Name: 在免疫功能低下小鼠颅内髓母细胞瘤细胞原位Allografting (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: 学习通过颅内微注射将髓母细胞瘤细胞原位同种异体移植到免疫功能低下小鼠小脑的技术。该方法用于研究肿瘤形成机制、神经症状及组织学特征，为开发靶向治疗提供体内模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由范德堡-英格拉姆癌症中心支持基金（P30 CA068485）、儿童脑肿瘤基金会和美国国立卫生研究院（NS042205）的资助支持。

1. 肿瘤荷载小脑的显微解剖与肿瘤组织的解离
<ol>
<li>肿瘤组织的获取
<ol>
<li> 携带髓母细胞瘤的小鼠通常体型瘦小，并表现出脑积水及典型的神经系统症状，包括后肢瘫痪以及翻转后无法恢复正常体位。为获取肿瘤组织，应通过吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死。切勿采用颈椎脱位法，该操作会对后颅施加压力，可能破坏肿瘤组织的完整性。</li>
<li> 小鼠死亡后应立即使用剪刀进行断头，尽可能去除毛发和肌肉组织，以便清晰暴露颅骨。用浸有95%乙醇的Kimwipe擦拭清洁颅骨表面。</li>
<li> 使用精细剪刀沿颅骨中线剪开一个开口，再用精细镊子去除颅骨组织，此时包含带瘤小脑在内的整个脑组织即暴露出来。</li>
<li> 健康成年小鼠的小脑通常具有界限清晰的半球和蚓部，而荷瘤小鼠的小脑则常明显肿大，形态不规则，表面光滑且血管明显。采用无菌操作技术，用镊子取出小脑肿瘤组织，并置于冰上预冷的不含Mg2+和Ca2+的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
</ol>
</li>
</ol>
注意：所有器械在使用前均需用 95% 乙醇消毒并进行蒸汽高压灭菌。
<ol start="2">
<li>肿瘤组织的解离
<ol>
<li> 将肿瘤组织从 PBS 转移至 50% Accutase（用 PBS 稀释）中，Accutase 体积约为肿瘤组织体积的 4 倍，于室温下用精细剪刀剪切 3 分钟，随后在 37°C 孵育 4 分钟，之后使用 1 mL Pipetman 反复吹打 3 分钟。该方法应获得单细胞与少量细胞团的混合物。</li>
<li> 用 PBS 将细胞悬液稀释 3 倍，于 1000×g 离心 5 分钟以收集细胞。（上述步骤已在“髓母细胞瘤干细胞的分离、富集与维持”中描述，JoVE 待刊）</li></ol></li></ol>
将细胞沉淀重悬于新鲜配制的神经干细胞培养基中，该培养基由含谷氨酰胺的Neurobasal培养基、青霉素-链霉素、N2、B27、人EGF（25 ng/mL）和碱性FGF（25 ng/mL）组成。计算溶液中的细胞密度，并用额外的神经干细胞培养基进行适当稀释，使每4 μL溶液中含有适量的解离肿瘤细胞（例如5×105个），以便将溶液加载至无菌斜面尖端的10 μL微量注射器中。接种细胞的具体数量应由研究人员根据特定实验需求确定。将细胞悬液置于冰上的微型200 μL微量离心管（PCR管）中保存。
2. 受体小鼠的麻醉程序
进行手术操作时，需要一个专用于啮齿类动物手术的消毒区域，并在整个手术过程中保持该区域的无菌状态。理想情况下，应设置一张长工作台，分别划分出动物准备区、手术区和动物恢复区，各区相互毗邻但功能独立。手术必须使用外科手套，而非检查手套。无菌操作技术的维持要求戴手套的手始终位于腰部以上，并且仅用于接触干燥无菌表面上的无菌物品。
<ol>
<li> 使用混合麻醉剂，包括氯胺酮（每1 kg小鼠体重给予100 mg氯胺酮）和赛拉嗪（每1 kg小鼠体重给予10 mg赛拉嗪），通过腹腔注射给药。</li>
<li> 麻醉剂通常需要3–5分钟起效。通过夹捏脚趾或尾部判断小鼠是否已完全麻醉。在小鼠眼睛上涂抹少量眼用软膏。将完全麻醉的小鼠转移至手术区域，并持续监测以确保其呼吸正常。</li>
</ol>
3. 肿瘤细胞的颅内移植
<ol>
<li>使用毛发修剪器剃除小鼠背部后头部区域的毛发，暴露中脑和小脑上方的后颅骨区域。</li>
<li>用棉签蘸取碘伏溶液涂抹暴露的头皮，随后用酒精棉片擦拭。重复上述两种消毒步骤两次。</li>
<li>使用灭菌手术刀在后部头皮做约6毫米（1/4英寸）的切口。使用无菌牙科钻头在人字缝右侧2毫米、后方2毫米处钻一个直径0.5毫米的钻孔。</li>
<li>将小鼠固定于立体定位仪上，使其门齿钩挂在固定架上。小心下降并定位已装入4 μL肿瘤细胞悬液的10 μL斜面针头微量注射器，将其插入钻孔中。当注射器针头斜面到达颅骨表面以下后，继续下降3毫米，再上升0.5毫米。在30秒时间内以稳定的力量缓慢将所需数量的肿瘤细胞注入受体小脑内。注射完成后，将针头留置原位额外两分钟，然后取出针头和注射器。使用自动夹闭器夹合伤口。</li>
<li>手术后将小鼠置于保温毯上，以帮助维持其体温。持续观察其活动能力及呼吸模式。当小鼠从麻醉状态恢复后，将其放回无菌饲养笼中。每日监测其摄食和饮水情况、行为表现、理毛行为以及眼部是否出现红色染色。检查切口部位是否有感染迹象。术后第7天拆除自动夹闭器。 
将小鼠维持饲养平均2–6个月，对表现出典型髓母细胞瘤症状的小鼠实施安乐死，用于后续研究。</li>
</ol>
4. 代表性结果
受体小鼠体内产生的继发性髓母细胞瘤与原发肿瘤高度相似。携带继发性肿瘤的小脑通常体积增大，形态不规则，在整体标本观察时可见异位血管。对继发性肿瘤组织进行免疫组织化学分析显示，肿瘤细胞增殖活跃，强烈表达SmoM2-YFP以及小脑颗粒神经元前体细胞的标志物，如Math1和Pax6。当采用已报道的方法（“髓母细胞瘤干细胞的分离、富集与维持”，JoVE 待发表）对继发性髓母细胞瘤细胞进行解离和培养时，这些细胞可快速扩增，表达多种干细胞标志物，具有克隆形成能力，并可在移植至其他免疫缺陷受体小鼠后进一步引发肿瘤形成。
 <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="使用苏木精、Ki67、YFP染色进行细胞分析的肿瘤组织病理显微图像。" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图1"> 
图1. 继发性髓母细胞瘤组织的典型整体装片及切片图像 
该图为注射5×105个原代肿瘤细胞后26天形成的继发性髓母细胞瘤组织的典型示例。苏木精染色显示髓母细胞瘤典型的细胞形态特征，包括高核质比和核多形性。Ki67表达表明这些继发性肿瘤细胞具有高度增殖活性，同时它们也强烈表达膜定位的SmoM2-YFP。
 <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Cell migration observation under a microscope; cluster formation comparison in scientific analysis." data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 继发性髓母细胞瘤细胞可进行培养与扩增 体外 
使用针对原代小鼠髓母细胞瘤细胞所述的方案（“髓母细胞瘤干细胞的分离、富集与维持”，JoVE 即将发表），这些继代髓母细胞瘤细胞可被培养并多次传代扩增。图中显示了同一代表性肿瘤克隆在培养第4天和第14天的形态。培养的肿瘤细胞呈双极形、细长状，胞质稀少，常从细胞聚集体致密核心向外辐射生长。这些细胞不表现出接触抑制生长的特性。其中的小型圆形细胞为红细胞。

<ol><li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li>
<li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li>
<li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li>
<li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

确保髓母细胞瘤细胞同种移植成功并形成继发性肿瘤的几个关键因素如下：首先，仅使用50%的Accutase进行组织解离，且不得过度消化组织，因为长时间的酶处理会导致细胞活力显著下降。同时，仅使用1 mL规格的Pipetman移液器，因为更小的吸头也可能对解离后的细胞造成机械损伤。用于移植的细胞悬液中包含单细胞和小细胞团的混合物是可接受的。其次，在每次装填Hamilton注射器前，必须充分混匀并平衡肿瘤细胞悬液。每次注射体积不得超过4 μL，因为较大体积会产生过高的颅内压力和阻力。最后，每次注射后需额外等待2分钟，以使注射液充分扩散至小脑组织中。
本文所述方法可用于确定能够启动并推动肿瘤形成的遗传标记的细胞类型。该方案同样适用于待注射细胞并非直接来源于原发性肿瘤组织，而是来源于已建立的培养细胞系的情况。可通过酶消化和/或反复吹打制备适当数量的细胞，并从此方案的第2步开始操作。因此，我们还可检测候选基因的功能以及化学化合物的抑制作用。 体内 肿瘤生长读数

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50% </td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting Co.</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>柔性轴式悬挂钻机</td><td>Stoelting Co.</td><td>58650</td><td></td></tr><tr><td>大型探针固定架</td><td>Stoelting Co.</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 注射器，26 号针头，斜面针尖</td><td>Stoelting Co.</td><td>51105</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 钻头</td><td>Stoelting Co.</td><td>51455-3</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫缺陷小鼠髓母细胞瘤细胞颅内原位异种移植

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

髓母细胞瘤是儿童神经系统中最常见的肿瘤。大量动物研究将小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）视为髓母细胞瘤的肿瘤起源细胞1-4。然而，人类患者中髓母细胞瘤亚型的临床表现具有高度异质性（包括结节型、促纤维增生型、经典型以及大细胞/间变型），且部分患者并未出现CGNP标志物的异位表达5，这些现象表明髓母细胞瘤在细胞与分子层面的起源更为复杂，远未被完全阐明。因此，明确是否存在其他可能的髓母细胞瘤肿瘤起源细胞，对于开发基于特定细胞类型的治疗策略至关重要。为此，可通过将遗传标记的肿瘤细胞类型进行颅内原位同种移植，随后分析受体动物中继发性肿瘤的形成情况，以确定肿瘤起始细胞的细胞来源。本文描述了源自原发性肿瘤组织的髓母细胞瘤细胞进行颅内原位同种移植的实验方案，该程序同样适用于已建立的细胞系细胞的移植。

本方案描述了小鼠髓母细胞瘤组织的分离与解离，以及随后将肿瘤细胞异体移植到免疫缺陷型受体小鼠体内以建立继发性髓母细胞瘤的方法。

髓母细胞瘤是儿童神经系统最常见的肿瘤。大量动物研究集中于小脑颗粒神经元……

本实验的总体目标是将同种异体的髓母细胞瘤细胞植入免疫缺陷型宿主体内，以诱导继发性肿瘤的形成。该过程首先将原代髓母细胞瘤组织解离为单细胞和小的细胞团簇；第二步是为免疫缺陷型小鼠进行颅内注射的准备工作。该操作流程的第三步是将肿瘤细胞显微注射到宿主小脑中。该操作流程的最后步骤是维持并观察移植了肿瘤细胞的宿主。最终，可通过观察宿主表现出的神经系统症状以及组织学分析，获得显示继发性髓母细胞瘤形成的实验结果。该技术有助于回答癌症生物学中的关键问题，例如确定肿瘤的细胞起源以及启动和推动肿瘤发生发展的关键因素。按照配套视频文章所述方法，对髓母细胞瘤组织进行显微切割和解离，分离、富集并维持髓母细胞瘤细胞系。将肿瘤细胞悬液用神经干细胞培养基稀释，使每四微升溶液中含有适当数量的解离肿瘤细胞，此处为五乘以十的六次方个细胞。将稀释后的细胞悬液置于200微升微量离心管中，并置于冰上保存。使用毛发修剪器剃除麻醉后的免疫缺陷宿主小鼠背部后头部区域的毛发，暴露后侧颅骨。在暴露的头皮上涂抹聚维酮碘溶液，随后用酒精棉片擦拭。重复上述两种消毒步骤两次。使用无菌手术刀在颅骨后部头皮处做一个四分之一英寸的切口。使用无菌牙科钻头在λ点右侧2毫米、后方2毫米处钻一个直径0.5毫米的钻孔。将宿主小鼠固定于立体定位仪上。使用一支带斜面针头的10微升注射器吸取4微升肿瘤细胞悬液，将注射器固定在支架上的显微操作仪上。在显微镜下，小心下降并调整针尖位置，使其进入颅骨钻孔内。当注射器斜面位于颅骨表面下方时，再下降3毫米。随后向上回退0.5毫米，使针尖与小脑组织之间形成一定空间。在30秒内，以缓慢而稳定的力度向宿主小鼠小脑注射4微升肿瘤细胞悬液。将针头留置原位两分钟。移除针头和注射器。使用无菌自动夹闭器封闭伤口。将小鼠置于加热毯上使其恢复。术后将小鼠放回无菌饲养笼中，并观察其行为及注射部位是否有感染迹象。术后7天，取下自动夹具。小鼠将在注射后两个月至六个月之间表现出典型的髓母细胞瘤症状。以下是在注射5 × 10⁵个原代肿瘤细胞后26天形成的继发性髓母细胞瘤组织的典型示例。苏木精-伊红染色显示髓母细胞瘤典型的细胞形态学特征，包括高核质比和核多形性。这些继发性肿瘤细胞具有高度增殖性，表现为KI 67表达阳性，同时强烈表达膜定位的smoothened M two YFP。利用小鼠原代模型细胞和基质细胞的配套实验方案，这些继发性模型细胞和基质细胞可进行体外培养并多次传代扩增。红色箭头指向一些红细胞。此处为同一代表性肿瘤克隆在培养第4天和第14天的情况。培养的肿瘤细胞呈双极形，胞质稀少且细长，常从细胞聚集体的致密核心向外辐射。在执行这些操作步骤时，需先将注射针尖降至颅骨表面以下3毫米处，再继续推进0.5毫米，从而在脑组织与注射针尖之间留出适当的空间。

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在免疫功能低下小鼠颅内髓母细胞瘤细胞原位Allografting

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

本文旨在介绍一种用于化疗放疗研究的原位胶质母细胞瘤模型。文章将详细阐述利用颅内模型进行小鼠细胞处理、移植及放射治疗的步骤。...

原位小鼠脑肿瘤模型中的联合放射治疗

本视频展示了通过颅内注射将肿瘤细胞植入小鼠大脑的操作过程。...

颅内原位模型：小鼠脑内癌细胞移植操作步骤

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。...

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

由于干细胞具有内在的肿瘤趋向性，它们作为治疗脑肿瘤的载体具有广阔前景。非侵入性的经鼻干细胞递送可绕过血脑屏障，在临床转化方面展现出巨大潜力。本文总结了在胶质瘤小鼠模型中经鼻干细胞递送的基本原理。...

小鼠模型中通过鼻内递送治疗性干细胞至胶质母细胞瘤

具有肿瘤趋向性的治疗用间充质干细胞（MSCs）在治疗侵袭性胶质母细胞瘤方面展现出良好前景。最佳移植策略涉及将MSCs接种于支架材料后递送至肿瘤切除腔内。本文提供了用于研究MSC治疗胶质母细胞瘤的临床前技术，包括：影像引导下的肿瘤切除；接种MSC的支架植入；以及术后治疗监测。...

图像引导下胶质母细胞瘤切除及治疗性干细胞接种支架的颅内植入

本文介绍了一种在携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠中，制备并进行立体定向移植同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为细胞免疫疗法经颅内递送的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。...

立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

建立原位儿童脑瘤模型需要极为精细的操作，需使用立体定位仪精确植入癌细胞。本文所述方法概述了脑瘤细胞制备、颅内注射操作以及术后监测系统实施的各个步骤，以评估脑瘤的移植情况。...

使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

学习通过颅内微注射将髓母细胞瘤细胞原位同种异体移植到免疫功能低下小鼠小脑的技术。该方法用于研究肿瘤形成机制、神经症状及组织学特征，为开发靶向治疗提供体内模型。

免疫缺陷小鼠髓母细胞瘤细胞颅内原位异种移植

探索更多视频