纯化小鼠B细胞中类别转换重组的诱导与评估

在体液免疫应答过程中，B细胞被抗原激活后会随着应答的进展而增殖并分泌抗体。通过将默认的IgM抗体亚型替换为更多样化的IgG、IgA或IgE亚型，可评估B细胞的增殖与类别转换。实验小鼠的脾脏B细胞通过磁珠细胞分选法在体外分离获得。

细胞经荧光染料 CFSE 染色以监测增殖，该增殖由细菌 L-P-S 刺激引发。L-P-S 刺激还可诱导类别转换至同种型 IgG3，该过程与增殖均可通过流式细胞术进行监测。今天我将向您展示一种分离和激活纯脾 B 细胞的技术。该技术可用于体外研究类别转换重组和细胞增殖，也可用于解答 B 细胞免疫领域中的一些关键问题，包括激活诱导的胞苷脱氨酶的功能与调控。

首先用70%乙醇浸泡一只已处死的小鼠。小鼠的年龄应为8至12周，以确保免疫系统完全成熟。使用无菌剪刀在腹部左侧肋下区域的皮肤和肌肉上做一切口。用剪刀或镊子将脾脏从周围组织中分离取出。

接下来，将脾脏在 PBS 中切成三大块。然后使用 1 毫升注射器推杆的橡胶端，轻轻将脾脏组织通过 70 微米细胞滤筛压入 PBS 中。注意应使用推动动作，而非研磨动作。

因为研磨可能导致较大的增殖细胞破裂。以不超过350 G离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于PBS中。

使用血细胞计数板在无菌的5毫升聚苯乙烯试管中对重悬的细胞进行计数。用含5%正常大鼠血清的PBS制备浓度为1×10⁸个细胞/毫升的细胞悬液。每管最多可加入2毫升悬液。

接下来，每毫升细胞加入50微升EP阴性选择小鼠B细胞富集混合液。然后盖上管盖，将试管置于冰箱中孵育15分钟。

每毫升细胞中加入100微升EP生物素筛选混合液。盖上管盖，于冰箱中孵育15分钟。在使用EP磁性纳米颗粒生物素筛选混合液孵育后，每毫升细胞再加入100微升。用移液器吹打混匀，盖上管盖，置于冰箱中5分钟。

用 PBS 将溶液补至 2.5 毫升，放入磁力架中静置 5 分钟。将磁力架连同离心管翻转，迅速将液体倒入新的聚苯乙烯管中。切勿振荡离心管，因为阴性选择的细胞会通过磁力结合在管壁上。为进一步提高细胞悬液的纯度，将含有细胞的新管再次放入磁力架中静置 5 分钟，然后再次将液体倒入新的离心管中。

此步骤可能会降低总体细胞回收率。可通过流式细胞术分析B细胞表面标志物来评估B细胞纯度。富集后，应有超过95%的细胞为B细胞20阳性。

将分离的细胞重悬于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加0.1% BSA，并加入终浓度为每毫升100万个细胞的CFSE染料工作液，该工作液由5毫摩尔储备液用无菌二甲基亚砜稀释而成。每管细胞悬液每毫升加入2微升CFSE染料。CFSE用于监测刺激后细胞的分裂情况。

对类别转换至关重要的过程。10 微摩尔的终浓度最适合用于初级 B 细胞的染色。37 摄氏度避光孵育 10 分钟。

请注意，CFSE 对光敏感，应尽可能避光保存。孵育后，通过向细胞中加入与原体积相等的牛胎牛血清，并在冰上孵育 5 分钟，以淬灭染色。为洗涤细胞，需用至少为原体积五倍的培养基补足离心管，以抵消牛胎牛血清的黏度，使细胞能够形成沉淀，随后在 350 G 条件下离心。再用培养基洗涤细胞两次，此时细胞已准备好用于刺激。

通过在 RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清和 50 微摩尔 β-巯基乙醇，制备体外 B 细胞培养基。接着，通过加入 LPS 至终浓度为 50 微克/毫升，制备刺激培养基。将 125 微升刺激培养基分装至平底 96 孔组织培养板的每孔中。

将CFS E染色的B细胞在不含LPS的培养基中配制成终浓度为每毫升3.2 × 10⁶个细胞。取125 µL细胞悬液加入含刺激培养基的孔中，轻轻吹打混匀。每孔最终含有400,000个细胞，LPS终浓度为25 µg/mL。

这可提供最佳的细胞增殖和类别转换水平。尽管可根据需要调整这些参数，但仍需将细胞置于37°C和5%二氧化碳条件下培养72至96小时。培养48小时后，在显微镜下可清晰观察到大量增殖的B细胞簇，可用于观察类别转换。

从培养箱中取出细胞，用一毫升染色缓冲液洗涤两次，以防止非特异性抗体染色。在350 ×g条件下离心沉淀细胞。然后将细胞重悬于含5%正常小鼠血清和每百万细胞一微克FC阻断剂的100微升染色缓冲液中，置于冰上孵育15分钟，无需洗涤。加入每百万细胞一微克的荧光标记抗-US IgG三抗，冰上孵育30分钟，洗涤细胞两次后，重悬于200至300微升染色缓冲液中。

细胞现已准备好进行流式细胞术检测。CFSE 最佳激发波长为 492 纳米，由氩离子激光器激发，发射波长为 517 纳米。IgG3 抗体的激发和发射光谱取决于其偶联的荧光染料。

磁珠富集后，细胞悬液应呈现为均一的小型圆形细胞群体，细胞间无明显差异。刺激培养 48 至 72 小时后，可见明显增大的增殖细胞形成的孤立簇集。大量非增殖细胞因发生凋亡而表现为体积小且具有颗粒状特征。

通常在刺激后72至96小时之间，CSR水平达到最高，此时大多数细胞尚未开始死亡。在此阶段，细胞应已完成多次分裂，发生类别转换的细胞会在后期的子代细胞群体中出现。在遵循这些方案的基础上，可结合其他技术，如RNA干扰介导的基因敲低，以研究任何基因对ID功能及类别转换重组过程的影响。