3^rd 龄 Drosophila 幼虫制备中幼虫节段神经的可视化

可以通过观察幼虫的节段神经来研究轴突运输。使用三龄幼虫黑腹果蝇。首先解剖幼虫，暴露中枢神经系统，同时不损伤视叶、腹神经节和节段神经。

该实验步骤的第二步是先用甲醛固定幼虫，然后在4℃下与一抗孵育过夜，再在避光条件下与二抗孵育一小时。随后将幼虫置于载玻片上，观察轴突运输缺陷。通过免疫荧光显微镜可检测蛋白质的定位与分布情况。

尽管该方法可为轴突运输研究提供见解，也可应用于其他系统，如突触和肌肉形态学研究。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为最初进行这种允许的解剖操作较为困难，尤其是保持脑节段神经和肌肉的完整性。开始该实验前，需准备一份解剖缓冲固定液、一份PBT溶液以及5% BSA溶液。

如解剖前的表格所示，准备一把干净的5号镊子、一把干净的直刃扇形剪刀和大头针以开始解剖操作，使用微型勺子收集游离的三龄幼虫，并将其转移至特定基因型的培养皿中。随后，用盛有去离子水的培养皿冲洗幼虫，以彻底清除其表面的所有食物残留。

接下来将幼虫置于S型防护培养皿中，腹面朝上。用大头针固定幼虫的前端和后端。用精细剪刀在固定好的幼虫上滴加一滴一次性解剖缓冲液。

在幼虫后端附近的背中线上夹住幼虫。使用剪刀，从幼虫后端开始沿背中线剪至前端，切开幼虫的角质层。在解剖好的幼虫上滴加一滴新鲜的1×解剖缓冲液。

使用解剖针，从幼虫中部附近挑起角质层的一侧边缘，并用另一根针将其固定。同样，用两根针固定角质层的另一侧边缘，每侧各使用两根针，如图所示。随后，小心移除肠道、脂肪体和气管，仅保留带有两个视叶和腹神经节的脑组织。

在保留节段神经附着的情况下，将幼虫固定在防护培养皿上进行固定和抗体染色。将解剖后的幼虫在50 µL固定液中孵育30分钟。固定后每15分钟更换一次固定液，随后用1×PBT缓冲液冲洗幼虫30分钟。

每10分钟更换一次缓冲液时，需注意幼虫应始终浸没在缓冲液中。将一抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，配制一抗溶液。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。

通过在塑料培养皿内衬浸过水的吸水纸来构建一个湿盒。用 PBT 更换最后一次浸泡的吸水纸。

用预先配制的一抗溶液冲洗，并于4°C在湿盒中孵育过夜。次日，用1×PBT缓冲液冲洗解剖后的幼虫，每次30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。将二抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，完成二抗溶液的配制。

用锡箔纸包裹湿盒，因为某些二抗对光敏感。将幼虫置于二抗溶液中，在25°C下孵育1小时。二抗孵育结束后，用1×PBT缓冲液清洗幼虫，每次更换缓冲液，共清洗30分钟（每10分钟换一次缓冲液），然后进行后续操作：在将幼虫样本置于载玻片上前，先完成解剖幼虫的封片与观察。

如图所示，在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油线，中间留出足够放置盖玻片的空间。待指甲油完全干燥后，在载玻片上两条垂直指甲油线之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液，如本图所示。

载玻片现已准备好进行封片。在最后一次 PBT 处理后取出幼虫。冲洗并轻轻移除幼虫的侧向固定针。

小心操作，避免撕裂角质层。取下剩余的两枚大头针，用镊子夹起幼虫，将其置于准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，并保持腹面朝上。

将盖玻片轻轻从一侧盖上，并用指甲油密封边缘，如图所示。此时幼虫样本已准备好用于荧光显微镜下的观察。此代表性图像为野生型幼虫，经针对突触囊泡蛋白——半胱氨酸串连蛋白（cysteine string protein）的抗体染色后获得。

幼虫节段神经被均匀染色。此处，对运动蛋白突变体lava使用抗CSP抗体进行染色。节段神经显示出大量强CSP染色信号的聚集物。

在进行该操作时，重要的是要记住保留附着在脑部的节段神经，并保持肌肉组织的完整性。观看本视频后，您应能够充分掌握解剖方法。固定样本后进行免疫染色，随后观察幼虫节段神经，利用荧光显微镜研究轴突运输过程。