Name: 冷预处理神经保护作用的研究策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: 探索冷预处理对大鼠海马脑片培养物中神经免疫信号的影响，以揭示TNF-α和白介素11介导的神经保护机制。该方法为开发麻醉和手术相关脑损伤的预防性治疗策略提供了重要的实验基础。

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本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（NS-19108）、偏头痛研究基金会和怀特基金会向 Richard P. Kraig 提供的资助支持。Marcia P. Kraig 女士协助完成了培养基的配制及脑片培养的维护工作。我们感谢 Yelena Grinberg 对本文最终版本提出的修改意见和建议。

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

图6和图7展示了与冷预处理神经保护相关的细胞因子信号系统的两个基本重要概念。首先，在正常脑组织中，细胞因子是浓度极低的信号分子。然而，由于细胞因子具有调控基因表达的能力，其生理浓度的微小变化也具有巨大潜力来改变脑的结构与功能（即表型）（图6）。此外，细胞因子具有高度的冗余性和多效性，即多种细胞因子可产生相似效应，而单一细胞因子也可产生多种不同的效应（图7）。因此，为了准确确立冷预处理（或其他生理性预处理刺激）神经保护的内在细胞因子基础，必须对相关信号变量进行综合分析。这可通过多重检测策略实现，从而建立冷预处理神经保护的细胞因子“特征谱”。
<img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="标有尺度的猫、水果、城市景观、海岸线、地球和月球的量级对比示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 脑细胞因子信号的强度。 图示展示了生理浓度下脑细胞因子信号能力的巨大程度，相较于其他已被广泛认知的物质具有显著优势。浓度以距离的倒数表示，起始参考点为单根猫的胡须。钠（10-1M，以一粒胡椒表示）和钾（10-3M，以一个番茄表示）在脑间质空间中的浓度分别约为150 mM和3 mM，在神经细胞电生理功能中具有明确的重要作用。同样，pH值（即氢离子浓度约为10-7M，图示为芝加哥湖滨780米的距离）和钙离子（即浓度约为10-8M，图示为从芝加哥大学附近的麦考密克展览中心到海德公园岬角点的卫星图像中7.8 km的距离）也对脑功能调节起关键作用。此外，释放到间质空间中、浓度高于上述物质的神经递质可影响局部脑区的活动。相比之下，细胞因子（图示为地球到火星的距离）在浓度上比上述物质低一千万倍以上时，仍可改变脑功能。
<img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="细胞信号通路示意图；显示免疫应答中的细胞因子相互作用。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 图 7. 固有细胞因子通路的交互式信号传导。 细胞因子具有高度冗余性和多效性，即多种细胞因子可产生相似效应，而单一细胞因子可产生多种不同效应。这种多样性源于配体、受体及磷酸化蛋白水平上发生的复杂交互信号传导。更进一步的复杂性来自于脑组织包含多种不同细胞类型，每种细胞均可发生特异性的固有细胞因子、受体及相关磷酸化蛋白的变化。为便于说明，此处仅展示源自免疫细胞研究的固有细胞因子信号通路。为简化起见，脑组织被描绘为单一细胞（白色轮廓线），显示固有细胞因子（IL-1α 和 IL-1β（本文中记为 IL-1α/β）、TNF-α、IL-6、IFN-γ 及 IL-10）、受体（IL-1R1、TNFR1、IL-6/gp130、IFNγR 和 IL-10R）以及磷酸化蛋白（即激酶 ERK1/2、P38（P38-MAPK）和 JNK）与转录因子（ATF-2、NFκB 和 STAT3）之间的潜在相互作用。例如，TNF-α 通过 TNFR1 激活 JNK、p38-MAPK 和 ERK1/2，进而通过 ATF-2 触发基因表达。TNF-α 还可通过激活 NFκB 直接调节基因表达。这些转录因子的共同激活可诱导如图所示的细胞因子及其受体表达上调（箭头）或下调（钝端）。重要的是，这些通路表明，一种细胞因子（如 TNF-α）的变化会影响其他细胞因子（如 IL-1β）的生成。因此，为准确建立冷适应诱导神经保护作用的细胞因子基础，必须对相关信号变量进行综合分析。这将确立冷适应的固有细胞因子“特征谱”。（图像根据参考文献 #25 的数据汇编而成。）

<table><tbody><tr><td colspan="4">脑片培养的制备</td></tr><tr><td>Millicell-CM 组织培养插入物（30 mm）</td><td></td><td>PICM0-3050</td><td></td></tr><tr><td>基础伊格尔培养基</td><td></td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Earle's 平衡盐溶液</td><td></td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td></td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td></td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td></td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B（Fungizone）</td><td></td><td>15295</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td></td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSL-1 级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯圆盘</td><td></td><td>023-49-310-1</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td></td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>弯头虹膜剪</td><td></td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>长直剪</td><td></td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>长镊子</td><td></td><td>13-812-40</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td></td><td>11808-02</td><td></td></tr><tr><td>短镊子</td><td></td><td>13-812-38</td><td></td></tr><tr><td>#5 不锈钢镊子</td><td></td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>2 把虹膜刮勺</td><td></td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>150 × 15 mm 培养皿</td><td></td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿</td><td></td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Wild M8 体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gey's 平衡盐溶液</td><td></td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray 短波紫外测量仪</td><td></td><td>J-225</td><td></td></tr><tr><td>6 孔 Falcon 培养板</td><td></td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td></td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td></td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Gem21 Neuroplex</td><td></td><td>400-160-010</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 分析仪</td><td></td><td>#2820</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">脑片培养活力的预筛选</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td></td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>DMIBRE 倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">低温预处理</td></tr><tr><td>BSL-2 级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">兴奋性毒性损伤</td></tr><tr><td>CoolSnap &lt;em&gt;fx&lt;/em&gt; CCD 相机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td></td><td>F36915</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 软件</td><td></td><td>v. 7.5.04</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 深度血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-D-天冬氨酸</td><td></td><td>454575</td><td></td></tr><tr><td>SigmaStat 软件</td><td></td><td>v. 3.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">与低温预处理联合使用的共处理</td></tr><tr><td>sTNFR1</td><td></td><td>425-R1-050</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td></td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA 提取</td></tr><tr><td>RNAl&lt;em&gt;ater&lt;/em&gt;</td><td></td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Micro RNEasy 试剂盒</td><td></td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td></td><td>03446-100</td><td></td></tr><tr><td>一次性 1.5 mL 无 RNA 酶研磨杵</td><td></td><td>749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td></td><td>N261A</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td></td><td>T3069</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐水合物）</td><td></td><td>#E7889</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA 定量</td></tr><tr><td>RiboGreen 检测试剂盒</td><td></td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td></td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td></td><td>16155500</td><td></td></tr><tr><td>96 孔荧光检测板</td><td></td><td>DK-4000</td><td></td></tr><tr><td>96 孔荧光酶标仪</td><td></td><td>Safire II</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">定量 PCR</td></tr><tr><td>iScript 反转录试剂盒</td><td></td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td></td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶</td><td></td><td>RNA Ultrasense 11732-927</td><td></td></tr><tr><td>iCycler PCR 仪</td><td></td><td>iCycler 光学模块</td><td></td></tr><tr><td>iCycler 系统软件</td><td></td><td>v. 3.1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">用于微阵列的定量 PCR</td></tr><tr><td>RNase &lt;em&gt;Away&lt;/em&gt;</td><td></td><td>#7000</td><td></td></tr><tr><td>RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 第一链合成试剂盒</td><td></td><td>C-03</td><td></td></tr><tr><td>基于 SYBR Green 的 PCR 混合液</td><td>专用于 iCycler</td><td>PA-011</td><td></td></tr><tr><td>RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Profiler PCR 阵列</td><td></td><td>PARN-011A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">蛋白质组学检测</td></tr><tr><td>细胞裂解试剂盒</td><td></td><td>171-304011</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td>Micro 7</td><td></td></tr><tr><td>BSA 蛋白标准品</td><td></td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td></td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Immuno 96 微孔板</td><td></td><td>449824</td><td></td></tr><tr><td>封板膜</td><td></td><td>2239444</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板读板仪</td><td></td><td>1420-mulilabel counter</td><td></td></tr><tr><td>Bioplex 大鼠 TNF-&amp;#945; 细胞因子检测试剂盒</td><td></td><td>X0000001T</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">免疫染色</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td></td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸</td><td></td><td>L-6001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td></td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td></td><td>S-1878</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td></td><td>S-2002</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（30%）</td><td></td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td></td><td>CS 0920</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>染色皿</td><td></td><td>14511</td><td></td></tr><tr><td>平板摇床</td><td></td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>#1 滤纸（185 mm）</td><td></td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺</td><td></td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td></td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td></td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td></td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td></td><td>cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;050 S</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td></td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>细头画笔</td><td></td><td>11806</td><td></td></tr><tr><td>PAP 阻断笔</td><td></td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SFX 信号增强剂</td><td></td><td>A31631</td><td></td></tr><tr><td>ProLong 抗荧光淬灭封片剂</td><td></td><td>P7481</td><td></td></tr></tbody></table>

冷预处理神经保护作用的研究策略

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

神经系统损伤是全身麻醉及相关外科手术中常见的发病率和死亡率原因，而有效的、易于给药且安全的预处理治疗手段有望减轻此类损伤。我们旨在明确介导低温预处理的神经免疫信号通路，以发现新的治疗靶点，从而在脑损伤发生前实现神经保护。低水平的促炎介质信号随时间发生的变化，对于低温预处理所提供的神经保护作用至关重要。该信号模式符合生理学适应性兴奋效应（hormesis）的基本原理，即刺激性刺激必须达到一定强度，并持续足够长的时间以诱导机体产生适应性反应，才能显现出保护作用。
因此，明确冷预处理神经保护作用中所涉及的免疫信号通路，需要具备高度可重复性和高灵敏度的生物系统、实验操作及技术手段。我们的方法是采用海马脑片培养作为实验模型 体外 模型，该模型紧密反映了他们的 体内 受成熟且静息态的巨胶质细胞/小胶质细胞影响的多突触神经网络的对应结构。这种胶质细胞状态对小胶质细胞尤为重要，因为它们是细胞因子的主要来源，而细胞因子的作用浓度可达飞摩尔（femtomolar）范围。此外，脑片培养可被长期维持。 体外 数周时间足以诱发激活刺激并评估适应性反应。最后，利用脑片培养可精确控制环境条件，从而测量、模拟和调节低温预处理的细胞因子信号，以解析其中的关键节点。细胞因子信号系统的分析需要采用灵敏且可重复的多重技术。我们首先使用定量PCR检测TNF-α，以筛查小胶质细胞的激活状态，随后通过定量实时qPCR阵列筛查评估全组织范围内的细胞因子变化。后者是一种同时测量多种细胞因子系统信号变化的最灵敏且可重复的方法。显著变化需通过靶向qPCR进一步验证，随后进行蛋白质检测。我们采用基于Luminex技术的多重微球流式细胞术检测组织中细胞因子蛋白水平的变化。通过双标免疫组织化学确定特定细胞的细胞因子产生情况。综上所述，该脑组织制备方法及其应用方式，结合建议的研究策略，可能是识别潜在治疗靶点的最优途径，以开发可模拟低温预处理优势的新型治疗手段。

我们旨在阐明介导冷适应性神经免疫信号传导的机制，以期发现新的治疗靶点，从而在脑损伤发生前对其进行保护。本文介绍了开展此类研究的策略，这些策略需要具备生物系统、实验操作以及高度可重复且灵敏的技术手段。

神经系统损伤是全身麻醉及相关外科手术中常见的发病率和死亡率原因，可通过……加以缓解

神经系统损伤是全身麻醉导致发病率和死亡率的常见原因。本视频所展示工作的目标是研究低温预处理对大鼠神经免疫信号通路的影响，以期在损伤发生前发现保护大脑的新型治疗靶点。该目标通过制备健康且存活时间长的成年大鼠海马脑片培养模型来实现。通过低温预处理使培养物暴露于冷刺激，以诱导基于免疫的神经保护作用。随后加入anci毒素，并对脑片培养物进行成像。图像分析表明，低温预处理可显著降低选择性神经元丢失的程度。我的名字是 Richard Craig，这位是 Heidi Mitchell。我们来自芝加哥大学神经病学系，今天将向您介绍如何利用脑片培养制备方法来研究低水平促炎性免疫信号在增强大脑抵抗脑部疾病能力方面的作用。通常来说，初次接触该技术的研究人员会面临一定困难，主要原因在于需要确保培养物的长期存活率以及健康的培养状态，以使其能够呈现出低水平的促炎性免疫信号反应。接下来，Heidi 将向您展示我们在实验室中采用的多种方法，以克服这些困难，从而检测低水平的促炎性信号，作为研发脑部神经保护剂的手段。进行以下实验时，应穿戴洁净的实验服，并将无菌手套套在实验服的袖子外。首先，将实验所需的所有物品放入生物安全等级一级的超净工作台中，包括 McIlwane 组织切片机、相关的聚四氟乙烯（Teflon）插件、剃刀刀片、手术器械以及用于解剖的培养皿。实验操作应在符合HIPAA标准的正压细胞培养室中进行，该培养室的空气需由自带紫外线空气净化风扇至少提前30分钟净化。在生物安全柜内放置一块解剖用冷板，并将其连接至细胞培养柜附近的水浴装置。将MilliCell小室插入6孔板的每个孔中，每孔加入1.1 mL培养基。将培养皿置于36摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的培养箱中至少20分钟。将新生大鼠幼崽置于加热灯下保持温暖，直至需要使用。通过将幼崽放入100%二氧化碳中进行麻醉。麻醉后，将幼崽浸入100%乙醇中，随后断头，将躯体放入一个100毫米的培养皿中，头部放入另一个培养皿中。接下来，使用弯头虹膜剪在颅骨中线处做一纵向切口，随后在眼睛后方向左、右两侧各做一横向切口以打开颅骨。用角度镊子将覆盖的颅骨剥离，并用解剖铲开始挖取脑组织。用解剖铲切断三叉神经以完全取出脑组织，并将脑放入盛有10毫升无菌冷格氏平衡盐溶液（含葡萄糖）的60毫米培养皿的下半部分中。接下来，使用2号虹膜铲下方的5号IOx镊子，从每个半球中分离出海马，并将其放置在特氟龙圆盘上，用于McIlwain切片机。使用铲子将培养基从脑组织周围推开，用切片厚度设定为350至400微米的切片机，以1毫升移液器快速垂直于海马长轴进行切片。将切割后的新鲜脑片从聚四氟乙烯插件上冲洗下来，放入含有冷灌注BSS溶液的60毫米培养皿上半部分。将脑片置于体视显微镜下进行观察。辨认出齿状回结构完整且颗粒细胞层完好的脑片。接下来，将最大的三片轻轻放置于一个插入物上，每次制备共12片。将插入物放入六孔板中，在36摄氏度下培养，每隔三至四天更换一次培养基，用新鲜且预温的培养基替换旧的培养基。7天后将细胞放回36度的培养箱中。用1.1毫升无血清添加神经基础培养基替换原培养基。在第18天，检测脑片培养物的活力。首先，在六孔培养皿中加入1.1毫升的ox poel。将培养皿放入培养箱中，使其升温至36摄氏度。同时，打开显微镜配备fitzy滤光片的荧光光源，并预热至少20分钟。这将确保光照强度均匀。接下来，使用镊子将切片培养插件放入含氧培养基中孵育10分钟，然后将其转回无SIM培养基中。将培养插件置于显微镜载物台上，并标记方向以筛选不可逆的皮层单侧层损伤。将培养物置于倒置显微镜的无菌表面，在5倍放大倍数下观察，切片保持与预筛时相似的方向。切换至 FIT CX 荧光发射滤光立方。选择在 ca 一个区域中 cytx 阳性细胞少于 30 个的培养物用于低温预处理。在六孔培养板中加入 1.1 毫升无血清培养基，将培养板置于 30°C、含 5% CO₂ 和 95% 湿度的培养箱中，至少平衡培养基 20 分钟。20 分钟后。从培养箱中移除平衡培养基。将带有组织切片的培养插件从正常无血清培养基转移至30°C培养基中，随后将其放入30°C培养箱中继续孵育90分钟。将脑片培养物放回正常的无血清培养基中，在36摄氏度下孵育24小时。通过将培养插件转移至细胞培养基中20分钟，开始对脑片培养物进行实验前筛选。在脑片孵育的同时，打开紫外灯和CCD相机，并使其预热20分钟。如有需要，可通过软件控制使CCD暴露于光线下进行50个循环的清除。然后将10微升荧光素与90微升PBS配制的pepeta溶液滴加至深度为100微米的血细胞计数板上，并将其置于显微镜载物台上。使用软件调节曝光时间，使动态范围达到4,096中的1,000。接下来，将含有冷预处理切片培养物的培养皿置于显微镜下并采集图像。这些图像将用于确定背景荧光水平，该背景值将从损伤切片发出的荧光中扣除。如果冷预处理本身导致细胞损伤，则接下来会观察到荧光增强的细胞。为了检测ExoToxic损伤的影响，将插入物转移至无血清培养基中，该培养基含有20至50微摩尔的MDA，并已预热至36摄氏度，持续至少20分钟。在36摄氏度下孵育60分钟，NMDA在孵育后可模拟神经递质谷氨酸的作用。通过将每个插入物分别在三个独立的60毫米培养皿中浸洗三次，以去除插入物上的NMDA。每个含有10毫升预热至36摄氏度的神经基础培养基。每套360毫米的培养皿中使用的插入式培养小室不得超过三个。洗涤后，将插入式培养小室放入盛有新鲜培养基的托盘中，并放回36摄氏度的培养箱中。24小时后，使用荧光素标准品按照之前的方法对相机进行校准。然后将培养物置于OX培养基中20分钟，之后进行成像。如果损伤后一天的损伤水平较低，可根据需要将实验延长至两到三天，以使用metamorph软件定量损伤程度。在CA1区域周围定义一个感兴趣区域，以测量所选区域在损伤情况下的强度。将损伤图像中的感兴趣区域复制并粘贴到背景图像上。随后，将损伤区域和背景区域的数值输入Excel，并使用统计软件进行分析。定量分析对照组和冷预处理培养物的（分子减去背景）数值，进行适当的统计学检验，以比较实验组与对照组的损伤程度，每次实验运行均应包含对照组。该图像显示了体外培养21天后典型的成熟海马脑片染色结果。绿色显示的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）用于展示主要神经元的细胞构筑。在海马体的CA1区和CA3区可见旁中缝神经元，而左侧所示为齿状回（DG）神经元。高倍镜下显示的CA1区展示了静息态小胶质细胞的分支形态特征。在成熟的脑片培养物中，细胞使用小胶质细胞表面标志物CD11b进行标记。该图展示了低温预处理对神经保护的作用，以及用Cytx Green标记死亡细胞的海马体脑片培养物的结果。左侧的初筛图像显示此处无钙离子相关损伤。顶部显示的是假手术对照组培养物，底部显示的是低温预处理培养物。中间一行图像显示了脑片培养物在暴露于20微摩尔NMDA后24小时的相对损伤情况。请注意，假手术对照组的损伤程度高于接受冷预处理（标记为 cp）的培养物。左上角图像显示了相对损伤程度的颜色校准标尺。传统上，随后将培养物暴露于最大程度的损伤条件下，例如 20 微摩尔 MDA 过夜，以最大化 CA1 神经元损伤水平，并将冷预处理组与假手术组的相对损伤程度表示为损伤程度与最大损伤程度的比值。然而，施加最大程度的损伤刺激可能不足以克服预处理带来的神经保护作用。因此，采用损伤程度与最大损伤程度的比值可能无法准确反映预处理所诱导的神经保护效应。右侧图像清晰表明，冷预处理组的最大损伤水平低于假手术对照组。本研究发现，使用损伤与最大损伤比值的方法可能会掩盖低温预处理带来的神经保护作用。这一点可以从示意图中看出：假手术组的损伤程度用红色表示，而低温预处理组在NMDA暴露后一天的损伤程度用蓝色表示；结果显示，低温预处理后的损伤水平为3，而假手术对照组为5，表明存在40%的神经保护作用。然而，如果采用传统格式，使用损伤程度与最大损伤程度的比值等指标，则无法观察到明显的保护作用。换句话说，假手术组为50%，低温预处理组也为50%。定量PCR使用此处所示的mRNA样本进行。蓝色线条代表冷预处理后TNF alpha的水平，高于由绿色、黄色和紫色线条代表的对照组。这表明冷预处理可触发脑内TNF alpha的生成增加。为验证定量PCR及定量PCR阵列结果，进行了免疫染色。该脑片培养样本经处理以显示红色的白细胞介素11，以及绿色标记的神经元。请注意，一些由箭头指示的旁中位神经元显示出白细胞介素11和新生末端染色，呈黄色。箭头所指的还有一些较小的细胞，推测为星形胶质细胞，仅显示白细胞介素11染色增强。在界定寒冷预处理神经保护作用所涉及的细胞因子信号系统时，需注意几个基本的重要概念。尽管细胞因子在正常脑组织中的浓度极低，但其浓度的微小变化即可改变基因表达。因此，即使在低浓度下，细胞因子也具有巨大潜力来改变脑的结构与功能，从而影响生物体的表型。这一概念在此通过距离的倒数来表示，以猫的胡须作为参考点，将钠、钾、pH 和钙与 TNF alpha 进行比较。还需要注意的是，细胞因子具有高度的冗余性和多效性：多种细胞因子可产生相似的作用，而单一种细胞因子则可能具有多种不同的效应。因此，为了准确确立冷预处理神经保护作用的先天性细胞因子基础，必须对相关信号分子进行综合分析。这可通过多重检测技术实现，从而确定冷预处理介导神经保护的细胞因子特征谱。一旦掌握该技术，这些细胞培养物可在约三小时内完成制备，并可用于后续实验操作与研究。冷预处理的反应可在大约三天内完成。在进行这些操作时，必须牢记无菌技术和尽量减少操作是必要的，以保持在这些操作后检测低水平促炎信号的能力。其他方法，如蛋白质组学和分子生物学分析，也可应用于这些培养物，以阐明冷预处理对脑组织产生营养和保护作用的机制。

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科研

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神经科学

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。...

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

来源：Zheng, Y., 等．研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型．J. Vis. Exp.

评估酸性后处理在脑缺血小鼠模型中的神经保护作用

来源：Poinsatte, K., et al., 小鼠重复性缺氧预处理及短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的定量分析。J. Vis. Exp.

小鼠神经元对重复性缺氧预处理的适应性

来源：Brandli, A. 远隔肢体缺血预处理：一种在啮齿类动物中的神经保护技术。J. Vis. Exp.

大鼠模型中用于神经保护的非侵入性肢体缺血预处理

远程缺血预处理（RIP）是一种使组织耐受损伤性应激的保护方法。我们已建立了一种通过充气血压计袖带5-10分钟对后肢实施远程缺血的方法。在啮齿类动物视网膜变性模型中，已证实RIP具有神经保护作用。...

远程缺血预处理：一种在啮齿类动物中的神经保护技术

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO2 大脑中动脉闭塞后 体内.

研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

在自然环境中需要四肢精细协调的复杂运动涉及顶叶皮层的多个区域。以下方案描述了利用可逆性冷却诱导失活技术，以证明顶叶第5区在行走猫的记忆引导下避障行为中的作用。...

可逆性降温失活法研究行走猫大脑皮层对障碍物记忆的贡献

不同深度低温对心肌保护作用的差异尚未得到充分评估。本研究旨在利用基于人源心肌细胞的模型，定量分析不同低温处理后细胞死亡水平，为后续深入的分子机制研究奠定基础。...

体外评估低温预处理对人心肌细胞模型的心肌保护作用

本文介绍了两种在大鼠中进行全身短时低温诱导的方法。第一种为快速诱导法，采用风扇和乙醇喷雾进行主动降温，以实现体温的迅速下降。第二种方法为逐步降温法，通过联合使用异氟烷麻醉和降低恒温加热垫的温度设定，实现核心体温的逐步下降，无需使用任何外部降温设备。...

使用大鼠模型研究短时低温诱导的临床相关性与机制

探索冷预处理对大鼠海马脑片培养物中神经免疫信号的影响，以揭示TNF-α和白介素11介导的神经保护机制。该方法为开发麻醉和手术相关脑损伤的预防性治疗策略提供了重要的实验基础。

冷预处理神经保护作用的研究策略

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