测试配体裂解肽对白蚁肠道原生动物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）和 体内 （白蚁后肠的显微注射）

本实验的总体目标是证明一种合成的配体能够特异性结合土白蚁肠道中消化纤维素的原生动物，并且该配体与裂解肽偶联后，可在体外厌氧原生动物培养体系中以及通过注射至白蚁后肠的体内条件下杀死这些原生动物。该目标首先通过在厌氧条件下提取工蚁肠道中的原生动物来实现。实验的第二步是体外验证荧光标记的配体与白蚁肠道原生动物的结合能力。

该实验步骤的第三步是证明配体偶联的裂解肽可在体外杀死白蚁肠道原生动物。实验步骤的最后一步是将荧光标记的配体以及配体偶联的裂解肽注入白蚁后肠，以确认其在体内结合并破坏肠道原生动物。通过将原生动物培养物注射至白蚁后肠并结合荧光显微镜观察，我们证明了与裂解肽偶联的配体可在体外和体内有效结合并杀死白蚁肠道原生动物。

与单独使用溶菌肽相比，配体与溶菌肽的结合增强了对原生动物的毒性。尽管这种结合降低了对大肠杆菌等非靶标生物的毒性，很可能是因为配体无法与细菌细胞膜结合，但原生动物的消失会导致白蚁在不到两周内死亡。通过使用LIG结肠肽靶向杀灭地下白蚁肠道中共生原生动物的技术，是开发白蚁防控替代方法的一部分。

由于没有肠道共生体，白蚁对化学物质的依赖性降低，从而导致死亡。我们从白蚁肠道中提取原生动物，以证明配体可结合于原生动物，并且配体裂解肽能够杀死原生动物。原生动物内部的木屑颗粒具有自发荧光，因此，将经荧光标记配体处理的原生动物与未经处理的原生动物进行结果对比非常重要。

为避免出现任何假阳性结果，我们将肽段直接注射到白蚁的后肠中，因为如果通过饲喂方式给予肽段，中肠和前肠中的蛋白酶会将其降解。利用新英格兰生物实验室（New England Bio Labs）的噬菌体展示文库，我们鉴定了19条能够与原生动物结合的肝肽（hep peptide）序列。我们选择了一种配体，其肽段序列与已知的布氏锥虫（Trypanosoma brucei）膜上假定的糖蛋白具有相似性。

多肽合成后，我们采用固相多肽合成法，将合成的多肽通过E-D-A-N-S诺瓦泰克树脂与C端荧光探针偶联，以评估多肽偶联物的溶细胞性能。在此步骤中，我们使用在实验前一天于LSU蛋白质中心预先合成的配体与溶细胞性多肽ate的偶联物。所有实验材料均需使用sigma涂层处理，以防止原生动物或多肽吸附到器皿表面。

均匀涂布一层，并在次日使用前于室温下过夜干燥。在手套箱内准备一个风扇盒，通过干燥剂和D型催化剂堆叠包持续循环室温空气，以降低湿度和氧气水平，持续超过一小时。用持续流动的氮气吹扫手套箱20至30分钟，并在需要时使用额外的氮气维持厌氧条件。

接下来，配制 Traeger U 培养基并将 pH 值调节至 7，通过连接装有 2.5% 氢气、5% 二氧化碳和 92.5% 氮气混合气体管路的 200 微升枪头，在手套箱中对过滤除菌的培养基吹气 1 小时，以去除手套箱中的残余氧气。材料准备就绪后，使用镊子从培养皿中取出一只白蚁工蚁，用镊子夹住白蚁，将其整个身体轻轻浸入盛有 70% 乙醇的烧杯中约 10 秒。为去除表面污染物，将工蚁从乙醇中取出，并在洁净的 Kim 擦纸上干燥约 20 秒。

在手套箱中，准备一个硅化处理的显微镜载玻片，滴加100微升Trager U培养基用于收集白蚁肠道，另准备一管含900微升Trager U培养基的离心管用于收集原生动物。然后在解剖显微镜下，使用一对无菌细头镊子夹住工蚁腹部，再用另一对镊子夹住腹部末端，以45度角轻轻向上或向下拉动，尽量将中肠和后肠完整地以一整段取出。将取出的肠道置于载玻片上100微升Trager U培养基液滴中。

接下来，使用一对无菌精细解剖探针刺穿后肠，释放原生动物，并用200微升移液器轻轻将肠内容物转移至含有900微升Traeger培养基的1毫升微量离心管中。静置5秒钟，使肠壁碎片沉淀，然后将900微升上清液转移至新的离心管中。取10微升原生动物培养物，转移至经sigma涂层处理的显微镜载玻片上。

在显微镜下以200倍放大观察原生动物的状态。在获得原生动物后，立即按照供应商推荐的方法，制备好需氧原生动物、四鞭毛梨形虫、阿米巴原虫、ug、gleaner以及草履虫的对照培养物，同时制备大肠杆菌（e coli）的过夜培养物。随后，用10%甲醛在4°C条件下固定白蚁肠道原生动物及其他原生动物对照和大肠杆菌，固定时间为12小时。然后将原生动物溶液在30×g离心10分钟。

弃去上清液，用一毫升Trager U培养基将含有固定原生动物的沉淀洗涤两次，将沉淀重悬于一毫升Trager培养基中。将固定的微生物与100微升合成配体偶联荧光染料E-D-A-N-S的溶液在37°C孵育一至两小时，配体终浓度为50微摩尔/升，溶于水中。在荧光显微镜下观察经配体处理及未处理的对照样本，放大倍数为400倍，激发光最大吸收波长为341纳米，发射光位于蓝色区域，波长为471纳米。

为评估配体偶联溶菌肽的活性特性，取六份原生动物培养物，每份198微升，按第三节所述方法制备，移入0.5毫升离心管中。向其中一半的原生动物培养物中加入2微升浓度为100微摩尔的配体溶菌肽溶液，使终浓度达到1微摩尔；另一半则加入2微升无菌水作为对照。

一小时后，将每种原生动物培养物各取10微升转移至载玻片上。在200倍显微镜下比较配体偶联裂解肽处理的原生动物与对照组的存活情况。使用NGI PC 10型微电极拉制仪，设置双阶段加热水平来拉制针头。为获得20至30微米的尖端尺寸，需在显微镜下测量以确认尖端大小。

使用显微注射器将约30微升浓度为50微摩尔的荧光标记配体水溶液注入一根针头中。使用连接的注射器将另一根针头装满水作为对照。将显微移液器固定在支架和显微操作器上。将一根针头安装到第二个显微操作器的注射系统支架中。

将初始注射参数设置为约一秒的脉冲时长和10至12 PSI的注射压力。然后缓慢将针头推进微移液管中，通过脚踏开关启动注射。注射完成后取出微移液管，并记录注入溶液的长度。

使用游标卡尺，根据已知的微移液管参数计算注入体积，并调整压力和脉冲时长，以排出 0.3 µL 溶液。接下来，为每种处理准备 20 只白蚁用于注射。首先用软镊子轻轻挤压腹部末端，以清除直肠中存在的任何排泄物。

然后将白蚁工蚁置于冰上冷却5分钟，使其 immobilize（固定不动）。通过剪切100微升移液器吸头来制作用于固定白蚁工蚁的接收器。使用解剖刀片将吸头尖端切割至10至12毫米的长度，并根据白蚁的大小进行调整，然后将其放入小瓶中。

使用带螺纹盖的接收器，将其连接到显微操作器上。将一只工蚁背侧朝下放置于培养皿中，利用氮气抽吸泵将工蚁头部朝前吸入接收器内，使工蚁末端从接收器中露出。小心固定住接收器中的白蚁，通过显微操作器推动装有液体的针头，将其插入工蚁的肛门。注入 0.3 µL 荧光标记的配体或作为对照的水。

将注射了配体或水的工蚁分别放入铺有湿润滤纸的培养皿中，于26摄氏度、78%相对湿度条件下静置过夜。24小时后，解剖取出注射过的白蚁肠道，并按前述方法收集原生动物。利用荧光显微镜观察来自注射白蚁的原生动物中配体的结合情况，以评估配体偶联溶菌肽在活体白蚁中的溶菌特性。

准备注射所需的材料、仪器和白蚁，操作方法与之前进行注射时相同，向20只白蚁工蚁的后肠各注射0.3 µL浓度为500 µmol/L的配体溶菌肽溶液，对照组注射等量水。24小时后，取出若干工蚁的额外肠组织，在显微镜下以200倍放大观察肠内容物，一旦确认处理组白蚁肠内所有原生动物均已死亡，即进行记录。将剩余的处理组和对照组白蚁置于含湿润滤纸的培养皿中，每天观察其死亡率。我们证实，与荧光探针偶联的配体可结合三种原生动物：P. grassi、H. hartmanni 和 S. leptospira。

在四种木白蚁的后肠中，以可检测的密度观察到配体结合发生在原生动物整个细胞表面，并沿轴向集中分布于原生动物前部区域，该区域仍存在一层微管结构以及MP草眼核。我们还在所有受试的自由生活好氧性原生动物物种中检测到荧光信号，表明该配体可结合于原生动物中普遍存在的结构。尽管未观察到大肠杆菌（e coli）存在配体结合现象，但1微摩尔浓度的配体溶菌肽可在10分钟内体外杀死来自人和地下白蚁工蚁肠道内的三种原生动物，同时也可杀死自由生活的茶色梨形虫（tea piriformis），而对照组则保持存活。

该图像显示了用配体溶菌肽处理后，白蚁肠道原生动物细胞膜完整性的逐步丧失。在配体溶菌肽处理组与水处理组之间，大肠杆菌菌落数量未观察到差异；然而，无配体的溶菌肽则显著减少了大肠杆菌菌落数量。这表明将配体连接至溶菌肽在一定程度上可保护非靶标微生物免受裂解。注射0.3 µL浓度为500 µmol/L的配体溶菌肽后，24小时内即杀死了乳白蚁和地下白蚁肠道中的三种原生动物，而当注射配体偶联的溶菌肽后，白蚁在10天后死亡。

与注射非配体偶联的裂解肽的情况相比，原生动物和白蚁的死亡时间提前了三倍，如Husen和Colia 2009年的研究所示，这表明在最佳培养条件下，配体可提高裂解肽对原生动物的杀灭效率。从Omo.地下白蚁肠道中提取的所有三种原生动物物种应至少存活并保持健康三天。

然而，如果培养基中残留有氧气，则原生动物的运动将立即停止。如果使用了错误的培养基，导致细胞内的渗透压过高，原生动物的膜会向外膨胀，最终导致原生动物破裂。如果细胞内的渗透压过低或膜结构受损，则原生动物会皱缩并萎缩。固定原生动物有助于检测荧光标记配体与原生动物的结合情况。

当原生动物自由移动时，很难检测其荧光并将其与木屑颗粒的自发荧光区分开来。一旦掌握该技术，在助手的协助下，每小时大约可注射30只白蚁。尽管配体结肠肽是为杀灭地下白蚁肠道中的原生生物共生体而开发的，从而用于白蚁防治，但它也可能有助于开发针对引起人类多种疾病的原生生物寄生虫（如疟疾、肺孢子虫病、结核病和曲霉病）的药物。

观看本视频后，您应能够充分理解如何获取并培养从白蚁肠道中提取的原生动物，如何通过荧光显微镜显示配体与原生动物的特异性结合，如何在体外展示配体结肠肽的原虫自杀作用，以及最后但同样重要的是，如何将肽注射到肿瘤时间肠道中以进行体内验证。