Name: 纯净小鼠的B细胞的诱导和评估类开关重组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习从小鼠脾脏中分离和激活B细胞的方法，用于研究类别转换重组和细胞增殖。该技术利用磁珠分选、CFSE染色和流式细胞术，为免疫学研究者提供可靠的体外实验方案。

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我们感谢Martin实验室的有益讨论。本出版物获得了加拿大卫生研究院（MOP-89783）资助项目的资助。A.M. 获得了加拿大研究主席二级讲席奖的支持。

步骤一：通过磁珠富集法分离脾脏 B 细胞
<ol>
 <li>实验小鼠应选择8至12周龄，以确保免疫系统完全成熟。</li>
 <li>通过颈椎脱位处死小鼠，并将其浸入70%乙醇中。通过在腹部左侧肋缘处的皮肤和肌肉做切口，手术取出脾脏，并将其在磷酸盐缓冲液（PBS）中切成三大块。确保所有器械和试剂均为无菌。</li>
 <li>使用1 mL注射器活塞的橡胶端，轻轻将脾脏研磨通过 70 μm 将细胞滤过筛网推入PBS中。务必使用推动动作而非研磨动作，因为研磨可能导致较大细胞（如增殖中的细胞）破裂。</li>
 <li>以不超过 350 g 离心 5 分钟沉淀细胞，并用 PBS 重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数。</li>
 <li>制备1×10⁶个细胞/毫升的悬浮液8 在无菌的5 mL聚苯乙烯带盖管中（每管最大体积为2 mL），用含5%正常大鼠血清的PBS重悬至细胞浓度为cells/mL。</li>
 <li>添加 50 μL 每次每毫升细胞使用 EasySep 阴性选择小鼠 B 细胞富集试剂盒中的分选混合液。用移液器吹打混匀，盖紧管盖，置于冰箱中孵育 15 分钟。</li>
 <li>添加 100 μL EasySep 生物素选择试剂盒，每毫升细胞使用一毫升试剂。用移液器吸取混合液，盖紧管盖，置于冰箱中孵育15分钟。</li>
 <li>添加 100 μL 每毫升细胞加入 EasySep 磁性纳米颗粒（确保充分混匀纳米颗粒，使溶液均匀）。用移液器加入混合液，盖紧管盖，置于冰箱中孵育 5 分钟。</li>
 <li>用 PBS 将溶液补至 2.5 mL，放入 EasySep 磁力架中静置 5 分钟。将磁力架和试管倒置，迅速将液体倒入新的聚苯乙烯试管中。切勿振荡试管，因为阴性选择的细胞会通过磁力结合在管壁上。</li>
 <li>为进一步提高细胞悬液的纯度，可将离心管再次插入磁铁中静置5分钟，然后倒入新的离心管中。此操作可能降低总体细胞回收率。</li>
 <li>B细胞纯度可通过流式细胞术分析B细胞表面标志物来评估。富集后，我们 consistently 观察到纯度为 &gt;95% B220 阳性细胞</li>
</ol>
第二步：CFSE 细胞染色
<ol>
 <li>将分离的细胞重悬于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加0.1%牛血清白蛋白，细胞终浓度为每毫升1 × 106个细胞。</li>
 <li>配制5 mM的CFSE储备液（用无菌二甲基亚砜稀释），每毫升细胞悬液中加入2 μL。终浓度为10 μM时，适用于原代B细胞的染色。</li>
 <li>在37°C避光孵育10分钟（注意：CFSE对光敏感，应尽可能避光保存和操作）。</li>
 <li>向细胞中加入等体积的新生牛血清，冰上孵育5分钟以终止染色反应。</li>
 <li>用培养基补满离心管（培养基配方见步骤III），在350 g条件下离心。注意：为抵消新生牛血清的黏稠性并确保细胞形成沉淀，加入的培养基体积至少应为原有体积的5倍。</li>
 <li>再用培养基洗涤细胞两次。此时细胞已准备好进行刺激处理。</li>
</ol>
第三步：使用LPS刺激细胞
<ol>
 <li>准备您的 体外 通过在RPMI 1640中添加10%胎牛血清制备B细胞培养基 50 μM β-巯基乙醇/ </li>
 <li>通过添加LPS至终浓度 50μg/mL分装 125 μL 将刺激培养基加入至平底96孔组织培养板的每孔中。</li>
 <li>将CFSE染色的B细胞用不含LPS的培养基重悬，终浓度为3.2 x 10⁶/mL6 细胞/mL。添加 125 μL 将细胞悬液加入含有刺激培养基的孔中，并用移液器轻轻吹打混匀。</li>
 <li>每个孔现在含有 4 x 105 最终LPS浓度下的细胞 25 μg/mL这能够提供最佳的细胞增殖和类别转换水平，但可根据需要对这些数值进行调整。</li>
 <li>将细胞置于培养箱中孵育 37°C 和 5% CO2 培养72至96小时。48小时后，在显微镜下可清晰观察到大量增殖的B细胞形成的细胞簇。</li>
</ol>
第四步：类别转换的流式细胞术分析
<ol>
 <li>当准备观察类别转换时，将细胞从培养条件下取出，并用1 mL染色缓冲液（含2%小牛血清的PBS）洗涤两次。</li>
 <li>为防止细胞发生非特异性抗体染色，将细胞在350 g离心以形成沉淀，随后进行孵育 100μL 含5%正常小鼠血清的染色缓冲液 1μg 每10⁶个细胞加入FcBlock，冰上孵育15分钟。细胞封闭步骤应在冰上进行。</li>
 <li>不洗涤细胞，直接加入 1μg 每106 用荧光标记的抗小鼠IgG3抗体对细胞进行染色，并将细胞置于冰上孵育30分钟。 </li>
 <li>通过离心洗涤细胞两次，并重悬于 200-300 μL 加入染色缓冲液后，细胞即可用于流式细胞术检测。</li>
 <li>CFSE 在 492 nm（由氩离子激光器激发）时激发效果最佳，发射波长为 517 nm。IgG3 抗体的激发和发射光谱取决于其偶联的荧光染料。</li>
</ol>
代表性结果
磁珠富集后，细胞悬液应呈现为均一的小型圆形细胞群体，细胞间无明显差异（图1A）。刺激48-72小时后，可见明显增大的增殖细胞形成的孤立簇状结构（图1B）。大量非增殖细胞在发生凋亡时会表现为体积较小且具有颗粒状特征。
通常在刺激后72至96小时之间，细胞存活率开始显著下降之前，可检测到最高水平的类别转换重组（CSR）7。在此阶段，细胞应已完成多次分裂，转换后的细胞会在后期的子代细胞群体中出现。图2展示了经LPS刺激96小时后，CFSE稀释与IgG3表面表达的代表性流式细胞术图谱。
表1. 同种型转换诱导剂混合物。注意：刺激剂浓度值仅为建议值，可能需要进行滴定优化。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>目标同种型</td>
 <td>刺激混合物</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG1和IgE</td>
 <td>LPS (25μg/mL) 和 IL-4 (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG1和IgE</td>
 <td>Anti-CD40 (10μg/mL) 和 IL-4 (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG2a</td>
 <td>LPS (25μg/mL) 和 IFN-γ (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG2b 和 IgG3</td>
 <td>LPS (25μg/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgA</td>
 <td>LPS (25μg/mL)、TGF-β (2 ng/mL) 和 IL-5 (1.5 ng/mL)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="细胞增殖分析；显微图像显示样品 A 与 B 之间的细胞密度差异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 脾脏 B 细胞的分离及 LPS 刺激。（a）LPS 刺激前经磁珠富集的脾脏 B 细胞。（b）用 25 μg/mL LPS 刺激 48 小时后。增殖的细胞表现为大量细胞簇，背景中可见正在活化增大的细胞和凋亡细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="流式细胞术分析显示CFSE细胞计数直方图和IgG3散点图，用于细胞标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. 培养96小时后的细胞增殖与类别转换重组。（a）经LPS刺激的细胞在培养96小时后的CFSE稀释情况。每一个独立的峰代表CFSE荧光的一次稀释，对应一次独立的细胞分裂。（b）IgG3表达情况，显示经过多轮细胞分裂后出现IgG3阳性细胞群体。

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

上述方案提供了一种标准检测方法，用于分析初级小鼠B细胞类别转换过程中AID的表达与功能。该方案使用细菌脂多糖（LPS）诱导从IgM向IgG3的类别转换，但可通过修改刺激培养基以诱导向其他同种型的转换（详见表18, 9）。
我们注意到，出于目前尚不清楚的原因，胎牛血清可能影响体外观察到的类别转换重组水平。为确保实验的一致性，所有类别转换重组实验必须使用同一批号的胎牛血清。此外，筛选多个来源的胎牛血清批次可能有助于获得最佳实验效果 体外 转换率。小鼠品系也可能影响类别转换的程度 体外 10根据具体检测方法的不同，对于免疫球蛋白类型转换较差的小鼠模型（如SJL小鼠），必须将其充分回交至C57BL/6背景，以获得可观的类型转换率。
如果不需要获得纯化的B细胞培养物，可省略步骤I。对脾细胞混合物进行刺激仍可诱导类别转换，但可能导致更多非B细胞发生凋亡。此外，后续流式细胞术分析必须包含已确立的B细胞标记物（例如B220、CD19）。本实验方案所用的纯化试剂...

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠 B 细胞富集试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯管</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 的脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

纯化小鼠b细胞中类别转换重组的诱导与评估

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

体液免疫是由B细胞介导并通过抗体分泌发挥作用的免疫系统分支。B细胞活化后，免疫球蛋白基因座会经历一系列遗传学修饰，从而改变所分泌抗体的结合能力和效应功能。这一过程的核心是一个称为类别转换重组（class switch recombination, CSR）的基因组重排事件，其中默认的IgM抗体同种型被替换为IgG、IgA或IgE中的一种。每种同种型均具有独特的效应功能，因此CSR对于维持免疫应答至关重要。 免疫球蛋白基因座的多样化由活化诱导的胞苷脱氨酶（AID）介导。在线可获取描述该过程的示意图视频（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）。AID 的活性及类别转换重组（CSR）通路常用于评估小鼠 B 细胞功能和体液免疫。本报告中所述方案提供了一种从小鼠脾脏分离 B 细胞的方法，并随后用细菌脂多糖（LPS）刺激，以诱导向 IgG3 的类别转换（其他抗体同种型见表 1）。此外，使用荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测刺激后细胞的分裂过程，该过程对同种型转换至关重要1, 2。 AID 的调控机制以及类别转换重组（CSR）的发生机制目前仍不明确，因此 体外 类别转换实验为在多种小鼠模型中检测这些过程提供了可靠的方法。这些实验此前已用于基因敲除小鼠的基因缺陷研究中 3此外， 体外 B细胞的转换可在病毒转导介导的RNA敲低或转基因表达以调控基因表达后发生 4-6这些实验类型的数据加深了我们对小鼠中AID活性、CSR反应的解析以及抗体介导的免疫应答的理解。

抗原暴露后，活化的B细胞亚群会经历一种称为类别转换重组（CSR）的过程，以产生具有不同效应功能的抗体同种型。本报告所述方案解释了如何诱导并分析类别转换重组。 体外 用于研究B细胞功能。

纯化小鼠B细胞中类别转换重组的诱导与评估

体液免疫是由B细胞介导并通过抗体分泌发挥作用的免疫系统分支。在B细胞活化后，……

在体液免疫应答过程中，B细胞被抗原激活后会随着应答的进展而增殖并分泌抗体。通过将默认的IgM抗体亚型替换为更多样化的IgG、IgA或IgE亚型，可评估B细胞的增殖与类别转换。实验小鼠的脾脏B细胞通过磁珠细胞分选法在体外分离获得。细胞经荧光染料 CFSE 染色以监测增殖，该增殖由细菌 L-P-S 刺激引发。L-P-S 刺激还可诱导类别转换至同种型 IgG3，该过程与增殖均可通过流式细胞术进行监测。今天我将向您展示一种分离和激活纯脾 B 细胞的技术。该技术可用于体外研究类别转换重组和细胞增殖，也可用于解答 B 细胞免疫领域中的一些关键问题，包括激活诱导的胞苷脱氨酶的功能与调控。首先用70%乙醇浸泡一只已处死的小鼠。小鼠的年龄应为8至12周，以确保免疫系统完全成熟。使用无菌剪刀在腹部左侧肋下区域的皮肤和肌肉上做一切口。用剪刀或镊子将脾脏从周围组织中分离取出。接下来，将脾脏在 PBS 中切成三大块。然后使用 1 毫升注射器推杆的橡胶端，轻轻将脾脏组织通过 70 微米细胞滤筛压入 PBS 中。注意应使用推动动作，而非研磨动作。因为研磨可能导致较大的增殖细胞破裂。以不超过350 G离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于PBS中。使用血细胞计数板在无菌的5毫升聚苯乙烯试管中对重悬的细胞进行计数。用含5%正常大鼠血清的PBS制备浓度为1×10⁸个细胞/毫升的细胞悬液。每管最多可加入2毫升悬液。接下来，每毫升细胞加入50微升EP阴性选择小鼠B细胞富集混合液。然后盖上管盖，将试管置于冰箱中孵育15分钟。每毫升细胞中加入100微升EP生物素筛选混合液。盖上管盖，于冰箱中孵育15分钟。在使用EP磁性纳米颗粒生物素筛选混合液孵育后，每毫升细胞再加入100微升。用移液器吹打混匀，盖上管盖，置于冰箱中5分钟。用 PBS 将溶液补至 2.5 毫升，放入磁力架中静置 5 分钟。将磁力架连同离心管翻转，迅速将液体倒入新的聚苯乙烯管中。切勿振荡离心管，因为阴性选择的细胞会通过磁力结合在管壁上。为进一步提高细胞悬液的纯度，将含有细胞的新管再次放入磁力架中静置 5 分钟，然后再次将液体倒入新的离心管中。此步骤可能会降低总体细胞回收率。可通过流式细胞术分析B细胞表面标志物来评估B细胞纯度。富集后，应有超过95%的细胞为B细胞20阳性。将分离的细胞重悬于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加0.1% BSA，并加入终浓度为每毫升100万个细胞的CFSE染料工作液，该工作液由5毫摩尔储备液用无菌二甲基亚砜稀释而成。每管细胞悬液每毫升加入2微升CFSE染料。CFSE用于监测刺激后细胞的分裂情况。对类别转换至关重要的过程。10 微摩尔的终浓度最适合用于初级 B 细胞的染色。37 摄氏度避光孵育 10 分钟。请注意，CFSE 对光敏感，应尽可能避光保存。孵育后，通过向细胞中加入与原体积相等的牛胎牛血清，并在冰上孵育 5 分钟，以淬灭染色。为洗涤细胞，需用至少为原体积五倍的培养基补足离心管，以抵消牛胎牛血清的黏度，使细胞能够形成沉淀，随后在 350 G 条件下离心。再用培养基洗涤细胞两次，此时细胞已准备好用于刺激。通过在 RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清和 50 微摩尔 β-巯基乙醇，制备体外 B 细胞培养基。接着，通过加入 LPS 至终浓度为 50 微克/毫升，制备刺激培养基。将 125 微升刺激培养基分装至平底 96 孔组织培养板的每孔中。将CFS E染色的B细胞在不含LPS的培养基中配制成终浓度为每毫升3.2 × 10⁶个细胞。取125 µL细胞悬液加入含刺激培养基的孔中，轻轻吹打混匀。每孔最终含有400,000个细胞，LPS终浓度为25 µg/mL。这可提供最佳的细胞增殖和类别转换水平。尽管可根据需要调整这些参数，但仍需将细胞置于37°C和5%二氧化碳条件下培养72至96小时。培养48小时后，在显微镜下可清晰观察到大量增殖的B细胞簇，可用于观察类别转换。从培养箱中取出细胞，用一毫升染色缓冲液洗涤两次，以防止非特异性抗体染色。在350 ×g条件下离心沉淀细胞。然后将细胞重悬于含5%正常小鼠血清和每百万细胞一微克FC阻断剂的100微升染色缓冲液中，置于冰上孵育15分钟，无需洗涤。加入每百万细胞一微克的荧光标记抗-US IgG三抗，冰上孵育30分钟，洗涤细胞两次后，重悬于200至300微升染色缓冲液中。细胞现已准备好进行流式细胞术检测。CFSE 最佳激发波长为 492 纳米，由氩离子激光器激发，发射波长为 517 纳米。IgG3 抗体的激发和发射光谱取决于其偶联的荧光染料。磁珠富集后，细胞悬液应呈现为均一的小型圆形细胞群体，细胞间无明显差异。刺激培养 48 至 72 小时后，可见明显增大的增殖细胞形成的孤立簇集。大量非增殖细胞因发生凋亡而表现为体积小且具有颗粒状特征。通常在刺激后72至96小时之间，CSR水平达到最高，此时大多数细胞尚未开始死亡。在此阶段，细胞应已完成多次分裂，发生类别转换的细胞会在后期的子代细胞群体中出现。在遵循这些方案的基础上，可结合其他技术，如RNA干扰介导的基因敲低，以研究任何基因对ID功能及类别转换重组过程的影响。

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