鼠标垂体免疫原的制备诱导实验性自身免疫性垂体炎

自身免疫性垂体炎的特征是垂体腺增大以及一种或多种垂体激素缺乏。其致病性自身抗原仍不明确。本文展示了一种制备小鼠垂体腺蛋白的实验方案，可用于该疾病的研究。

首先从安乐死的小鼠中分离出垂体。然后将垂体进行匀浆处理，以机械方式破碎细胞并释放胞质蛋白。通过低速离心澄清匀浆液，并采用比色法BCA检测定量蛋白质含量，同时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳评估其质量。

最后，将水相蛋白质匀浆与油性佐剂混合。然后将该混合物注射到小鼠体内，以建立类似于自身免疫性垂体炎的小鼠模型。如配套视频所示，已有四种技术被用于在实验动物中诱导垂体炎。

本文介绍的技术是将垂体蛋白混合物与流感佐剂联合注射，这是最早的一种方法，可追溯至20世纪60年代。其他方法包括：1992年注射风疹病毒的可溶性糖蛋白，2002年通过立体定位技术将腺病毒直接注射至垂体腺，以及2010年将一种大鼠品系的垂体腺移植到另一种大鼠品系的肾包膜下。佛罗伦萨佐剂法的主要优势在于，该方法如今更具微创性，结果更稳定，尤其能够更准确地诱导出与人类疾病高度相似的动物模型。

尽管自20世纪60年代起已有报道，但使用外来佐剂技术诱导垂体炎的效果一直不佳。当我刚开始博士课题研究时，采用已发表的外来佐剂方案仅能获得较轻程度的垂体炎发生率和严重程度。当我想到将EM乳剂中所含垂体蛋白的量增加十倍时，情况便显著改善。

尽管该方法可为自身免疫性垂体炎的发病机制提供见解，但也可用于研究其他尚未明确自身抗原的自身免疫性疾病。通常，初次接触该方法的研究人员主要会在最后一步——即乳剂的制备——遇到困难，因为该步骤需要熟练的手工操作、时间和专注投入。因此，直观的演示对于理解如何正确制备乳剂至关重要。

该技术的意义超出了自身免疫领域的范畴。掌握如何制备用于免疫的抗原，还可应用于单克隆抗体的生产或新疫苗的测试。本次演示该技术的是来自我实验室的 S Zoo heroic Ura 和 Mayland al gato。

小鼠垂体是一个圆柱形的腺体，位于颅底蝶骨的一个凹陷处，该凹陷称为蝶鞍。该腺体外侧毗邻三叉神经，前方毗邻视神经交叉。垂体由较大的前叶以及较小的中间叶和后叶组成。

为分离垂体，使用剪刀将已处死的小鼠断头，然后从头骨后部向前部做平行切口。抬起脑组织并向后翻转，以暴露垂体，垂体呈圆柱状，位于一个等腰三角形结构中：以垂体为底边，三叉神经为两侧边，视交叉为顶点。

用闭合的镊子尖端环绕腺体，以撕破周围的脑膜。然后用精细镊子从Turca腔中夹取垂体，并将其放入盛有干冰的塑料管中。每次制备需收集300个小鼠垂体腺体。

该样本采集过程大约需要九个人工小时。采集完成后，将垂体腺置于零下80摄氏度保存，直至需要使用。将一个15毫升Falcon管放入冰浴中。

向离心管中加入 250 微升裂解缓冲液。每收集 100 个垂体后，在匀浆前将小鼠垂体腺加入缓冲液中。接下来，将聚四氟乙烯匀浆器（直径 5 毫米的转子）的探头置于含有小鼠垂体和缓冲液的 Falcon 管底部，以最大速度匀浆 30 秒。

在保持离心管置于冰上的同时，轻轻上下移动。然后将匀浆液在冰上静置一分钟。重复匀浆和冷却步骤再进行两次。

这种温和的匀浆处理应能破碎细胞并释放蛋白质，同时保持细胞核的完整性。将匀浆液在4°C条件下以低速离心，约1000 ×g离心10分钟，以沉淀细胞核、未破碎的组织以及结缔组织和变性蛋白质复合物等不溶性物质。注意不要扰动沉淀物。

将现在称为核后上清液（PNS）的SNA转移至一个新的Falcon管中。将PNS置于冰上，用与之前相同的匀浆缓冲液体积重悬沉淀，再次匀浆并按前述条件离心。合并两份PNS样品后，将溶液分装至多个微量离心管中。

将微量离心管于-80°C保存，直至需要时使用。该蛋白制剂在-80°C下稳定，但会逐渐失去活性。因此，建议在制备后六个月内使用。

保留少量PNS样品，用于通过双缩脲法测定蛋白质产量和浓度。然后通过凝胶电泳测定来自300个小鼠垂体的蛋白质质量，这些垂体平均总重量约为570毫克。预期可获得60毫克垂体蛋白质，即每10毫克组织可获得1毫克蛋白质。

蛋白浓度通常约为 40 毫克/毫升。此处提供的示例适用于免疫 10 只小鼠。计划每只小鼠注射含有 1 毫克垂体蛋白的乳剂 100 微升，考虑到制备过程中的材料损耗，额外增加 2 只小鼠的用量，因此共制备 12 毫克蛋白乳剂。

首先，通过用手捂热的方式快速解冻冷冻的蛋白分装样品。用 PBS 将蛋白浓度调整至 20 毫克/毫升。接着，用 2.5 毫升 Gas Tite Hamilton 注射器吸取 600 微升垂体蛋白提取物（相当于 12 毫克蛋白），然后手动振荡重悬，加入含有 5 毫克/毫升热灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂（CFA）。

然后用另一支2.5毫升Hamilton注射器吸取600微升CFA。将一根22号微乳化针头连接并固定到装有CFA的注射器上。缓慢推动推杆，使针头内充满CFA。

然后将针头的另一端连接并固定到另一个装有垂体蛋白提取物的注射器上。避免在注射器内产生气泡。缓慢推动完全弗氏佐剂（CFA）注射器的活塞，将油相成分推入水相垂体提取物中，仅使少量混合。

然后将垂体提取物注射器的活塞推入CFA注射器中。重复此操作，逐渐增加混合物的量，直至完全混合。这种呈乳白色且均匀分布的物质即为水包油乳剂。

乳液形成后，在最后一次循环结束后，需至少重复完整的来回循环500次。循环完成后，注射器中将含有等体积的水和油乳液，其中垂体蛋白浓度为10毫克/毫升。乳液现已准备好，可通过取一滴乳液滴入盛水的烧杯中来检测其质量。如果乳液制备正确，液滴将在水面保持紧凑且不散开。

如果乳剂质量不佳，将会扩散并分裂成更小的液滴。该乳剂需在其制备当天注射入SJL小鼠体内，以诱导实验性自身免疫性垂体炎。此方案在配套的JoVE视频中已有详细描述。

一旦垂体腺采集完毕且技术已掌握，便可进行蛋白质提取，整个过程需一小时，注意操作要迅速并在冰上进行。在此步骤中，进行浸渍液的制备大约需要一小时。在初始混合阶段及其后续处理过程中，务必缓慢而耐心地操作。

该技术为自身免疫领域的研究人员探索自身反应性淋巴细胞识别并浸润靶器官的机制铺平了道路。观看本视频后，您应充分掌握如何从小鼠垂体中制备蛋白提取物，以及如何将其与完全弗氏佐剂混合以制备可用于免疫原的乳剂。请务必注意，使用注射器和完全弗氏佐剂（其中含有灭活的干结核分枝杆菌）时存在潜在危险，若不慎刺伤自己可能导致意外暴露。

因此，在执行此操作时，务必使用G型防护手套，并妥善处理针头。