从一个暗适应切片制备小鼠视网膜神经细胞的膜片钳录音

当我们视网膜光感受器中的视觉色素吸收光能的光子时，我们的视觉体验就开始了，最终导致细胞膜中环核苷酸门控通道的关闭。这抑制了神经递质谷氨酸从视杆细胞和视锥细胞中释放。下游视网膜细胞感应释放的谷氨酸以研究下游信号。

从安乐死的小鼠身上摘除眼睛。分离 S，包埋在琼脂块中，并使用振动切片机切片。接下来，将视网膜切片置于显微镜下并用 LED 照明刺激。

而采用膜片钳记录来测量产生的突触电流或电位。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在黑暗中工作增加了复杂性。因此，能够可视化整个过程将提供一种原本难以描述的感觉。

通过涂覆记录线和参考线电极来开始此过程，这些电极将与一层氯化银一起使用。将电极浸入 1 摩尔氯化钠中。然后使用带有 1 赫兹正弦波的 15 伏电源在它们之间驱动 15 伏，持续约 20 秒。

使用微量移液器拉拔器，从火焰抛光的 BO 硅胶玻璃制备贴片移液器，根据直径约为 20 微米的细胞体的目标细胞的大小选择移液器吸头阻力。对于细胞体，使用尖端电阻为 5 到 10 兆欧姆的管道 PET。直径约为 5 微米后，使用 12 至 15 兆欧姆的尖端电阻。

为了制备研磨参比电极，使用注射器将 3.5% 琼脂溶液填充聚乙烯管中，该溶液是在 1 毫摩尔氯化钠中制备的。接下来，根据随附的书面方案中的说明准备以下解决方案。外浴液切片液、天冬氨酸钾移液管内液和琼脂逆止器。

将所有溶液储存在 4 摄氏度，直到需要为止。在实验当天，Thor 大约使用了 1.5 毫升天冬氨酸钾内溶液。然后加入稀释的 Fluor。

将约 50 毫升含有碳酸氢钠的 AIM 培养基倒入不透光的储存容器中。将塑料管连接到含有 5% 二氧化碳和 95% 氧气的气罐上，以平衡目标介质与气体，然后将容器放入 30 至 32 摄氏度的水浴中。接下来，在一个瓶子中装满 110 毫升的目标，中含有豌豆的培养基，并将其放在冰上。

通过用 100% 氧气鼓泡溶液来使介质相等。将剩余的含有碳酸氢钠的 aimes 培养基放入法拉第笼顶部的加热储液槽中。将 Paraform 包裹在管道和瓶盖上，以将气体捕获在溶液上方的空间中，并与 5% 二氧化碳、95% 氧气平衡。

使用玻璃空气分散管，通过加入 3 克到 25 毫升的目标培养基中并大量加热来制备 0.75% 的低胶凝温度。搅拌时溶液约为 115 摄氏度。当溶液变得透明且没有气泡时，将融化的琼脂溶液放入 42 摄氏度的水浴中。

在倒置显微镜上设置记录室。将 5 厘米琼脂桥滑过氯化银参比电极，并将其放置在记录室中。移液器吸头阻力可以通过以下方法测量：在移液器中加入内部溶液，将其放在移液器支架上，将移液器支架置于放大器头级中，然后将移液器放入溶液中以保留用于生理记录的视觉色素，所有程序都应在红外光下使用红外护目镜进行，但所有程序都将在室内光线下显示。

对老鼠实施安乐死后，使用弯曲的剪刀快速去除眼睛。将眼睛放在一张滤纸上，以防止它们滚动。然后用镊子固定一只眼睛，用薄的双面刀片在角膜上划一个口。

眼球一被刺破。将眼睛转移到一个装满 AIM 培养基的 60 毫米培养皿中。以角膜上的缝隙为入口，用小剪刀剪掉角膜的剩余部分。

然后取下晶状体和玻璃体，确保视网膜仍然附着在眼罩上。将其放入装满目标的轻巧容器中。在 32 摄氏度下用 5% 二氧化碳和 95% 氧气平衡的介质。

下一个 hemis sec.使用 10 号手术刀刀片的眼罩之一。将视网膜与视网膜色素上皮分开。

去除视网膜的边缘，让组织保持平坦。使用带有乳胶球的小型玻璃意大利面移液器将熔化的低凝胶温度琼脂填充到 35 毫米培养皿中，然后将镊子拖过琼脂以测试其稠度。一旦琼脂开始凝固，将视网膜转移到琼脂的顶部。

然后在不接触视网膜的情况下，使用一块扭曲的 Kim 湿巾吸收周围多余的溶液。将另外两到三滴琼脂直接滴在视网膜上，并快速放置一个塑料圆柱体以在其周围形成一堵墙，同时保持视网膜靠近圆柱体中心滴入额外的融化琼脂，将培养皿转移到冰水浴中冷却。30 秒后，取出组织并使用柱塞挤出琼脂块，从离视网膜最远的一侧推动。

使用单侧剃须刀片切出一小块含有视网膜的琼脂，然后将该块强力胶到位，抵住标本盘上的琼脂逆止器。将标本盘转移到振动的切片机树上，将冰冷的瞄准堆倒入树中，让带有视网膜的块完全浸没。使用最大刀片振动率和向前刀片速度切割厚度约为 200 微米的视网膜切片，以便需要 4 到 5 秒才能切开视网膜。一次。

使用 11 号手术刀刀片从块中一次切下一片可用的切片。将包含视网膜的切片放入记录室中并按住它们。使用切片锚栓将尼龙线穿过切片锚栓。

按住视网膜周围的琼脂，使视网膜畅通无阻。用于录制。将记录室转移到正置显微镜的载物台上。

拉上窗帘并打开红外光源，以在红外敏感相机上查看切片。在显微镜下，以适当的切割角度识别具有完整光感受器的视网膜切片。由于切片过程，一些表面损伤可能会很明显。

使用尖端破损的移液器轻轻吸走死细胞体 为了去除这层薄薄的细胞，一旦露出健康的活细胞层，就确定其位置位于目标层中的细胞体。移动移液器吸头，使其在细胞膜上形成凹痕，并施加轻柔、负压或向内的压力，以形成高抗性密封。可以通过对电极施加负压以闯入电池来实现全电池模式。

接下来，使用 LED 用光刺激视网膜组织以引起反应。在记录结束时，使用从移液器内部溶液透析到细胞中的 Fluor 的适当激发光捕获图像。在这里，显示了暗适应视网膜神经元对强度增加的闪光的光诱发电位。

该图是从视网膜切片拍摄的荧光图片，其中细胞充满了 Fluor Lucifer 黄色诱发荧光，显示了进行斑块记录的细胞的形态。观看此视频后，您应该更好地了解从暗适应的视网膜切片进行膜片钳记录的一些复杂性。该程序的目标是在受控照明下测量光诱发电反应。

为了做到这一点，我们必须首先分离视网膜，将其嵌入螺旋钻中，然后准备视网膜切片，我们可以从中进行单细胞记录。