Name: 从一个暗适应切片制备小鼠视网膜神经细胞的膜片钳录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习暗适应小鼠视网膜切片制备与膜片钳记录技术，用于研究光刺激后视网膜细胞的信号传导与神经递质释放机制。该方法为视觉神经科学研究提供了重要的电生理学手段。

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本研究由美国国立卫生研究院资助项目 EY17606（APS）支持。

1. 制备电极
<ol>
<li>	将记录电极和参考电极均浸入1M NaCl溶液中，并使用1 Hz正弦波在两者之间施加15 V电压，持续约20秒，以制备电极。</li>
<li>	使用微电极拉制仪（Sutter Instruments P-97）制备记录电极。用于膜片钳的微电极采用外径1.2 mm、内径0.69 mm的硼硅酸盐玻璃管（Sutter Instruments，货号B120-69-10）。测量电极尖端的串联电阻。根据目标细胞的大小选择合适的电极尖端直径；对于直径约为20 μm的细胞体，选用电阻约为5 MΩ的电极；对于直径约为5 μm的细胞体，选用电阻约为12 MΩ的电极。</li>
<li>	制备接地/参考电极。使用注射器将少量聚乙烯管（Intramedic，PE205）填充含3.5%琼脂（Sigma；货号A7002）的1 mM NaCl溶液（琼脂溶于1M NaCl中）。将此琼脂桥置于Ag/AgCl参考电极上方。</li>
</ol>
2. 配制溶液
<ol>
<li>	外部灌流液，含碳酸氢盐的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶（Sigma；货号 A1420），1.9 g NaHCO3，7 mL 青霉素-链霉素溶液（Sigma；货号 P0781），以抑制细菌生长。调节渗透压至约 280 mOsm。</li>
<li>	切片液，含pH缓冲剂HEPES的Ames培养基（1 L）：Ames培养基粉末1瓶，0.887 g NaCl，2.38 g HEPES，7 mL 青霉素-链霉素溶液。使用1 M NaOH和/或1 M HCl调节pH至约7.4。调节渗透压至约280 mOsm。</li>
<li>	钾-天冬氨酸（K-Asp）电极内液（单位：mM）：125 K-Aspartate，10 KCl，10 HEPES，5 NMG-HEDTA，0.5 CaCl2，1 ATP-Mg，0.2 GTP-Mg；用NMG-OH调节pH至约7.3，渗透压调节至约280 mOsm。</li>
<li>	用于稳定含视网膜的低凝胶温度琼脂糖的琼脂背衬（质量分数5%）：7.5 g 琼脂（Sigma；货号 A7002）溶于150 mL去离子水（dH2O）中。</li>
</ol>

3. 实验当天
<ol>
<li>	从冰箱中取出约 1.5 mL 的 K-Asp 内液以及所选的荧光染料，解冻。将荧光染料稀释至适当浓度，该浓度应通过实验确定。</li>
<li>	将含 NaHCO3 的 Ames 培养基（约 200 mL）倒入避光储存容器中，放入水浴（30–32°C），并用 5% CO2/95% O2 气体平衡。</li>
<li>	用含 HEPES 的 Ames 培养基填充瓶子至约 110 mL，置于冰上，并用 100% O2 气体平衡。</li>
<li>	将剩余的含 NaHCO3 的 Ames 培养基放入法拉第笼顶部的加热储液槽中，并用 5% CO2/95% O2 气体平衡。可使用封口膜（Parafilm）封闭液面上方空间以保留气体。</li>
<li>	通过将 0.75 g 低凝胶温度琼脂糖（Sigma；货号 A0701）加入 25 mL 含 HEPES 的 Ames 培养基中，加热至约 115°C 以溶解琼脂糖，配制 3% 琼脂糖溶液。持续搅拌至溶液澄清无气泡，并保存于水浴（约 42°C）中。</li>
<li>	用 K-Asp 内液填充记录电极，检查尖端电阻。</li>
</ol>
4. 开始实验
<ol>
<li>处死小鼠，并使用弯头剪刀迅速摘除眼球。所有操作步骤均应佩戴红外护目镜，以防止视觉色素被漂白。</li>
<li>将眼球置于滤纸上以防止滚动，用镊子夹住眼球，使用细的双面刀片在角膜上切开一个小口。</li>
<li>眼球一经穿刺，立即将其转移至盛有Ames培养基的培养皿中。</li>
<li>以角膜上的切口为入口，使用小剪刀剪除剩余的角膜组织，随后移除晶状体和玻璃体。注意保持视网膜仍附着于眼杯上，并将眼杯置于经5% CO2/95% O2平衡的Ames培养基中，在32°C避光保存。</li>
</ol>
5. 切片
<ol>
<li>将其中一个眼杯半切开，分离视网膜与视网膜色素上皮。去除视网膜边缘，使组织能够平铺。</li>
<li>使用带有乳胶球的细玻璃巴斯德吸管，将融化的琼脂填充至35 mm培养皿中，并用镊子在琼脂表面拖动以测试其稠度。</li>
<li>当开始观察到琼脂逐渐凝固时：
<ol class="lalpha">
<li>将视网膜转移至琼脂表面。</li>
<li>使用卷成细条的Kimwipe纸巾吸除视网膜周围的过量液体。</li>
<li>直接在视网膜上滴加2–3滴琼脂，并迅速将塑料圆筒置于视网膜上方，形成围挡结构。随后，在确保视网膜位于中心位置的同时，沿塑料圆筒壁缓慢滴加额外的熔融琼脂。</li>
<li>将培养皿转移至冰水浴中冷却。</li>
</ol>
</li>
<li>约45秒后，从冰水浴中取出组织，使用推杆从远离视网膜的一侧推动，将琼脂块从塑料圆筒中推出。</li>
<li>使用单面剃须刀片切出包含视网膜的小块琼脂，并用瞬间胶将该琼脂块固定在样本盘的琼脂挡板上。</li>
<li>将样本盘转移至振动切片机托盘中，并倒入冰冷的Ames HEPES溶液，确保含视网膜的琼脂块完全浸没。</li>
<li>可在最大刀片振动频率下进行切片，前进速度设定为每片切割通过视网膜所需时间为4至5秒，从而获得厚度约为200 μm的视网膜切片。</li>
<li>使用11号手术刀片逐个取出可用的切片。</li>
<li>将含有视网膜的良好切片放入记录室中，并用带有尼龙线穿过的切片锚固定。尼龙线压住视网膜周围的琼脂，使视网膜区域保持暴露，便于记录。</li>
<li>将记录室转移至直立显微镜载物台上，关闭遮光帘并打开红外光源，通过红外敏感相机观察切片。</li>
</ol>
6. 记录
<ol>
<li>	确定一个良好的视网膜切片（具有完整的感光细胞且切割角度合适）后，开始以超过 5 mL/min 的速度灌注视网膜，使用加热至 35–37°C 并用 5% CO2/95% O2 平衡的 Ames 培养基。</li>
<li>	由于切片过程，表面可能出现一定程度的损伤。这一通常较薄的受损细胞层可通过使用尖端断裂的移液管轻轻吸除死亡的细胞体来去除。这通常会暴露出下方存活的细胞。选择一个位于目标层状结构中的健康细胞体。</li>
<li>	用 KAsp 内液填充玻璃微电极，并通过电极尖端施加正压（向外压力），然后使用显微操作器将电极尖端移入记录室并下降至细胞所在水平。</li>
<li>	移动电极尖端使其轻压细胞膜，施加轻微的负压（向内压力）以形成高阻封接。通过进一步施加负压使电极穿入细胞，从而进入全细胞记录模式。</li>
<li>	随后可使用发光二极管（LED）刺激视网膜组织，以诱发光反应。</li>
<li>	通过激发微电极内液中的荧光染料产生荧光，对记录所用的细胞进行拍照记录。</li>
</ol>

7. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="膜电位随时间变化的曲线图，显示神经元电生理学中的电活动数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 此处显示的是暗适应视网膜神经元对强度递增的光脉冲刺激所诱发的光反应电位。
<img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="视网膜神经元显微成像、视锥和视杆双极细胞、荧光成像、视觉研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 来自视网膜切片的荧光图像，其中细胞已填充荧光染料 Lucifer Yellow。诱发的荧光显示了进行膜片钳记录的细胞形态。

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

数十年来，研究人员一直采用脊椎动物视网膜切片进行记录1,2，并已成功加深了对视网膜神经回路如何编码入射光的理解。与直接使用剃刀刀片切割相比，使用振动切片机进行切片的优势在于可显著减少视网膜切片表面的损伤。通过负压移液管，可轻松去除受损组织，进而靶向切片表面下方仍保持视网膜神经回路连接的健康细胞——这些细胞类型大多已被鉴定5,6，且对光刺激表现出强烈的反应。因此，对暗适应视网膜切片进行膜片钳记录，可使研究者明确已鉴定的细胞类别在神经计算中所发挥的作用。

<table><tbody><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo; 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

我们的视觉体验始于视网膜感光细胞中的视觉色素吸收光子能量，并触发细胞内一系列级联反应，导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭。由此引起的膜电位变化继而减少了视杆细胞和视锥细胞突触终末释放的神经递质数量。为了研究光诱导的感光细胞膜电位变化如何导致视网膜下游神经活动，数十年来科学家一直采用视网膜切片制备进行电生理记录1,2。过去，这些切片是将附着于滤纸上的视网膜组织用剃刀手动切割而成；近年来发展出另一种切片方法，即将视网膜组织包埋于低凝胶温度的琼脂中，在低温溶液中使用振动切片机进行切片3,4。该制备方法获得的视网膜切片表面损伤更小，且能产生非常强健的光诱导反应。本文中，我们记录了如何在红外光下进行该操作，以避免视觉色素的漂白。

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。

我们的视觉体验始于视网膜感光细胞中的视觉色素吸收光子能量，并启动一系列级联反应……

我们的视觉体验始于视网膜感光细胞中的视觉色素吸收光子能量，最终导致细胞膜上的环核苷酸门控通道关闭。这会抑制视杆细胞和视锥细胞释放神经递质谷氨酸。下游视网膜细胞可感知释放的谷氨酸，从而研究其下游信号。从小鼠安乐死后摘除眼球。分离出S，包埋于琼脂块中，并使用振动切片机进行切片。随后，将视网膜切片置于显微镜下，并用LED光源进行刺激。在进行膜片钳记录以测量突触电流或电位时，通常刚接触该方法的研究者会因在暗环境中操作所带来的额外复杂性而感到困难。因此，能够可视化整个实验过程将提供一种难以用语言描述的直观感受。开始此操作前，先将用于记录和参比的金属丝电极表面镀上一层氯化银。将电极浸入1摩尔的氯化钠溶液中，然后使用15伏特、1赫兹正弦波电源，在电极之间施加约20秒的15伏特电压。使用微量移液器拉制仪，从经火焰抛光的BO石英玻璃中制备膜片电极，根据目标细胞的大小选择电极尖端电阻，针对直径约20微米的细胞体。对于细胞体，使用尖端电阻为5至10兆欧的移液管。对于直径约5微米的细胞体，则使用尖端电阻为12至15兆欧的移液管。制备接地参考电极时，使用注射器将3.5%的琼脂溶液（用1毫摩尔氯化钠配制）注入聚乙烯管中。接下来，根据随附书面方案中的说明，配制以下溶液：外部浴液、切片溶液、天冬氨酸钾移液管内液以及琼脂止挡层。将所有溶液保存在 4 摄氏度，直至使用。实验当天，取出约 1.5 毫升天冬氨酸钾内液，然后加入稀释的 Fluor。将约 50 毫升含碳酸氢钠的 AIMS 培养基倒入避光储存容器中。将塑料管连接至含有 5% 二氧化碳和 95% 氧气的气体钢瓶，以使 AIMS 培养基与气体平衡，然后将容器置于 30 至 32 摄氏度的水浴中。接着，取一个瓶子加入 110 毫升含 HEPEs 的 AIMS 培养基，并将其置于冰上。通过向溶液中通入100%氧气气体使培养基达到平衡。将剩余的含碳酸氢钠的aimes培养基放入法拉第笼顶部的加热储液瓶中。用对二甲苯包裹管路和瓶口，以封闭溶液上方空间的气体，并与5%二氧化碳和95%氧气气体达到平衡。使用玻璃空气分散管，将0.75克低凝胶温度琼脂加入25毫升AIMS培养基中，加热至完全溶解，配制3%琼脂溶液。搅拌过程中溶液温度约为115摄氏度。当溶液变得澄清且无气泡时，将熔化的琼脂溶液置于42摄氏度水浴中。将记录室置于倒置显微镜上。将一段五厘米长的琼脂桥滑过银/氯化银参考电极，并将其放置在记录室内。通过以下步骤测量玻璃微电极尖端电阻：用内液填充电极，将其安装在电极夹持器上，将电极夹持器置于放大器头部支架中，然后将电极下降至溶液中。为保护视觉色素以进行生理记录，所有操作均应在红外光下佩戴红外护目镜进行，但此处所有操作均在普通光照条件下展示。小鼠安乐死后，使用弯头剪刀迅速摘除眼球。将眼球置于滤纸上以防止滚动。然后用镊子固定一只眼球，并用双面薄刀片在角膜上切开一个切口。一旦眼球被刺穿，立即将眼球转移至盛有AIMS培养基的60毫米培养皿中。以角膜上的切口为入口，使用小型剪刀剪除角膜其余部分。然后移除晶状体和玻璃体，确保视网膜仍附着在眼杯上。将其置于充满AIMS培养基的避光容器中，培养基经含5%二氧化碳和95%氧气的混合气体在32摄氏度条件下平衡。接下来用10号手术刀片切开眼球杯的半侧。将视网膜与视网膜色素上皮分离。切除视网膜边缘，使组织能够平展。使用带有乳胶吸头的小型玻璃移液管，将融化的低凝胶温度琼脂填充至35毫米的培养皿中，并用镊子在琼脂中拖动以测试其稠度。当琼脂开始凝固时，将视网膜转移至琼脂表面。然后不要触碰视网膜，使用拧成条状的Kimwipe纸巾吸除其周围的过量溶液。在视网膜上直接再加入两到三滴琼脂，并迅速放置一个塑料圆筒，使其在视网膜周围形成一圈围壁，同时保持视网膜位于圆筒中央；继续滴加额外的熔化琼脂。将培养皿转移至冰水浴中冷却。30秒后，取出组织，使用推杆从距离视网膜最远的一侧推动，将琼脂块推出。使用单面剃须刀片切取含有视网膜的一小块琼脂，并用瞬间胶将琼脂块固定在样品盘的琼脂挡板上。将样品盘转移至振动切片机的样品架中，倒入冰浴的任氏液（Ringer's solution），使含视网膜的琼脂块完全浸没。使用最大振动频率的刀片进行切片，调节前进速度，使刀片切割通过视网膜所需时间为4至5秒，切取厚度约为200微米的视网膜切片。使用11号手术刀片逐个从组织块上切下可用的切片。将含有视网膜的切片放入记录室中，并用切片固定器压紧。使用切片固定器时，通过穿过固定器的尼龙线进行固定。按住视网膜周围的琼脂，使视网膜暴露无遮挡，以便进行记录。将记录室转移至直立显微镜的载物台上。关闭窗帘并打开红外光源，通过红外敏感相机观察切片。在显微镜下，选择具有完整感光细胞且切割角度合适的视网膜切片。由于切片过程，表面可能出现一定程度的损伤。使用尖端破损的移液管轻轻吸除死亡的细胞体。当暴露出一层健康的活细胞后，为去除这层薄薄的细胞，需先识别出位于目标层中的一个细胞体。移动移液管尖端使其轻压细胞膜，并施加轻微的负压或向内压力，以形成高阻封接。通过向电极施加负压以穿破细胞膜，即可进入全细胞记录模式。接下来，使用LED光源刺激视网膜组织以诱发电信号反应。在记录结束时，使用合适的激发光照射，获取从电极内液扩散至细胞内的荧光染料的荧光图像。此处展示的是经暗适应的视网膜神经元对光强逐渐增强的光脉冲所诱发的光反应电位。该图像是从视网膜切片中获取的荧光图像，其中细胞已填充荧光染料 Lucifer yellow，激发荧光显示了进行膜片钳记录的细胞形态。观看本视频后，您应能更好地理解在暗适应视网膜切片上进行膜片钳记录时存在的一些复杂性。该实验步骤的目标是在受控光照条件下测量光诱发的反应。为此，我们必须首先分离视网膜，将其包埋在琼脂中，然后制备视网膜切片，以便进行单细胞记录。

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