Name: 颅内注射腺相关病毒载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习颅内注射腺相关病毒载体技术，用于视觉皮层神经元和胶质细胞的荧光标记。该方法支持活体成像，是研究神经动态的经济高效替代方案。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号 EY012977）、Burroughs Wellcome 基金会生物医学科学职业奖、Whitehall 基金会以及 Sloan 基金会（A.K.M.）的资助支持。

1. 病毒操作与保存
<ol>
<li>应根据所用病毒的生物安全等级选择适当的防护和操作技术。这些操作规范可在《微生物和生物医学实验室生物安全》第五版中找到。th 第几版，可在美国疾病控制与预防中心（CDC）网站获取 (<a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a>）。AAV 载体的使用属于生物安全等级 1（BSL-1）范畴。本实验中，操作病毒时需穿戴实验服和手套，遵循 BSL-1 试剂的操作规程。</li>
<li>为保持病毒的活性，最好将其分成小份，以避免反复冻融。</li>
<li>准备II级生物安全柜（BSC），用于病毒分装：清除BSC内所有不必要的物品，并用70%乙醇对表面进行消毒。在柜内放置一个盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯，用于收集AAV污染性废弃物。同时将无菌0.5 mL离心管和一个干冰容器放入BSC中。</li>
<li>在生物安全柜外将病毒原液置于冰上解冻。</li>
<li>在生物安全柜内涡旋病毒并打开管盖。</li>
<li>将所需体积的分装液（例如 5 μL）移液至 0.5 mL 离心管中，盖紧管盖，并放入干冰中对病毒进行速冻。</li>
<li>当所有病毒分装完毕后，将病毒管和移液器吸头丢弃至含有10%次氯酸钠的废液容器中。</li>
<li>从通风橱中取出废液容器，加入额外的10%次氯酸钠溶液，然后将废液倒入水槽中。按照所在机构生物安全官员的指示，将塑料废弃物丢弃至生物危害容器中。</li>
<li>用10%次氯酸钠溶液清洁所有接触过病毒的仪器或表面。丢弃手套。</li>
<li>将分装样品保存于 -80°C 冰箱中。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
<li>用吸水性实验台纸覆盖手术区域。手术器械应进行灭菌处理，并根据所在机构的生物安全和动物使用指南，在无菌条件下进行手术。</li>
<li>在手术区域附近选择一个专用区域用于向微量移液器中加载病毒，并用吸水性实验台纸覆盖该区域。在此区域内将一份病毒样品置于冰上的容器中，使病毒在手术过程中于冰上缓慢融化。</li>
<li>在病毒操作专用区域内设置一个盛有10%次氯酸钠溶液的废液容器，用于丢弃接触过病毒的移液器吸头等废弃物。</li>
<li>将玻璃Wiretrol微量移液器拉制至尖端直径约为20微米。在移液器的钝端放置一小滴矿物油，并插入随移液器提供的金属丝推杆。</li>
<li>将微量移液器固定在微注射泵机械臂的夹具中。</li>
<li>通过皮下注射给予小鼠0.5 mg/kg剂量的丁丙诺啡。通过腹腔注射给予200 mg/kg剂量的Avertin进行麻醉，并使用手术剪去除头部顶部的毛发，注意保留足够边缘，防止毛发进入切口。</li>
<li>将加热垫连接至立体定位仪底座，以在整个手术过程中维持小鼠体温在37°C，并将小鼠牢固固定于立体定位仪上。</li>
<li>使用乙醇和碘伏交替擦拭头部三次，对术区进行消毒。</li>
<li>在每只眼睛上涂抹适量托百士（Tobradex）眼膏，以保持手术期间眼睛湿润。</li>
<li>沿头部中线做一切口，向后牵拉皮肤以暴露颅骨。</li>
<li>使用尖头镊子小心剥离颅骨表面的筋膜组织。</li>
<li>根据立体定位坐标确定注射位点，并使用外科记号笔在颅骨上做标记。</li>
<li>使用牙科钻配1.4 mm钻头，将颅骨直径约2 mm的区域磨薄至出现裂纹，使磨薄区域分裂为若干小片。</li>
<li>在整个操作过程中，持续用无菌生理盐水润湿颅骨以保持其湿润。</li>
<li>使用超细尖头镊子轻柔地移除已磨薄的颅骨碎片，完成开颅手术。</li>
</ol>
3. 注射液的制备
<ol>
<li>用 KimWipe 覆盖管盖，打开病毒管，将 1.5 µL（用于 1 µL 注射）病毒溶液滴加到一小块 Parafilm 上。</li>
<li>将微量移液器的尖端插入病毒原液中，手动回拉活塞。若难以将病毒原液吸入微量移液器，可用微量移液器刺穿 KimWipe 以轻微扩大尖端，折断少量玻璃部分即可。</li>
<li>将微泵臂下移至活塞位置，直至微量移液器尖端排出少量病毒液滴。用棉签蘸取并去除该液滴，随后将棉签丢弃至废物容器中。</li>
<li>在微量移液器尖端加一滴矿物油，以防止微量移液器插入脑组织过程中发生堵塞。</li>
</ol>
4. 病毒注射
<ol>
<li>根据X和Y轴立体定位坐标，将微量移液管置于待注射区域上方。本实验中，用于定位初级视觉皮层的立体定位坐标为前囟后2.7 mm、中线外侧2.5 mm。以大约1 mm/1分钟的缓慢速度将微量移液管降至正确的Z轴位置。</li>
<li>将设定的注射参数输入SYS Micro4微量泵控制器并启动注射。本实验采用的注射速率为10分钟内注射1微升（1 µL）。</li>
<li>注射完成后，将移液管留置1至2分钟，以防止拔出过程中病毒溢出。此后，以与下降相同的速度缓慢将微量移液管从脑组织中取出。</li>
<li>缝合头皮并用组织胶封闭切口。在接下来的72小时内，每隔8–12小时皮下注射一次布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg，或根据动物疼痛表现持续给药直至症状消失。将动物置于保温灯下使其恢复，直至能够自主活动并可安全放回笼中。成像实验可在病毒注射后经过所需孵育时间（数天至数周）后开始进行。</li>
</ol>
5. 样品纯化
<ol>
<li>用10%次氯酸钠溶液冲洗微量移液器，并将其丢弃至锐器容器中。</li>
<li>废弃物容器的处理方式与第1节相同。</li>
<li>将实验台纸巾丢入生物危害废物桶中，并用10%次氯酸钠溶液擦拭所有可能接触病毒的台面和仪器表面。</li>
<li>未使用的病毒可再次冷冻，但需注意反复冻融会导致病毒降解。</li>
</ol>

6. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="神经元荧光显微镜图像；绿色染料标记树突结构；细胞成像分析。" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图1"> 
图1. 注射携带绿色荧光蛋白（GFP）的双链腺相关病毒血清型1（dsAAV S1）后转导的神经元。在使用落射荧光显微镜成像的固定切片中，细胞体以及近端和远端树突均清晰可见。比例尺 = 100 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="通过GFP标记突出显示神经元活动的神经组织荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图2"> 
图2. 使用dsAAV S1对初级视皮层进行颅内病毒注射后的典型标记，显示病毒扩散范围以及被标记的神经元、胶质细胞和细胞突起。比例尺= 250 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="神经元细胞的荧光显微镜图像；用于神经科学研究的细胞结构可视化。" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图3"> 
图3. 使用dsAAV S1对海马体中的细胞进行标记。比例尺 = 250 μm。这些图片改编自Lowery et al. 20091

<ol><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li>
<li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model%2C+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li>
<li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain%3A+duration+and+modulation+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li>
<li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li>
</ol>

动物实验方案已获得罗切斯特大学动物资源委员会（UCAR）批准，符合《公共卫生服务实验室动物人道护理与使用政策》的规定。

病毒介导的基因递送在神经系统过程研究及脑部疾病治疗中具有广阔的应用前景1,2,3该技术的高度多功能性还可用于荧光标记细胞，以实现成像 体外 和 体内4本文展示了利用表达增强型绿色荧光蛋白的双链腺相关病毒对小鼠视觉皮层神经元和胶质细胞进行转导的详细实验步骤。
尽管该技术相对简单直接，但仍有一些技术细节需要考虑。一个重要的因素是注射引起的组织损伤——因此在手术过程中以及微移液管的插入和取出时必须格外小心。手术失败可能导致需要成像的结构发生改变。此外，在将病毒装入微移液管后，必须仔细清除移液管尖端的任何气泡，并确保注入正确的体积。将微移液管略微下降至目标Z坐标以下，然后回撤至正确位置，可防止病毒从注射部位溢出。在选择孵育时间时，应考虑为病毒基因表达留出足够的时间，具体时间取决于所使用的病毒类型。注射可能会引发轻微的免疫反应。根据我们的经验，这种炎症通常仅局限于针道，可通过远离注射部位（约50 μm或更远）进行成像来避免。最后，如果脑切片需要封片，建议使用抗荧光淬灭封片剂以保持荧光信号。
<p cl...

<table><tbody><tr><td>St&amp;#8211;lting 小鼠和新生大鼠适配器</td><td>Stoelting 公司</td><td>51625</td><td>可使用常规立体定位仪固定动物以进行手术</td></tr><tr><td>超细型 Bonn 剪刀，8.5 cm，直头，刃长 13 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>眼科敷料镊，10 cm，尖端宽度 0.5 mm，弯曲</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子 - Dumoxel 标准尖端，11 cm，倾斜</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>用于开颅手术的超细尖镊子</td></tr><tr><td>标准型镊子，直头，尖端尺寸 2.5 mm × 1.35 mm，12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtorque 控制箱及 Tech2000 手持装置</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>牙科钻</td></tr><tr><td>微型钻不锈钢钻头，尖端直径 1.4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 微量移液器，用于输送 1–5 µL</td><td>VWR 国际公司</td><td>5-000-1001 或 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>VWR 国际公司</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>手动显微操作器及倾斜底座（右手型）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>用于确定立体定位坐标</td></tr><tr><td>超微量泵 (UMP3)（一台）配 SYS-Micro4 控制器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>VWR 国际公司</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>可从您所在机构&amp;rsquo;s 兽医服务部门获取</td></tr></tbody></table>

颅内注射腺相关病毒载体

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

将携带荧光蛋白表达元件的病毒载体进行颅内注射，是一种灵活的标记技术，可用于在活体（in vivo）以及脑切片中对不同脑区特定细胞亚群进行可视化观察。与荧光染料注射相比，病毒标记技术能够靶向特定细胞类型，且相较于建立转基因小鼠品系，成本更低、耗时更短。本技术通过立体定位坐标，使用微量移液器和自动泵将腺相关病毒（AAV）载体精确注射至颅内目标区域，在对周围组织造成最小损伤的同时实现精准递送。注射参数可根据具体实验需求进行优化，包括注射时动物的年龄、注射位点、注射体积、注射速率、AAV血清型以及驱动基因表达的启动子。根据所选条件的不同，病毒介导的外源基因表达可实现对细胞群体、单个细胞乃至精细的细胞结构（如树突棘水平）的可视化。本文所示实验为在小鼠初级视皮层注射双链AAV，以表达绿色荧光蛋白，用于标记该区域的神经元和胶质细胞。

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。

颅内注射表达荧光蛋白的病毒载体是一种用于特异性标记可视化的通用技术，可实现对特定……的观察

病毒载体可用于在组织中的特定细胞亚群中表达荧光蛋白。在此方法中，首先在大脑初级视觉皮层区域上方进行小范围开颅手术，随后将表达工程化蛋白的病毒通过玻璃微移液管注入脑内，然后关闭手术部位。动物恢复后，可进行成像以追踪体内或脑切片中荧光标记细胞的命运。与现有的荧光染料标记和转基因小鼠品系等方法相比，该技术的主要优势在于能够靶向特定的细胞类型，且比建立转基因品系更经济、耗时更短。腺相关病毒载体的使用已获准在生物安全一级（BSL-1）条件下进行。在此，将根据处理生物安全一级病原体的操作规程穿戴实验服和手套，开始为Ali quoting病毒准备二级生物安全柜。这样做可以避免病毒反复冻融，从而保持其活性。清除生物安全柜内所有不必要的物品，并使用70%乙醇对表面进行消毒。在生物安全柜内放置一个盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯，用于收集与牙科相关的病毒污染废弃物。同时放置无菌的0.5毫升离心管和一个干冰容器。在生物安全柜外的冰上融化病毒储备液。将病毒涡旋混匀，并在生物安全柜内打开管盖。用移液器吸取所需体积的病毒液至一个0.5毫升离心管中。盖紧管盖，并将其置于干冰中。在完成病毒分装后，立即进行速冻。将空管和移液器吸头丢弃至含10%次氯酸钠的废液容器中。将废液容器从生物安全柜中移出。加入额外的10%漂白剂。等待5到10分钟，然后将漂白剂倒入水槽中。所有塑料废弃物应丢弃至生物危害容器中。根据机构规程，使用10%的漂白剂清洁所有接触过病毒的设备或表面。脱下并丢弃手套。将分装样品储存在-80摄氏度的冰箱中。用吸水性实验台纸覆盖手术区域。手术器械应保持无菌，手术须在无菌条件下进行。手术区域周围也应用吸水性实验台纸覆盖。此区域将用于向微量移液管中装载病毒。将一份病毒样品置于冰盒中，并在手术进行期间让其在冰上缓慢融化。在专门的病毒操作区域内，准备一个含有10%次氯酸钠溶液的废液容器，用于丢弃所有接触过病毒的移液枪头或其他物品。将玻璃丝微电极拉制成尖端直径约为20微米的微移液管。在微量移液管的钝端放置一小滴矿物油，并插入微量移液管配套提供的金属丝推杆。将微量移液管固定在微泵臂的夹具中。使用手术剪刀。将麻醉小鼠头部上方的毛发去除。然后将小鼠固定于立体定位仪中。用乙醇和碘伏清洗头部，以消毒该区域。手术过程中，将一滴托百得眼膏涂抹于每只眼睛表面，以保持眼睛湿润。沿头部正中线做切口，用精细镊子向后牵拉皮肤以暴露颅骨。小心剥离颅骨表面的筋膜。使用立体定位坐标确定注射区域，并用手术笔在颅骨上做标记。使用牙科钻和1.4毫米钻头，将颅骨区域磨薄至直径约2毫米，直至颅骨出现裂纹。在整个操作过程中，将磨薄的区域分割成多个部分。使用无菌生理盐水保持颅骨湿润。用超细尖镊子轻轻去除薄层颅骨组织，进行开颅手术。将一张Kimwipe纸覆盖在病毒管的管盖上。然后打开离心管，进行一微升的进样。用移液器吸取1.5微升滴加到一小块对苯

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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来源：Grames, M. S., 等．大鼠腺相关病毒静脉注射方法与技巧及中枢神经系统转导评估．J. Vis. Exp.

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