挑选孔眼时，请避免挑选任何看起来不健康的污染性外分泌细胞或孔眼。如隔离后 24 小时拍摄的图所示，带有坏死中心的孔不健康，隔离后坏死中心不会立即可见。

脱落细胞的孔眼是不可避免的，可以在这个 24 小时的孔眼延时视频中用于孔眼移植。隔离后，许多孔内立即出现坏死中心。这些坏死中心似乎在录制接近尾声时被从孔眼中排出。

对它们进行分组，以便每个管子的孔眼质量和大小均匀分布。例如，每组 15 个孔眼可能包含 4 个大尺寸孔眼、6 个中等孔眼和 5 个小孔眼。地方。冰上管孔可以立即用于移植或作。

使用前。将无菌凝胶加载头放入 1.5 mL 微型熔融管的开口中，使其轻轻弯曲，在尖端的窄端形成 U 形。尖端的两个开口应直接朝上朝上，露出微型垃圾管。

轻轻地从冰中取出一管孔眼。确保所有孔眼都已固定在管子底部。使用 P 200 移液器从管底部轻轻收集最小体积的孔眼，并将它们转移到准备好的弯曲尖端。

孔眼沉淀后，通过带有凝胶上样吸头的孔眼的大开口吸出介质，尽可能多地从吸头中去除介质。将新鲜的凝胶上样吸头连接到 P 200 移液器上。将管路的非斜面端连接到胰岛含凝胶上样尖端的狭窄开口上。然后将吸头连接到 P 200 移液器上，轻轻地将胰岛推入管中。

接下来，将 PE 50 管的非斜边连接到 25 微升 Hamilton 注射器的针头。抽出柱塞以压紧注射器的柱塞，直到孔眼距离斜面开口约 0.5 厘米。将注射器放在一边，以便在肾脏准备接收孔眼时，孔眼可以在管的斜面开口附近沉降成一个团块。

通过剪头发和用 Betadine 与 70% 异丙醇交替擦洗皮肤 3 次来准备手术部位。通过执行脚趾捏捏以确认受体小鼠的麻醉来开始孔眼移植手术。将玻璃棒的轴直接放在小鼠下方和垂直于脊髓的肾脏下方。

然后通过皮肤找到肾脏并放置无菌手术单。找到肾脏后，使用 McFerson banis 剪刀在其正上方垂直于脊髓的真皮上切开一个两厘米的切口。这个切口会用剪刀露出腹膜壁。

使用玻璃棒的轴作为支撑，沿与切开真皮层相同的方向在腹膜壁上切开一厘米，通过向下按压相邻表面迫使肾脏通过腹膜开口。使用浸湿的棉签涂抹器，用冰冷的无菌 PBS 润湿暴露的肾脏表面。根据需要每隔几分钟重复一次该步骤，以防止肾包膜变干。

使用 27 号针头，在肾脏前表面的肾囊中切开 0.2 厘米。从左侧向右侧移动，插入火焰拉式玻璃毛细管。通过先前做的切口进行探查，然后沿着肾脏的背侧表面向后移动。

要在肾囊和肾实质之间形成一个袋子，请将准备好的 25 毫升 Hamilton 注射器中的孔眼移动到软管斜面开口的最边缘。然后将斜边朝上插入囊下袋中。长边与肾实质接触。

将管子移动到胶囊的最后端。然后通过按下注射器的柱塞，将孔眼从 PE 50 管缓慢转移到囊下袋中。当孔眼填满造口袋时，慢慢将软管向外拉出以腾出更多空间。

从造口袋中取出管子后，沿肾脏外表面从前向后滑动玻璃探针，将孔轻轻塞入造口袋的近端。使用弯曲的手臂镊子，提起与肾脏开口相邻的腹膜内膜。然后使用浸有 PBS 的棉签涂抹器轻轻地将肾脏推回腹膜腔。

通过在腹膜壁上缝合并将伤口夹固定在真皮层上来关闭鼠标。将鼠标放回其固定架和显示器。为了恢复，应为小鼠肠道提供乙二甲水。

C 分离出小鼠孔眼。使用本视频中描述的方法和治愈剂量被移植到同种异体 C 57 black 6 小鼠中。从术后第一天开始监测非空腹血糖水平。

第 17 天左右，在 20 克受体小鼠中可以看到排斥反应，这些小鼠从同种异体供体那里接受了 300 个孔眼。在接受来自同基因供体的 150 个孔眼或 300 个孔眼的小鼠中监测恢复情况。在这种移植中没有看到排斥反应，因为孔眼来自同基因供体。

施用的孔眼剂量测量移植后立即测量孔眼的主要功能。虽然 150 个孔眼观察到边际恢复，但当移植 300 个孔眼时观察到完全恢复。观看此视频后，您应该对如何执行分离小鼠孔眼并将这些孔眼移植到肾脏包膜下间隙下所需的关键步骤有很好的了解。

通过练习，您将培养快速插管胆总管的能力，这是该方案中最困难的步骤。