Name: 鼠标垂体免疫原的制备诱导实验性自身免疫性垂体炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学习从小鼠垂体组织中分离和制备免疫原蛋白的方法，用于建立实验性自身免疫性垂体炎动物模型。该方案通过组织匀浆、离心纯化和弗氏佐剂乳化，为研究垂体自身免疫疾病机制提供可靠的技术基础。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为DK080351，授予PC。

实验方案
本实验方案的第一步是收集大量小鼠垂体。第二步是将垂体组织匀浆以制备蛋白质提取物。第三步是将这些蛋白质与油性混合物乳化。
步骤1：小鼠垂体的采集与保存
小鼠垂体位于颅底蝶骨凹陷处，该凹陷称为蝶鞍，外侧毗邻三叉神经，前部与视交叉相邻。垂体由较大的前叶以及较小的后叶和中间叶组成，平均重量为1.9 mg。垂体样本取自动物护理机构计划实施安乐死的不同品系、性别和年龄的小鼠。
为分离垂体，先将小鼠处死，解剖颅骨上方的皮肤，并用剪刀剪开颅骨。抬起脑组织以暴露垂体，随后将垂体从周围的硬脑膜分离，从蝶骨中取出，置于塑料管中，并在干冰上保存。
通常，我们使用 300 个小鼠垂体进行一次蛋白质制备，这一数量可由一人在 9 小时内采集完成。
收集完成后，含有垂体的试管应保存在 -80 °C，直至进行下一步操作。 
步骤 2. 小鼠垂体蛋白的提取
<ol>
<li>将匀浆缓冲液加入置于冰浴中的15 ml Falcon离心管（货号352059）中，每收集100个垂体使用250 μL缓冲液。缓冲液的离子强度应与细胞胞质内生理状态相近（0.2 M），pH为生理pH值（7.4）。我们使用磷酸盐缓冲盐水（0.161 M，pH 7.4），并添加蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，货号P8340-1ML）。</li>
<li>在匀浆前将垂体组织加入缓冲液中，然后将Polytron匀浆器的转子（直径5 mm）置于Falcon管底部。在最大转速下匀浆30秒，同时轻轻上下移动Falcon管，保持其处于冰浴中。随后将匀浆液置于冰上静置1分钟。重复匀浆和冷却步骤两次。这种温和的匀浆方式可破碎细胞并释放胞质蛋白，同时不破坏细胞核。</li>
<li>为去除细胞核、未破碎的组织以及不溶性物质（如结缔组织和变性蛋白复合物），在4 °C下以低速（1000g）离心匀浆液10分钟。</li>
<li>将上清液（现称为核后上清液，PNS）小心转移至新的Falcon管中，注意勿扰动沉淀，并将PNS置于冰上保存。</li>
<li>用原始体积的匀浆缓冲液（每100个垂体使用250 μL缓冲液）重悬沉淀，按上述方法进行匀浆和离心，然后将第二次获得的PNS与第一次的合并。</li>
<li>将合并后的两份PNS样品分装至微量离心管中，于-80 °C保存，直至进行下一步实验。该蛋白样品可在-80 °C长期保存，但活性会逐渐下降，因此建议在制备后6个月内使用。取少量分装样品通过BCA法（Pierce，货号23225）测定蛋白产量和浓度，并通过凝胶电泳评估蛋白质量。通常情况下，使用1.5 mL匀浆缓冲液处理300个小鼠垂体可获得约60 mg蛋白，浓度约为40 mg/mL。</li>
</ol>
步骤 3. 制备用于免疫的乳剂
<ol>
<li>迅速解冻实验所需的冷冻蛋白分装样品，并将蛋白浓度调整至 20 mg/mL。该蛋白提取物将按 1:1 比例与完全弗氏佐剂（CFA, Sigma F-5881）乳化，其中含有 5 mg/mL 热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Becton Dickinson, 231141）。每只小鼠将接受含 1 mg 垂体提取物的 100 μL 乳化液。</li>
<li>本示例适用于免疫 10 只小鼠，每只小鼠注射 100 μL 含 1 mg 垂体蛋白的乳化液。为防止制备过程中的材料损耗，额外预留两只小鼠的用量，因此共使用 12 mg 垂体蛋白。使用 2.5 mL Hamilton 气密注射器吸取上述 20 mg/mL 垂体蛋白提取物 600 μL。通过振荡重悬 CFA，再用另一支 2.5 mL Hamilton 注射器吸取 600 μL CFA。将一根 22 号微乳化针头连接并固定到装有 CFA 的注射器上。缓慢推动 CFA 注射器的推杆，使针头充满 CFA，然后将针头的另一端连接并固定到装有垂体蛋白提取物的注射器上。</li>
<li>缓慢推动 CFA 注射器的推杆，将油相组分推入水相垂体蛋白提取物中，仅使少量混合。然后将垂体蛋白提取物注射器的推杆推回至 CFA 注射器中。重复此操作，逐步增加混合量，直至两支注射器中的全部内容物完全混合。最终获得乳白色、均匀分布的溶液，即为水包油乳化液。</li>
<li>乳化液形成后，继续来回推动推杆至少 500 次，以确保乳化充分。完成最后一次混合循环后，1:1 的水包油乳化液即可使用，其中垂体蛋白浓度为 10 mg/mL。该乳化液需在同一天皮下注射至麻醉的 SJL 小鼠体内，具体操作详见配套的 JoVE 文章。</li>
</ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

尽管首例自身免疫性垂体炎患者于1962年被报道4，但致病性的垂体自身抗原仍有待鉴定5。动物模型对于鉴定这些自身抗原非常有用，有助于发现可转化为临床应用的生物标志物。本文展示了一种制备垂体蛋白的简便方法，所获得的蛋白形式足以在实验动物中诱导自身免疫性垂体炎。

<table><tbody><tr><td>15 毫升 Falcon 管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>匀浆缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron 匀浆器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 法</td><td>Pierce，Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;rsquo;完全弗氏佐剂（CFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>结核分枝杆菌</td><td>BD 生物科学</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL Hamilton 气密注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 号微乳化针头</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠垂体免疫原的制备用于诱导实验性自身免疫性垂体炎

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

自身免疫性垂体炎是一种由自身免疫反应引起或伴随自身免疫反应发生的垂体慢性炎症1。传统上被认为是一种罕见疾病，但近年来报道病例显著增加。事实上，垂体炎常作为使用抗体治疗癌症患者时的一种“副作用”出现，这些抗体用于阻断T淋巴细胞表面表达的抑制性受体，例如CTLA-42和PD-1受体。实验性自身免疫性垂体炎可通过将小鼠垂体蛋白与佐剂混合后注射小鼠而诱导产生3。在本视频文章中，我们演示了如何从小鼠垂体腺中提取蛋白质，并将其制备成适用于在SJL小鼠中诱导自身免疫性垂体炎的形式。

通过注射小鼠垂体蛋白提取物，可在小鼠中复制自身免疫性垂体炎。

自身免疫性垂体炎是一种由自身免疫反应引起或伴随自身免疫反应的垂体慢性炎症1。传统上，它被认为是一种……

自身免疫性垂体炎的特征是垂体腺增大以及一种或多种垂体激素缺乏。其致病性自身抗原仍不明确。本文展示了一种制备小鼠垂体腺蛋白的实验方案，可用于该疾病的研究。首先从安乐死的小鼠中分离出垂体。然后将垂体进行匀浆处理，以机械方式破碎细胞并释放胞质蛋白。通过低速离心澄清匀浆液，并采用比色法BCA检测定量，同时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳评估其质量。最后，将水相蛋白质匀浆与油性佐剂混合。然后将该混合物注射到小鼠体内，以建立类似于自身免疫性垂体炎的小鼠模型。如配套视频所示，已有四种技术被用于在实验动物中诱导垂体炎。本文介绍的技术是将垂体蛋白混合物与流感佐剂联合注射，这是最早的一种方法，可追溯至20世纪60年代。其他方法包括：1992年注射风疹病毒的可溶性糖蛋白，2002年通过立体定位技术将腺病毒直接注射至垂体腺，以及2010年将一种大鼠品系的垂体腺移植到另一大鼠品系的肾包膜下。Florence佐剂方法的主要优势在于，该方法如今更具微创性，结果更稳定，尤其能够更准确地诱导出与人类疾病高度相似的动物模型。尽管自20世纪60年代以来已有报道，但使用外来佐剂技术诱导垂体炎的效果一直不佳。当我刚开始攻读博士学位时，采用已发表的外来佐剂方案仅能获得较轻微的垂体炎发生率和严重程度。当我想到将乳化剂中所含垂体蛋白的量增加十倍时，情况便有了显著改善。尽管该方法可为自身免疫性垂体炎的发病机制提供见解，但也可用于研究其他尚未明确自身抗原的自身免疫性疾病。通常，初次接触该方法的研究人员主要会在最后一步——边缘制备上遇到困难，因为该步骤需要熟练的手工操作、时间和专注投入。因此，直观的演示对于理解如何正确制备乳剂至关重要。该技术的意义不仅限于自身免疫领域。掌握如何制备用于免疫的抗原，还可应用于单克隆抗体的生产或新型疫苗的测试。本次演示该技术的是我实验室的 S Zoo heroic Ura 和 Mayland al gato。小鼠垂体是一个圆柱形的腺体，位于颅底蝶骨的一个凹陷处，该凹陷称为蝶鞍。该腺体外侧毗邻三叉神经，前方毗邻视神经交叉。垂体由较大的前叶以及较小的中间叶和后叶组成。为分离垂体，使用剪刀将已处死的小鼠断头，然后从头骨后部向前部做平行切口。抬起脑组织并向后翻转，以暴露垂体，垂体呈圆柱状，位于一个等腰三角形结构中：以垂体为底边，三叉神经为两侧边，视交叉为顶点。用闭合的镊子尖端环绕腺体，以撕破周围的脑膜。然后用精细镊子从蝶鞍窝中夹取垂体，并将其放入置于干冰上的塑料管中。一次制备需收集300个鼠垂体。该操作过程总共需要约九个人工小时。采集完成后，将垂体腺置于零下80摄氏度保存，直至需要时取出。将一个15毫升的Falcon管放入冰浴中。向离心管中加入 250 微升匀浆缓冲液。每收集 100 个垂体后，立即将小鼠垂体腺加入缓冲液中。接着将聚顿匀浆器（直径为 5 毫米的匀浆头）的探针插入含有小鼠垂体和缓冲液的

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