3^rd 龄 Drosophila 幼虫标本中幼虫体节神经的可视化

可以通过观察幼虫的节段神经来研究轴突运输。使用三龄幼虫黑腹果蝇。首先解剖幼虫，暴露中枢神经系统，同时不损伤视叶、腹神经节和节段神经。

该实验步骤的第二步是先用甲醛固定熔岩，然后在4℃下与一抗孵育过夜，再在避光条件下与二抗孵育一小时。随后将熔岩样本封片于载玻片上，以观察轴突运输缺陷。通过免疫荧光显微镜可检测蛋白质的定位与分布情况。

尽管该方法可为轴突运输研究提供见解，但也可应用于其他系统，例如突触和肌肉形态学研究。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为最初进行这种允许的解剖操作较为困难，尤其是保持脑节段神经和肌肉的完整性。开始此操作前，需准备一份解剖缓冲固定液、一份 PBT 缓冲液以及 5% BSA 溶液。

如解剖前所示表格中所述，准备一副洁净的5号镊子、一副洁净的直刃扇形剪刀和大头针以开始解剖；使用微型勺子收集具有特定基因型的三龄游走幼虫至培养皿中。随后，将幼虫置于盛有去离子水的培养皿中冲洗，以彻底去除所有食物残渣。

接下来将幼虫背侧朝上放置于S型防护培养皿中。用大头针固定幼虫的前端和后端。使用精细剪刀在固定好的幼虫上滴加一滴一次性解剖缓冲液。

在幼虫后端附近的背中线处剪断幼虫。使用剪刀，从幼虫后端向前端剪开幼虫的表皮。在解剖后的幼虫上滴加一滴新的1×解剖缓冲液。

使用解剖针，从幼虫中部附近挑起角质层的一侧边缘，并用另一枚解剖针将其固定。在角质层的另一侧边缘同样使用两枚解剖针，每侧各用两枚，具体位置如图所示。随后，小心移除肠道、脂肪体和气管，仅保留带有两个视叶和腹神经节的脑组织。

在附着节段神经的情况下，将幼虫固定在防护培养皿上进行固定和抗体染色。将解剖后的幼虫在50 µL固定液中孵育30分钟。固定后每15分钟更换一次固定液，随后用1× PBT冲洗幼虫30分钟。

每10分钟更换一次缓冲液时，需注意幼虫应始终浸没在缓冲液中。将一抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，配制一抗溶液。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。

通过在塑料培养皿内铺上用水浸湿的Kimwipe来构建一个湿润室。用PBT更换最后一次浸泡的Kimwipe。

用预先配制的一抗溶液冲洗，并在4°C的湿盒中孵育过夜。次日，用1×PBT缓冲液冲洗解剖后的幼虫，每次30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。将二抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，以制备二抗溶液。

用锡箔纸包裹湿盒，因为某些二抗对光敏感。将幼虫在二抗溶液中25°C孵育1小时。二抗孵育结束后，在1×PBT中清洗幼虫，每次更换缓冲液，共清洗30分钟，每10分钟换一次液，然后进行幼虫的封片与观察，在将幼虫置于载玻片上前完成解剖样本的封片与成像。

如图所示，在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油线，两条线之间留出足够容纳盖玻片的间隙。待指甲油完全干燥后，在载玻片上两条垂直指甲油线之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液，如本图所示。

载玻片现已准备好进行封片。在最后一次 PBT 处理后取出幼虫。冲洗并轻轻移除幼虫的侧向固定针。

小心操作，避免撕裂角质层。取下剩余的两枚大头针，用镊子夹起幼虫，将其放置在准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，并保持腹面朝上。

将盖玻片轻轻从一侧盖上，并用指甲油密封边缘，如图所示。此时幼虫已准备好在荧光显微镜下进行观察。此代表性图像为野生型幼虫，经针对突触囊泡蛋白——半胱氨酸串连蛋白（cysteine string protein）的抗体染色后获得。

lava 片段神经被均匀染色。此处对运动蛋白突变体 lava 使用抗 CSP 抗体进行染色。片段神经显示出大量聚集物，对 CSP 呈强阳性染色。

在进行该操作时，重要的是要记住保留与脑部相连的节段神经，并保持肌肉组织的完整性。观看本视频后，您应能较好地掌握解剖方法。固定并免疫染色第三龄幼虫的节段神经，以利用荧光显微镜研究轴突运输。