角膜共聚焦显微镜：一种用于量化周围神经病变中小纤维病理变化的新型无创技术

本视频演示了一种利用角膜共聚焦显微镜（CCM）这一非侵入性技术对角膜C纤维进行成像的方法，从而实现对神经纤维损伤的定量分析。首先，调整CCM镜头的焦平面，并在安装一次性镜头帽之前将黏弹性泪液凝胶涂抹于镜头表面。随后，将麻醉滴眼液和黏弹性泪液凝胶滴加至眼部。

接下来，调整相机位置，使镜头前端的凝胶与患者的角膜接触。最后，调节焦平面深度，获取角膜鲍曼层中央区域的角膜神经图像。通过观察角膜神经纤维的形态学变化，可对神经病变进行量化评估。

这项技术非常新颖，此前已在视光学和眼科学领域得到应用。在过去的八年左右，我们已非常有效地将其用于研究和评估糖尿病性神经病变及其他周围神经病变。该技术的主要优势在于，它能够以完全无创的方式，在非常早期的阶段量化小纤维损伤，并对患者神经病变的严重程度进行分层评估。我们仅需两分钟的扫描即可快速完成检测，随后可对神经病变的严重程度进行量化。因此，我们希望该技术能够取代一些其他更具侵入性的检测方法，例如皮肤活检和神经活检。尽管该技术整体看似简单，但实际上需要遵循明确的步骤，以实现图像的最佳采集和准确量化。

我们真正希望的是让其他任何希望使用该技术的人能够清楚明了地了解整个过程。使用HRT角膜共聚焦显微镜进行检查的初始步骤，是在激光扫描相机的物镜管上准备物镜尖端。将屈光度设置为+12屈光度，然后将相机调至最低位置，并通过逆时针旋转锁定镜头。

在镜头尖端滴加一滴较大、均匀且无气泡的P尺寸黏性人工泪液。从无菌容器中取出一个Tomo帽，将其尽可能深地安装到镜头尖端上方的支架上，使凝胶在物镜与Tomo帽之间形成弯月面。安装过程中注意不要触碰Tomo帽的前表面。

现在，将激光扫描相机在相机支架上尽可能向后移动，以对准断层扫描帽的内表面和外表面。在显示监视器上，两者均呈现为明亮的激光反射。调节焦平面调节旋钮，直至观察到明亮的反射，表明镜头已聚焦在帽的前部区域内。

焦点位置显示中的深度值现在应介于负150微米至正150微米之间。将深度设置重置为零。现在让我们看看如何准备患者。

使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液麻醉受试者眼部后，用润眼液润滑眼球前部。让受试者舒适地将下巴置于下巴托上，并确保其前额紧贴额带。指导患者注视外部固视灯，有助于更顺利地进行检查。

在不检查的眼睛一侧，显微镜头部的小巧尺寸确保受试者的对侧眼不会被遮挡，从而能够使用远距离目标。将CCD相机定位，使其光学通路与激光扫描相机的光学通路垂直。

成像右眼时，相机应位于患者的右侧，反之亦然。在此位置，断层扫描帽的前表面位于CCD相机的中心。实时图像。

将激光扫描相机向患者移动，直至患者的角膜与tomo帽之间的距离约为5到10毫米。然后使用相机支架上的垂直和水平调节旋钮，上下左右移动激光扫描相机，直到tomo帽位于患者角膜中心。现在请患者尽可能睁大眼睛。

缓慢移动激光扫描相机，使其逐渐靠近患者，直至断层扫描帽接触患者的角膜。此时应检查红色激光光点是否位于角膜中心，并确认激光束在角膜表面的反射点恰好位于角膜前极。在最佳调节状态下，镜头与角膜之间仅有轻微接触。

在CCD相机的实时图像上，可见体帽与角膜之间存在一层薄薄的凝胶桥。如果体帽与角膜之间的压力过大，则通过CCD相机会观察到角膜呈现扁平状。实时图像和散射现象会出现在共聚焦显微镜（CCM）图像中。

调整患者位置后，打开HR三激光相机，屏幕上将出现图像采集窗口。使用CCD图像将断层扫描帽和激光光束定位在患者的角膜上。CCM具有三种图像采集选项。

序列扫描可获取多达100幅图像，并可调节帧率。选择每秒30帧至1帧之间的帧率。根据此设置，可获取时长为3至100秒的视频。

在体积扫描模式下，相机会自动连续获取40个不同焦平面的图像。可扫描的总深度为85微米，相邻两幅图像之间的焦距距离约为2.1微米。最后一种选项是切片模式，本实验将采用此模式。

该模式可在每次踩下脚踏开关时获取并存储清晰的单幅图像，从而实现最佳成像效果。此模式用于采集角膜全层的图像，包括角膜中央的前弹力层（Bowman层）。在获取足够数量的图像后，可切换至其他模式，如序列模式和体层模式。

经过几次扫描后，可通过将上皮细胞层调至焦点，然后单击复位按钮将深度值设为零，从而改变镜头的焦平面，以测量角膜细胞层相对于角膜表面的深度。检查完成后，单击采集窗口中的相机电源按钮关闭相机。应告知患者在局部麻醉作用消退之前不要揉眼睛。

从相机上取下断层扫描帽并丢弃，然后用蒸馏水润湿的棉签清洁显微镜镜头。接下来，我们学习如何分析图像并量化神经纤维参数，以复查和分析现有的检查结果。首先，在数据库窗口中选择相应的患者记录。

图像浏览窗口提供了所选患者现有角膜检查的概览。在不同日期进行的检查分别存储在不同的就诊标签页中。三种不同的扫描类型由三个不同的图标表示。在海德堡眼科浏览器的图像浏览窗口中，HRT 三次角膜检查位于就诊标签页中。

为查看角膜图像，双击相应的图像图标，然后按“立即显示”以导出用于进一步分析的图像。点击工具栏上的“导出”按钮，然后选择保存图像的文件夹。由于本研究主要关注鲍曼层及角膜神经，因此仅分析来自该层的图像。对每位受试者，在角膜不同深度选取5至6帧鲍曼层图像进行分析。

图像分析采用本课题组开发的专用软件 CCM Image Analysis Tools（版本 0.64）进行。角膜神经的主要参数由该软件测量，其中神经纤维密度定义为每帧图像中主神经的数量，神经分支密度则为每帧图像中主分支的总数。

神经纤维长度是指每帧神经纤维中主神经及其主要分支的总长度。迂曲度是指每帧中主神经的迂曲程度。要打开CCM图像，请进入文件，然后选择打开。

图像加载后，其大小和类型将显示在控制面板左上角的图像信息框中，图像信息的编辑栏中会显示默认的比例尺。如果比例尺不同，请修改编辑栏中的数值。要开始分析图像，请从控制面板右上角的度量框中选择要测量的参数。

在页面底部的结果框中，NFD 和 MBD 以实际数值显示，NFL 以毫米表示，迂曲度以迂曲系数表示。结果可导出至 Excel 表格。

打开 Excel 页面后，NFD 和 MBD 的结果将以每平方毫米内的数量和每平方毫米内的毫米数表示，NFL 的结果以每平方毫米内的毫米数表示，NFT 的结果以扭曲系数表示。要进行这些测量，请首先标记每条主要神经，然后标记每条主要神经分支，最后逐帧追踪每条神经。

可使用数字笔以提高准确性。一旦掌握，若正确操作，此技术可在一分钟内完成。遵循详细的说明至关重要。

观看本视频后，我们希望您能够充分理解如何利用角膜共聚焦显微镜对角膜的神经层进行操作和图像采集，并掌握如何对周围神经病变（尤其是糖尿病性神经病变）患者该层的图像进行定量与分析。请务必注意，角膜共聚焦显微镜（CCM）的操作需要专业技能，建议由接受过眼科检查培训的专业人员来实施该操作。