Name: 细菌提供的RNAi效应:Transkingdom RNA干扰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解利用非致病性大肠杆菌递送shRNA的跨物种RNA干扰技术，用于逆转肿瘤细胞多药耐药性。该方法通过实时PCR和蛋白质印迹分析验证基因沉默效果，为癌症治疗提供新策略。

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本工作由“联邦教研部（BMBF）”资助，项目编号为01GU0615。

1) 细菌递送shRNA
<ol>
<li> 在开始细菌培养之前，必须配制 LB 培养基和 LB 琼脂。</li>
<li> 配制 LB 培养基时，称取酵母提取物（0.5 % w/v）、胰蛋白胨（1.0 % w/v）和 NaCl（0.6 % w/v），用双蒸水溶解这些成分。将配制好的溶液在高压灭菌器中灭菌，即可使用。</li>
<li> 配制 LB 琼脂平板时，需在灭菌前向 LB 培养基中加入琼脂粉（1.5 % w/v）。</li>
<li> 将 LB 琼脂在微波炉中加热至完全溶解。待溶液冷却至用手触摸瓶壁不烫手为止。加入卡那霉素（100 mg/ml），用于后续步骤中阳性克隆的筛选。</li>
<li> 在超净工作台（无菌条件下）用移液器将 20 ml LB 琼脂溶液加入 10 cm 培养皿中，制备 LB 琼脂平板。待液体凝固后，平板即可使用，可于 4 °C 保存。</li>
<li> 将编码 shRNA 的表达载体通过 CaCl2 法热激转化至感受态 E. coli ceq221 中。</li>
<li> 将转化后的细菌涂布于含有 100 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，盖上皿盖，用封口膜密封，并倒置于 37 °C 培养过夜。</li>
<li> 用牙签挑取生长的单菌落，接种至含 100 mg/ml 卡那霉素的 7.0 ml 新鲜 LB 培养基中，建立细菌小量培养，于 37 °C、200 rpm 摇床中培养过夜。</li>
<li> 取过夜培养的小量菌液，按 1:100 的比例接种至含 100 mg/ml 卡那霉素的 100 ml 新鲜 LB 培养基中，置于 1 L 三角烧瓶内，于 37 °C、200 rpm 摇床中培养过夜。</li>
<li> 在 6 孔板中每孔接种 25 × 104 个细胞（接种数量取决于相应细胞系的生长速度；接种后 24 小时细胞融合度应约为 70–80 %）人胃癌细胞（EPG85-257RDB），于 37 °C、5 % CO2、水蒸气饱和的环境中培养过夜。</li>
<li> 在癌细胞感染前，用分光光度计测定含有 tkRNAi 载体的 E. coli 过夜培养物的 OD600。将菌液稀释至光密度为 0.5（OD600 = 0.5 相当于 1.6 × 108 个细菌细胞/ml）。</li>
<li> 在细菌共孵育前 30 分钟，将癌细胞的含胎牛血清（FCS）培养基更换为无 FCS 培养基。</li>
<li> 用 1 × PBS 洗涤细菌两次，并用无血清的 Leibovitz L-15 培养基重悬并稀释。</li>
<li> 按所需感染复数（MOI，即每个癌细胞对应的细菌数量）将稀释后的细菌加入癌细胞中，在 37 °C 共孵育 2 小时。</li>
<li> 共孵育 2 小时后，用 1 × PBS 洗涤癌细胞两次，再用含 100 u/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、2.5 μg/ml 两性霉素 B、150 μg/ml 庆大霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的含血清 Leibovitz L-15 培养基洗涤一次。</li>
<li> 继续将癌细胞置于 37 °C、5 % CO2、水蒸气饱和的环境中培养。</li>
<li> 细菌处理的效果可通过荧光显微镜观察，在 mRNA 水平通过定量实时 RT-PCR 检测，在蛋白质水平通过 Western 印迹分析，并通过功能实验如流式细胞术（FACS）分析和细胞增殖实验进行验证。（如需要，这些步骤可进一步详细描述）。</li>
</ol>

2) 代表性结果
如果正确执行该方案，结果应与下图所示相似。

荧光显微镜
图1显示了细菌处理3小时后的人胃癌细胞（a），与未经处理的细胞（b）相对比。在处理后的细胞核周围可检测到细菌。
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="荧光显微镜比较；处理组与对照组；细胞形态学分析；实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：荧光显微镜观察经细菌处理（1:500）的人胃癌细胞及未经处理的人胃癌细胞对照组，DAPI染色，DAPI带通滤光片（Λem = 640 nm），40倍物镜。

定量实时逆转录 PCR
在图2中，经治疗性细菌处理后，MDR1 mRNA的表达下调约70%（黑色条柱）。由于不存在MDR1过表达，亲本细胞被用作阳性对照。含有表达抗MDR1 shRNA质粒的257RDB p170细胞系被用作跨域RNA干扰技术与其他RNA干扰沉默策略的直接比较。未处理的MDR1过表达耐药细胞系EPG85-257RDB、用不含shRNA表达质粒的细菌处理的相同细胞系，以及用携带表达抗MRP2 shRNA质粒的治疗性细菌处理的该细胞系均被用作阳性对照。
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="MDR1 mRNA表达水平的柱状图；显示细胞系耐药性分析及实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：经表达抗MDR1 shRNA的治疗性 E. coli ceq221（MOI 1 : 500）处理后，通过定量实时RT-PCR检测MDR1 mRNA的表达水平。归一化处理使用持家基因醛缩酶（aldolase）。未处理的EPG85-257RDB细胞系的MDR1/醛缩酶比值设为100%。P值采用学生t检验计算（* = p&lt;0.05，** = p&lt;0.005，*** = p&lt;0.001）。
Western印迹分析
图3显示，经细菌处理后，MDR1在蛋白水平也发生了下调。该图展示了药物敏感亲本细胞系（EPG85-257P）中MDR1的缺失表达、未经处理的耐药细胞系（EPG85-257RDB）中的MDR1表达，以及处理样本中的MDR1表达。可以明显观察到经细菌处理的细胞中MDR1表达显著下调。 <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Western blot分析；EP-G85-257细胞系中的MDR1和Actin条带；蛋白表达比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3">
图3：Western印迹分析。 未处理的药物敏感型EPG85-257P、未处理的药物耐药型EPG85-257RDB以及EPG85-257RDB在共孵育后的MDR1表达水平 E. coli ceq221 + p43 MDR1。一抗 C219 1:100 和抗肌动蛋白 1:5 000，二抗 抗小鼠 1:10 000。
细胞毒性检测
如图4所示的细胞毒性实验等功能分析也是跨域RNA干扰（transkingdom RNAi）是否发挥作用的指标。亲本细胞系和含有表达抗MDR1 shRNA质粒的细胞系对柔红霉素均未表现出任何耐药性。耐药细胞系EPG85-257RDB及另外两个对照组与用表达抗MDR1 shRNA的细菌处理的样本相比，耐药性无显著变化，而后者对柔红霉素的耐药性可逆转约90%。
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="不同细菌处理中相对IC50值的柱状图比较；抗生素抗性分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 细胞毒性检测。通过细胞存活性的细胞毒性检测确定药物特异性的IC50值。P值采用学生t检验计算（* = p&lt;0.05，** = p&lt;0.005，*** = p&lt;0.001）。

蒽环类药物积累实验
根据细菌处理样品电阻降低的结果（图4），表达抗MDR1 shRNA的细胞中蒽环类药物的累积量增加了约90%（图5所示）。亲本细胞系和257RDB p170细胞系表现出强烈的柔红霉素累积，最高可达100%；而耐药变体几乎不显示任何累积。经表达抗MDR1 shRNA的细菌处理的细胞，其蒽环类药物累积量增加了90%。
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="显示不同处理下细菌相对积累量的柱状图，突出 MDR1 的效应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 蒽环类药物积累实验。通过流式细胞术检测癌细胞在细菌处理后第6天的蒽环类药物积累量。P值采用学生t检验计算（* = p&lt;0.05，** = p&lt;0.005，*** = p&lt;0.001）。

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

用于感染的接种细胞数量以及相应的感染复数（MOI）在很大程度上取决于所观察的细胞系及其生长速度。为了确定最佳的接种细胞数量，强烈建议预先开展实验以测定细胞的生长速度。此外，由于细胞耐受细菌侵染而不因应激死亡的能力有限，应测试不同的MOI。目标基因下调的最佳时间点可能有所不同，因此建议在一定时间段内进行系列实验，以确定最佳实验条件。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液-PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>无目录编号，需直接订购</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>每毫升含5,000单位青霉素（碱基）和5,000 &amp;mu;g链霉素（碱基），使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

细菌递送rnai效应分子：跨物种rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA干扰（RNAi）是一种高效且特异抑制mRNA表达的机制。除了作为强大的实验室工具外，RNAi通路在治疗应用方面也显示出巨大潜力。在开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法过程中，将介导RNAi的试剂递送至靶细胞是主要障碍之一。一种克服该难题的新型策略是跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌（例如Escherichia coli）在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA），从而诱导RNAi效应。第一代介导tkRNAi的载体TRIP含有噬菌体T7启动子，用于调控目标治疗性shRNA的表达。此外，TRIP还包含来自Yersinia pseudotuberculosis的Inv位点，该位点编码侵袭素（invasin），可使天然非侵袭性细菌进入表达β1-整合素的哺乳动物细胞；同时携带来自Listeria monocytogenes的HlyA基因，该基因表达李斯特菌溶血素O（listeriolysin O）。这种酶可帮助治疗性shRNA从靶细胞胞质内的内吞囊泡中逃逸。将TRIP构建体导入一种感受态的非致病性Escherichia coli菌株中，该菌株表达T7 RNA聚合酶，从而驱动T7启动子介导的shRNA合成。ABCB1（MDR1/P-糖蛋白，MDR1/P-gp）是多种RNAi策略中一个已被充分研究的癌症相关靶分子。该ABC转运蛋白作为一种药物外排泵，介导人类癌细胞中“经典”的ABCB1介导的多药耐药（MDR）表型，其特征为特定的交叉耐药模式。利用携带抗ABCB1 shRNA表达载体的E. coli处理多种表达ABCB1的MDR癌细胞后，可在癌细胞内激活RNAi通路，并显著下调编码ABCB1的mRNA及其相应的药物外排泵表达水平。因此，原始耐药癌细胞内的药物蓄积增加，MDR表型得以逆转。通过该模型，实验数据验证了tkRNAi可用于调控人类癌细胞中与癌症相关的因子（如ABCB1）的概念可行性。

为了开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法，研究人员提出了一种新策略——跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA）。在此，tkRNAi成功应用于逆转癌细胞经典的ABCB1介导的多药耐药性（MDR）。

细菌递送RNAi效应分子：跨物种RNAi

RNA干扰（RNAi）是一种高效特异性抑制mRNA表达的机制。除了作为强大的实验室工具的潜力之外……

在跨物种基因沉默技术中，RNA干扰（RNAi）方法利用细菌将针对目标基因MDR1的短发夹RNA（shRNA）递送至癌细胞，旨在通过RNAi实现目标基因的沉默。首先，将表达shRNA的质粒转化至大肠杆菌中。随后接种β1阳性癌细胞，使细胞在接种24小时后融合度达到70%至80%。下一步，将表达shRNA的细菌与细胞共同孵育两小时。最后，通过对抗癌细胞进行抗生素处理来终止共孵育。结果显示，通过实时PCR、Western印迹分析、细胞增殖实验和药物累积实验，在mRNA、蛋白及功能水平上，目的基因均出现下调。该技术相较于其他标准方法（如使用寡核苷酸效应介导的siRNA转染）的主要优势在于能够高效且直接地将irna递送至靶细胞。跨界RNA干扰（Trans Kingdom RNAi，简称TK RNAi）技术利用非致病性大肠杆菌（E. coli）在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA），从而诱导RNA干扰效应。第一代介导TK RNAi的载体“trip”包含噬菌体T7启动子，用于调控目标治疗性shRNA的表达。此外，“trip”还含有来自假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）的inv基因座，该基因座编码侵袭素（invasin），可使原本非侵袭性的细菌进入β1整合素阳性的哺乳动物细胞。Tripp 还包含来自单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes）的 hliA 基因，该基因编码李斯特菌溶血素 O。这种酶可使治疗性 HRNA 从靶细胞胞质内的内吞囊泡中逃逸。Trop 构建体被导入一种具有感受态的非致病性大肠杆菌（esia coli）菌株中，该菌株编码 T7 RNA 聚合酶，以驱动 T7 启动子介导的 SH RNA 合成。随后将细菌与真核细胞共孵育，使细菌进入真核细胞。释放SH RNA并使其进入RNAi通路。开始该实验前，需在前一天按照随附书面方案所述，培养经表达S-H-R-N-A三重因子的质粒转化的大肠杆菌（e coli）过夜培养物。将细菌与靶细胞共孵育时，在六孔板中每孔接种25乘以10的4次方个人类胃癌细胞。接种细胞的数量取决于细胞系的生长速度，需规划接种时间，使细胞在接种24小时后融合度达到约70%至80%。接种后，将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳并被水蒸气饱和的环境中孵育过夜。在开始感染癌细胞之前，测定含有TK RNAi载体的大肠杆菌（e coli）过夜培养物的光密度。在细菌共孵育前30分钟，测定OD 600，并将细菌溶液稀释至光密度为0.5，同时在此期间用无FCS的培养基替换癌细胞的含FCS细胞培养基。将细菌在4℃、4,000 RPM条件下离心5分钟，用1×PBS洗涤两次，然后重悬于无血清培养基中。将 L-15 培养基补加至原始稀释体积。待细菌重悬且细胞完成30分钟孵育后，按所需的感染复数（MOI

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生物学

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