Visualization of Larval Segmental Nerves in 3^rd Instar Drosophila Larval Preparations

可以通过可视化幼虫节段神经来研究轴突运输。第三龄果蝇。首先解剖幼虫，暴露 CNS，而不损伤视叶、腹侧神经节和节段神经。

该程序的第二步是将熔岩固定在甲醛中，然后与一抗孵育过夜，并将二抗在黑暗中孵育一小时。然后将熔岩安装在载玻片上，并出现轴突运输缺陷。蛋白质定位和蛋白质分布可以通过免疫荧光显微镜检查。

虽然这种方法可以提供对轴突运输的见解，但它也可以应用于其他系统，例如突触和肌肉形态。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为最初很难进行这种允许的解剖，尤其是要保持大脑节段神经和肌肉完好无损。要开始此过程，请准备一次解剖缓冲液固定剂、一次 PBT 和 5% BSA 溶液。

如解剖前表格所示，收集一对干净的五号二头肌，一把干净的直刃扇形剪刀和针开始解剖，用微勺收集游荡。第三位在具有特定基因型的星幼虫中放在培养皿上。然后在装满去离子水的培养皿中冲洗幼虫，以去除所有食物。

接下来，将熔岩放在 S 护板上，背面朝上。将熔岩固定在其前后。Ends 使用细剪刀将一滴一次性解剖缓冲液滴在固定的熔岩上。

在靠近后端的背中线上夹住熔岩。用剪刀从后端到前端剪下熔岩角质层。将一滴新的一次性解剖缓冲液滴到解剖的熔岩上。

使用针，在靠近熔岩中间的角质层的一侧边缘，然后使用另一个针固定角质层。针。角质层的第二个外侧边缘，每个外侧使用两个针，如图所示。现在，小心地去除肠道和脂肪体以及 traia，只留下带有两个视叶和腹侧神经节的大脑。

附着节段神经后，接下来将幼虫附着在保护皿上进行固定和抗体染色。将解剖的幼虫在 50 μL 固定剂中孵育 30 分钟。固定后每 15 分钟更换一次固定剂，用 1 次 PBT 冲洗幼虫 30 分钟。

每 10 分钟更换一次缓冲液，重要的是要注意幼虫应始终浸没在缓冲液中。通过在 5% BSA 溶液中稀释至适当浓度来制备一抗溶液。不同抗体的最佳浓度不同。

通过在塑料盘上衬上 Kim 来构建一个潮湿室。浸在水中擦拭。更换最后一次 PBT。

用制备好的一抗溶液冲洗，并于第二天在 4 摄氏度的潮湿室中孵育过夜。每 10 分钟更换缓冲液，用一次 PBT 冲洗解剖的幼虫 30 分钟。通过在 5% BSA 溶液中将二抗稀释至适当浓度来制备二抗。

并用箔纸包裹潮湿室，因为一些二抗对光敏感。将幼虫与二抗溶液在 25 摄氏度下孵育一小时。与二抗孵育完成后，每 10 分钟更换一次缓冲液，用 1 次 PBT 冲洗幼虫 30 分钟，然后在将熔岩安装在载玻片上之前继续封片和观察解剖的幼虫。

通过在中间铺上两条垂直的指甲油线来准备载玻片，并留出足够大的空间让盖玻片可以放置，如图所示。指甲油干燥后，让指甲油完全干燥。在载玻片上垂直指甲油线之间的空隙中滴一滴封固缓冲液，如下图所示。

滑轨现在可以安装了。在最后一次 PBT 后取回幼虫。冲洗并从熔岩中轻轻去除侧针。

小心不要小心撕裂角质层。取下剩下的两个销钉，用镊子捡起熔岩，然后将其放在准备好的载玻片上。确保熔岩没有翻转并且朝向腹侧。

面朝上，轻轻地将盖玻片放在上面，并用指甲油密封边缘，如图所示。幼虫现在可以在荧光显微镜下观察。这张代表性图像是野生型熔岩，用针对突触膀胱蛋白、胱氨酸串蛋白的抗体染色。

熔岩节段神经被平滑染色。这里。运动蛋白突变熔岩用抗 CSP 抗体染色。节段性神经显示大量积聚，CSP 呈明亮染色。

在尝试此程序时，重要的是要记住保留附着在大脑上的节段神经并保持肌肉完整。看完这个视频，你应该对如何剖析有很好的了解。固定第三个免疫染色并开始幼虫节段神经，以使用荧光显微镜研究轴突运输。