Name: 3幼虫节段性神经的可视化 RD龄果蝇幼虫的筹备工作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习利用免疫荧光显微镜技术观察黑腹果蝇幼虫节段性神经，研究轴突运输机制。该方法通过解剖、固定和抗体染色，帮助科研人员分析蛋白质定位与运输缺陷，为神经发育生物学提供重要研究工具。

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SG 获得了纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。

1. 试剂的准备
<ol>
 <li>使用 128 mM NaCl、4 mM CaCl2、4 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖配制 1× 解剖缓冲液。将溶液 pH 调至 7.2，并过滤除菌。</li>
 <li>用 16% 甲醛与 1× 解剖缓冲液按 1:1 比例稀释配制固定液。</li>
 <li>将 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）与 Triton X-100 按 1:100 比例混合，配制 1× PBT。</li>
 <li>在 1× PBS 中配制含 0.01% 叠氮化钠的 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。</li>
</ol>
2. 解剖前的准备
<ol>
 <li>使用Sylgard培养皿进行解剖。通过将Sylgard 184硅弹性体基质与固化剂混合物倒入培养皿中来制备培养皿。待混合物完全固化并干燥后方可使用。</li>
	<li>解剖前，准备一把洁净的#5镊子、一把洁净的直刃Vannas剪刀以及固定用针。</li>
</ol>
3. 3的解剖rd 龄期幼虫
<ol>
 <li>收集游走的3rd 将特定基因型的龄期幼虫置于培养皿中。</li>
	<li>用去离子水清洗幼虫以去除食物残渣。</li>
	<li>将幼虫置于Sylgard培养皿中，腹面朝上，在幼虫的前端和后端分别用针固定。</li>
	<li>在固定好的幼虫上滴加一滴1x解剖缓冲液。用精细剪刀在幼虫后端背侧中线处剪开一小口，然后沿背侧中线从后端向前端剪开幼虫体壁。 </li>
	<li>在已解剖的幼虫上滴加一滴新鲜的1x解剖缓冲液。用一枚解剖针夹住幼虫中部附近体壁的一侧边缘，并将体壁固定；用另一枚解剖针固定体壁的另一侧边缘，如图所示。每侧使用两枚解剖针。参见下图。</li>
	<li>小心移除肠道、脂肪体和气管，仅保留带有两个视叶以及附着有节段神经的腹神经节的脑组织。后续操作均在硅胶培养皿中进行。</li>
</ol>
4. 解剖后幼虫的固定
<ol>
	<li>将解剖后的幼虫放入固定液中，每15分钟更换一次固定液，共孵育30分钟。</li>
	<li>固定后，用1× PBT缓冲液冲洗幼虫30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。需要注意的是，幼虫应始终置于缓冲液中。</li>
</ol>
5. 解剖后幼虫的抗体染色
<ol>
	<li>用含叠氮化钠的5% BSA溶液将一抗稀释至适当浓度，溶剂为1× PBT。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。</li>
	<li>用配制好的一抗溶液替换最后一次的1× PBT清洗液，在4°C湿盒中避光孵育过夜。湿盒可通过在塑料培养皿内铺上浸湿的无尘纸（kim-wipes）来制备。</li>
	<li>次日，用1× PBT对解剖后的幼虫进行30分钟清洗，每10分钟更换一次缓冲液。</li>
	<li>用含叠氮化钠的5% BSA溶液将二抗稀释至适当浓度，溶剂为1× PBT，然后在25°C下用二抗溶液孵育幼虫1小时。将湿盒用铝箔包裹以避光，因为二抗对光敏感。</li>
	<li>孵育结束后，用1× PBT对幼虫进行30分钟清洗，每10分钟更换一次缓冲液。</li>
</ol>
6. 解剖后幼虫的封片与观察
<ol>
	<li>在将幼虫放置到载玻片上之前，先在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油线，中间留出足以放置盖玻片的空间（见示意图）。待指甲油完全干燥。</li>
	<li>在载玻片上两条垂直指甲油线之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液（见示意图）。此时载玻片已准备好用于样品放置。 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="用于实验设置的载玻片制备示意图，显示指甲油的涂抹方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1 步骤6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="指甲油封片方法示意图，显微镜样品制备，用缓冲液密封边缘。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2 步骤6.2"></li>
	<li>完成最后一次1× PBT漂洗后，轻轻移除侧向固定针。注意不要撕裂角质层。</li>
	<li>小心移除剩余的两根固定针，用镊子夹起幼虫，并将其水平放置在已准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，腹面朝上。</li>
	<li>轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘（见示意图）。此时幼虫样品已准备好用于荧光显微镜观察。 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="幼虫在载玻片上的封片装置示意图；显示所用的指甲油、封片缓冲液和盖玻片。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1 步骤6.5"></li>
</ol>
7. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="纳米纤维的扫描电子显微照片，20 μm 尺度，材料表面分析，显微技术" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：利用抗突触囊泡蛋白cysteine string protein的抗体标记的野生型幼虫节段神经的代表性图像 （CSP，Zinsmaier 等1994）。请注意，节段神经染色均匀平滑。比例尺=20μm
<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="纤维结构、显微镜图像、标记的纤维、比例尺 20 µm、显微分析、材料研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：使用抗突触囊泡蛋白半胱氨酸串蛋白（CSP）抗体标记的运动蛋白突变体幼虫节段神经的代表性图像（CSP）。请注意，节段神经显示出大量强烈染色的CSP聚集物（箭头所示）。

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该 果蝇 幼虫节段神经是研究轴突运输机制的有力系统。如果3rd 若正确进行幼虫龄期解剖，可在单个幼虫中观察中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）。本实验方案改编自Hurd和Saxton（1996）发表的方法。该方案亦可适用于其他神经元抗体的检测，但需对抗体条件进行优化。一抗和二抗的孵育时间可作调整，也可增加封闭步骤。我们已成功应用此方案研究淀粉样前体蛋白的功能 1 和亨廷顿蛋白 2 在轴突运输中。

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>微型不锈钢固定针</td><td>精细科学工具公司</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mcpherson-Vannas 直刃剪刀，8 cm</td><td>费舍尔科技公司</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片介质</td><td>Vector Laboratories 公司</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体</td><td>道康宁公司</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，16%</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG</td><td>英杰公司</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

3rd 龄 drosophila 幼虫制备中幼虫节段神经的可视化

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster 正成为研究神经系统发育与功能的有力模型系统，尤其得益于其便利的遗传操作性和已完成全基因组测序的优势。此外，幼虫神经系统是研究轴突运输机制的理想模型系统，因为幼虫的体节神经包含成束的轴突，其胞体位于脑内，而神经末梢则沿身体长度分布。本文描述了在幼虫体节神经中可视化突触囊泡蛋白的操作流程。若操作得当，神经系统的所有组分以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）均能保持完整、无损伤，并可用于后续观察。携带不同突变的3rd 龄幼虫经解剖、固定、与突触囊泡抗体孵育后，与野生型幼虫一同进行观察和比较。该流程可适用于多种不同的突触或神经元抗体，便于在幼虫体节神经中直观观察多种蛋白分布的变化。

Drosophila melanogaster 幼虫为研究幼虫体节神经中轴突运输的机制提供了一个理想的模型系统。通过该实验流程，可将携带各种突变的3rd 龄幼虫与野生型幼虫进行比较。

3rd 龄 Drosophila 幼虫制备中幼虫节段神经的可视化

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）正日益成为研究 nervous system 发育与功能的有力模型系统，尤其是由于……

可以通过观察幼虫的节段神经来研究轴突运输。使用三龄幼虫黑腹果蝇。首先解剖幼虫，暴露中枢神经系统，同时不损伤视叶、腹神经节和节段神经。该实验步骤的第二步是先用甲醛固定熔岩样本，然后在4℃下与一抗孵育过夜，再在避光条件下与二抗孵育一小时。随后将样本置于载玻片上，观察轴突运输缺陷。通过免疫荧光显微镜可检测蛋白质的定位与分布情况。尽管该方法可为轴突运输研究提供见解，但也可应用于其他系统，如突触和肌肉形态学研究。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为最初进行这种允许的解剖操作较为困难，尤其是保持脑节段神经和肌肉的完整性。开始该实验前，需准备一份解剖缓冲固定液、一份PBT缓冲液以及5% BSA溶液。如解剖前所示表格中所述，准备一副洁净的5号镊子、一副洁净的直刃扇形剪刀和大头针以开始解剖；使用微型勺子收集具有特定基因型的三龄游走幼虫至培养皿中。随后，将幼虫置于盛有去离子水的培养皿中冲洗，以彻底去除所有食物残渣。接下来将幼虫置于S型防护培养皿中，腹面朝上。用大头针固定幼虫的前端和后端。用精细剪刀在固定好的幼虫上滴加一滴一次性解剖缓冲液。在幼虫后端附近的背中线上夹住幼虫。使用剪刀，从幼虫后端开始，沿背中线剪至前端，切开幼虫的角质层。在解剖好的幼虫上滴加一滴新的1×解剖缓冲液。使用解剖针，选取幼虫中部附近角质层的一侧边缘，并用另一根针将其固定。角质层的另一侧边缘同样使用两根针固定，每侧各用两根针，具体如图所示。现在，小心地移除肠道和脂肪体以及气管，仅保留带有两个视叶和腹神经节的脑组织。在保留节段神经附着的情况下，将幼虫固定在培养皿中进行后续的固定和抗体染色。将解剖后的幼虫在50 µL固定液中孵育30分钟。每15分钟更换一次固定液。固定结束后，用1× PBT缓冲液冲洗幼虫30分钟。每10分钟更换一次缓冲液时，需注意幼虫应始终浸没在缓冲液中。将一抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，配制一抗溶液。不同抗体的最佳浓度可能有所不同。通过在塑料培养皿内铺上用水浸湿的Kimwipe纸来构建一个湿室。用PBT更换最后一次浸泡的Kimwipe纸。用预先配制的一抗溶液冲洗，并于4°C在湿盒中孵育过夜。次日，用1×PBT缓冲液冲洗解剖后的幼虫，每次30分钟，每10分钟更换一次缓冲液。将二抗用5% BSA溶液稀释至适当浓度，完成二抗溶液的配制。用锡箔纸包裹湿盒，因为某些二抗对光敏感。将幼虫在25摄氏度下用二抗溶液孵育1小时。二抗孵育完成后，在1倍PBT中清洗幼虫，每10分钟更换一次缓冲液，共清洗30分钟，随后进行幼虫的封片与观察，在载玻片上封片前完成解剖幼虫的可视化。如图所示，在载玻片中央涂抹两条垂直的指甲油线，中间留出足够放置盖玻片的空间。待指甲油完全干燥后，在载玻片上两条垂直指甲油线之间的空隙处滴加一滴封片缓冲液，如本图所示。载玻片现已准备好进行封片。在最后一次 PBT 处理后取出幼虫。冲洗并轻轻移除幼虫的侧向固定针。小心操作，避免撕裂角质层。取下剩余的两枚大头针，用镊子夹起幼虫，将其置于准备好的载玻片上。确保幼虫未被翻转，并保持腹面朝上。将盖玻片轻轻从一侧盖上，并用指甲油密封边缘，如图所示。此时幼虫样本已准备好用于荧光显微镜下的观察。此代表性图像为野生型幼虫，经针对突触囊泡蛋白——半胱氨酸串连蛋白（cysteine string protein）的抗体染色后获得。幼虫节段神经被均匀染色。此处，对运动蛋白突变体lava使用抗CSP抗体进行染色。节段神经显示出大量强CSP染色信号的聚集物。在进行此操作时，重要的是要记住保留附着在脑部的节段神经，并保持肌肉组织的完整性。观看本视频后，您应能够充分掌握解剖方法。固定样本后进行第三次免疫染色，并利用荧光显微镜观察幼虫节段神经，以研究轴突运输过程。

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3幼虫节段性神经的可视化 RD龄果蝇幼虫的筹备工作

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