利用含RNA寡核苷酸转化法在基因组DNA中生成RNA/DNA杂交体

以下实验的总体目标是通过向酵母细胞转化含有RNA的寡核苷酸，在活酵母细胞的染色体水平上生成RNA-DNA杂交体。该过程首先将一条单链RNA寡核苷酸导入正在分裂的酵母细胞中。随后，该寡核苷酸将与位于酵母染色体上的突变标记基因的互补区域退火，形成RNA-DNA杂交体。第二步，将经含RNA寡核苷酸转化的细胞接种至选择性培养基上进行培养。

这使得细胞能够在选择性培养基上生长，其中寡核苷酸的RNA部分作为模板，用于修复突变的标记基因。随后对在选择性培养基上生长的酵母菌落进行计数，以确定含RNA寡核苷酸介导的基因修复频率，获得的结果表明遗传信息从寡核苷酸的RNA片段转移至酵母基因组中的突变标记基因。这一结论可通过限制性酶切分析、序列分析以及碱性不稳定性检测得以证实。

大家好，我是HIN的创始人，来自佐治亚理工学院生物学院Francesca博士的实验室。今天我们将向您展示一种在活体酵母细胞中于染色体水平生成RNA-DNA杂交体的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究细胞如何耐受基因组DNA中嵌入的RNA，并确定哪些因素会影响RNA-DNA杂交体在体内的稳定性。

那么我们开始吧。在实验开始之前，使用RNAs去污染溶液擦拭所有将用于实验的材料，包括寡核苷酸管、移液器、涡旋振荡器管架、实验区域以及研究人员佩戴的手套。为去除任何潜在的RNAs污染，在整个实验过程中均应使用无RNAs的水、化学试剂、管材和移液器吸头。

获取一种含有RNA的寡核苷酸，用于将遗传信息转移至酵母细胞的基因组DNA。此处使用的酵母菌株含有一个突变的trip five基因，该基因存在两个碱基的缺失和一个无义突变。该酵母菌株为色氨酸营养缺陷型突变体，在不含色氨酸的培养基上无法形成菌落。

含有RNA的寡核苷酸是一条65个碱基长度的序列，其中包含一个双碱基DNA插入片段，用于校正缺失突变。此外，该寡核苷酸还含有一个核糖核苷酸，用于校正trip五等位基因的无义突变。一旦获得该寡核苷酸，按照书面实验方案将其配制成250 µM的储存液。在使用含有RNA的寡核苷酸进行转化前16小时接种。

取5毫升富含酵母肽胨葡萄糖（YPD）液体培养基，加入trip five突变型酵母细胞，在30摄氏度下过夜培养。过夜培养后，将1.5毫升过夜培养物转移至50毫升YPD液体培养基中。在转化前立即于30摄氏度、225转/分钟的摇床中孵育4小时。

将含有 RNA 的寡核苷酸和相应的仅含 DNA 的寡核苷酸置于冰上。相应的仅含 DNA 的寡核苷酸用作阳性对照。使用无 RNA 酶的水在无 RNA 酶的离心管中将寡核苷酸稀释至 50 µM。

准备每种寡核苷酸70微升，以确保有足够的样品进行三次1 mol的转化，并留有少量多余。将含有RNA的寡核苷酸和仅含DNA的寡核苷酸置于100摄氏度的加热块上加热两分钟，以消除寡核苷酸的二级结构。变性后立即将离心管置于冰上，并在冰上保持至转化前。在无RNA酶的离心管中，于转化前立即配制溶液一和溶液二。将细胞培养物转移至一个50毫升的无RNA酶离心管中，在3000转/分钟（相当于1,562 × g）条件下离心两分钟。

去除上清液，并用50毫升无RNA酶的水洗涤细胞。再次以3000转/分钟离心2分钟。重复此步骤五次，以彻底去除培养基及最终离心后可能残留的任何RNA酶。

去除上清液，将细胞重悬于五毫升溶液一中。以每分钟3000转的速度离心样品两分钟，弃去上清液，向细胞中加入250微升溶液一。此细胞量足以进行七至八次转化。

将50微升细胞悬液分装至七个无RNA酶的微量离心管中，每管50微升。随后，向其中三管加入20微升含寡核苷酸的50微摩尔RNA溶液，向另外三管加入20微升仅含寡核苷酸的50微摩尔DNA溶液，向剩余一管加入20微升无寡核苷酸的无菌水作为阴性对照。

然后为每七个转化反应各加入 300 微升溶液二。剧烈振荡样品以充分混匀组分。将转化反应在摇床中于 30 摄氏度孵育 30 分钟，孵育后继续进行后续操作。

将样品在 42 摄氏度下热激 15 分钟。然后以每分钟 5,000 转（相当于 2,236 ×g）离心 4 分钟，沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于 100 µL 无菌水中，共处理三个试管。

取一份该细胞悬液，用无菌水将其稀释100,000倍。每个平板中加入约15颗无菌玻璃珠，将100微升稀释100,000倍后的细胞悬液分别涂布于三个YPD平板上。将每种转化反应中重悬的细胞悬液各取100微升，涂布于一个不含色氨酸的合成完全固体培养基平板上，并均匀摇动平板。

然后去除磁珠。将细胞在YPD平板上30°C培养两天，将涂布在不含色氨酸的合成完全固体培养基上的细胞在30°C培养四到五天。计数并比较在选择性培养基以及YPD培养基上生长的菌落数量，以计算含RNA的寡核苷酸、仅含DNA的寡核苷酸以及无寡核苷酸对照组的基因校正频率。

当未向细胞中添加寡核苷酸时，预期在选择性培养基上无任何菌落形成。从YPD培养基上随机挑取数个转化后的菌落进行划线，以获得单菌落分离物。将细胞在30摄氏度下培养两天，以促进菌落生长。培养结束后，挑取数个单菌落，并在YPD培养基和选择性培养基上分别划线接种。

在缺乏色氨酸的合成完全固体培养基上，经过一天培养后，可观察到经寡核苷酸转化的细胞生长，而未加寡核苷酸的对照菌株则无生长。接下来，设计一对引物，用于通过菌落PCR扩增RNA寡核苷酸所靶向的区域，以启动菌落PCR。取单个菌斑的细胞悬浮于含1单位裂解酶的50微升水中，室温孵育10分钟，随后在100摄氏度的加热块中孵育5分钟，以裂解细胞并释放基因组DNA进入溶液。

在PCR管中配制PCR反应体系，向每支PCR管中加入10微升细胞悬液，并按照书面实验方案所述进行扩增反应。将所得样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，以观察PCR产物。由于本实验中含RNA的寡核苷酸所传递的遗传信息会在酵母基因组靶区域产生一个新的VAN 91 1限制性酶切位点，因此可通过用van 91 1限制性内切酶消化PCR产物来验证遗传信息是否正确转移。

设置消化反应体系，包含6 µL PCR产物、缓冲液、BSA、0.5 µL限制性内切酶以及无菌水，总体积补至15 µL。将样品在37°C下孵育1小时。在同一块2%琼脂糖凝胶的同一行中，同时电泳未消化的样品和已消化的样品，以观察由含RNA的寡核苷酸RNA片段所介导的遗传修饰。

使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并将其制备用于DNA测序。使用扩增产物时所用的相同引物提交样品进行测序。最后，利用能够将多个序列与选定参考序列进行比对的软件分析DNA测序结果，以对每个反应中含寡核苷酸的RNA或仅含DNA的寡核苷酸进行碱处理，每反应加入一摩尔含寡核苷酸的RNA或仅含DNA的寡核苷酸至1.5毫升离心管中。

然后加入 4 µL 1 M 氢氧化钠用于水解，或加入 4 µL 水作为阴性对照。将样品在 65 °C 水浴中孵育 1 小时，孵育结束后将反应体系转移至冰上。

用两微升1.2摩尔盐酸、四微升1摩尔Tris盐酸盐和四微升水对水解反应进行中和处理（阴性对照）。加入六微升水和四微升1摩尔Tris盐酸盐。将样品置于冰上保存，直至可进行转化。

如上所述，未用寡核苷酸转化的酵母细胞在不含色氨酸的合成完全固体培养基上不会形成任何菌落。相反，将细胞用含有RNA的寡核苷酸转化后，在不含色氨酸的合成完全固体培养基上培养时，则会出现菌落。

酵母菌落在合成完全固体培养基上也能生长，该培养基不含色氨酸，且细胞仅转化了对应DNA的一纳摩尔对照寡核苷酸。通过VAN 91 1限制性酶切分析扩增靶向基因组区域的PCR产物，可明显观察到遗传信息从含RNA的寡核苷酸转移至酵母染色体DNA。如图所示，从trip. Five突变株基因组DNA中扩增出的trip. Five位点的PCR产物可见。

图中还显示了利用仅含DNA的寡核苷酸靶向trip plus菌落的基因组DNA进行PCR扩增得到的产物。同时，将利用含RNA的寡核苷酸靶向trip plus菌落的基因组DNA扩增出的PCR产物也进行了凝胶电泳分析。对相同PCR产物进行van 91 1限制性酶切的结果显示，扩增出的PCR条带为278个碱基对，经van 91 1酶切后产生177个碱基对和101个碱基对的酶切条带。

DNA测序揭示了含RNA寡核苷酸介导的基因校正。图中显示了含RNA寡核苷酸靶向的基因组区域的DNA电泳图谱。DNA序列中的g来源于含RNA寡核苷酸上的RG。

图中还框出了由仅含DNA的寡核苷酸和含RNA的寡核苷酸靶向的色氨酸操纵子（trip）阳性转化子中trip五区CG碱基序列的插入情况，并将其与靶向寡核苷酸之前的trip五区突变细胞的序列进行比较。底部的修复RNA含寡核苷酸包含两个碱基的DNA插入和一个碱基的RNA替换。

用黄色阴影框出的区域显示，在所有测试样本中，含RNA的寡核苷酸以及仅含DNA的寡核苷酸均能精确修复缺失突变和无义突变；虚线标示了含RNA寡核苷酸序列的位置。碱处理可阻止含RNA寡核苷酸介导的基因修复，图中展示了含RNA寡核苷酸和仅含DNA寡核苷酸的转化频率。误差棒表示每种寡核苷酸三次独立转化实验的平均值标准误。

仅含DNA的寡核苷酸在有无氢氧化钠处理的情况下表现出相似的转化频率。相反，含有RNA的寡核苷酸经氢氧化钠处理后，其转化频率降至零。因此，含有RNA的寡核苷酸样品中未被仅含DNA的寡核苷酸污染。

因此，观察到的转化频率特异性地依赖于含有RNA的寡核苷酸。我们刚刚向您展示了如何在染色体水平上形成R-N-A-D-N-A杂合体，以及在酵母细胞中将遗传信息从RNA转移到基因组DNA的过程。进行该实验时，必须注意使用高质量的含RNA寡核苷酸，并在无RNA酶的环境中操作。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。