角膜共聚焦显微镜:一种新型的非侵入性技术来量化小纤维病变周围神经病变

该视频演示了使用角膜共聚焦显微镜或 CCM 的非侵入性技术对角膜 C 纤维进行成像的程序，该技术能够量化神经纤维损伤。首先，调整 CCM 上镜片的焦平面，并在安装一次性盖子之前将粘性泪凝胶涂在镜片上。然后将麻醉滴剂和粘稠泪凝胶涂抹在眼睛上。

接下来，调整摄像头以使晶状体前部的凝胶与患者的角膜接触。最后，调整焦平面的深度，并捕获来自 Bowman 层中央部分的角膜神经图像。在量化神经病变时可以观察到角膜神经纤维的形态变化。

这是一项非常新颖的技术，实际上以前曾用于验光和眼科领域，但在过去八年左右的时间里，我们已经非常有效地使用它来研究和评估糖尿病神经病变和其他周围神经病变。这项技术的主要优点是，它允许您在非常早期的阶段量化小纤维损伤，然后完全无创地对患者神经病变的严重程度进行分层，我们可以通过两分钟的扫描非常快速地做到这一点，然后可以根据神经病变的严重程度进行量化，因此我们希望这取代其他一些更具侵入性的技术，例如皮肤活检和神经活检。虽然它总体上看起来是一种简单的技术，但实际上，它需要明确的步骤，通过这些步骤以最佳方式捕获图像，然后量化图像。

实际上，我们想让任何其他可能希望使用这种技术的人都能清楚地看到整个过程。使用 HRT 角膜共聚焦显微镜进行检查的第一步是在激光扫描相机的物镜管处准备物镜尖端。将折射率设置为正 12 屈光度，然后将相机调整到最低位置，并通过逆时针旋转镜头来锁定镜头。

将一大滴均匀的无气泡 P 大小的粘性撕裂液滴在镜片尖端。从无菌容器中取出 tomo 帽，并将其安装在镜套上，尽可能在支架上方，使凝胶在物镜和帽之间形成弯月面。安装时注意不要触摸 Tomo 盖的前表面。

现在，将激光扫描相机尽可能向后移动相机支架上 tomo 帽的内表面和外表面。两者都在显示器上显示为明亮的激光反射。调整焦平面调整轮，直到观察到明亮的反射，这表明镜头聚焦在盖子前部。

对焦位置显示中显示的深度值现在应介于负 150 微米和正 150 微米之间。将深度设置重置为零。现在让我们看看如何为患者做准备。

用 0.4%盐酸盐滴剂麻醉受试者的眼睛后，用粘性泪液润滑眼睛前部。将他们的下巴放在下巴托上，确保他们的前额牢牢地压在前额杆上，舒适地看到被摄体。通过指导患者注视外部固定灯，检查更容易。

在不检查眼睛的情况下，显微镜头的紧凑尺寸可确保被摄体的对侧眼睛不会被遮挡。启用距离目标的使用。放置 CCD 相机，使其光学通道垂直于激光扫描相机的光学通道。

对右眼进行成像时，摄像头应位于患者的右侧，反之亦然。在此位置，可以看到 Tomo Cap 的前表面位于 CCD 相机的中央。实时图像。

将激光扫描相机朝患者移动，直到患者的角膜距离 Tomo 帽约 5 到 10 毫米。然后使用摄像头支架上的垂直和水平访问调节旋钮上下左右移动激光扫描摄像头，直到 tomo 帽位于患者角膜的中心。现在让患者尽可能睁大眼睛。

慢慢将激光扫描相机移向患者，直到 tomo 帽接触患者的角膜。在这个阶段，检查红色激光是否在角膜的中心，以及来自角膜的激光束的反射是否正好发生在角膜的前极。晶状体和角膜之间的接触最小，并进行了最佳调整。

在 CCD 相机实时图像上可以看到 tomo 帽和角膜之间的薄凝胶桥。如果 tomo 帽和角膜之间的压力过大，则通过 CCD 相机，角膜会出现扁平的外观。实时图像和 strayer 显示在 CCM 图像上。

调整患者开启 HR Three 激光摄像头后，屏幕上会出现图像采集窗口。使用 CCD 图像将 Tomo 帽和激光定位在患者的角膜上。CCM 有三个用于捕获图像的选项。

序列扫描允许以可调节的帧速率采集多达 100 张图像。选择介于 30 到 1 帧/秒之间的帧速率。基于此，可以获取持续时间为 3 到 100 秒的电影。

在体扫描模式下，相机会在连续的焦平面上自动采集一系列 40 张图像。可以扫描的总深度为 85 微米，两个连续图像之间的焦距约为 2.1 微米。最后一个选项是 section 模式，它将用于此实验。

此模式可通过每次按下脚踏开关时获取并存储清晰的单个图像实现最佳成像。此模式用于从整个角膜层捕获图像，包括角膜中心的 Bowman 层。捕获足够数量的图像后，可以使用其他模式，包括序列和体积。

经过几次扫描后，可以通过聚焦上皮细胞层，然后单击重置按钮将深度值设置为零，从而更改晶状体的焦平面以测量角膜细胞层相对于角膜表面的深度。检查完成后，通过单击采集窗口中的相机电源按钮关闭相机。让患者意识到，在局部麻醉消失之前，他或她不应该揉眼睛。

从相机上取下 tomo 帽，将其丢弃，然后用蘸有蒸馏水的棉签清洁显微镜镜头。现在让我们看看如何分析图像和量化神经纤维参数，以回顾和分析现有的检查。首先，在数据库窗口中选择适当的患者记录。

图像查看窗口提供了所选患者现有角膜检查的概览 在不同日期进行的检查存储在单独的访问选项卡中。三种不同的扫描类型由三个不同的图标表示。在 Heidelberg Eye Explorer 图像查看窗口的 HRT 三个角膜访问选项卡中。

要检查角膜图像，请双击相应的图像图标，然后按立即显示以导出适当的图像以供进一步分析，单击工具栏上的导出，然后选择要将图像保存到的文件夹。因为这项研究的主要重点是 Bowman 层和角膜神经，所以只会分析来自该层的图像。在角膜的不同深度为每个主体选择 Bowman 图层中的 5 到 6 帧。

图像分析是使用我们小组开发的名为 CCM Image Analysis Tools 版本 0.64 的专用软件进行的。角膜神经的主要参数是用软件神经纤维密度测量的，该软件神经纤维密度定义为每帧主要神经的数量。神经分支密度 是每帧主分支的总数。

神经纤维长度是每帧神经纤维的主神经和主分支的总长度。迂曲是每帧主要神经的迂曲。要打开 CCM 映像，请转到该文件，然后打开。

加载图像后，其大小和类型将显示在控制面板左上角的图像信息框中，默认比例显示在图像信息的编辑行中。如果比例不同，请修改编辑行中的数字。要开始分析图像，请从控制面板右上角的公制框中选择要测量的参数。

在页面底部的结果框中，NFD 和 MBD 显示为实际数字。NFL 以毫米表示，曲折度表示为曲折系数。结果可以导出到 Excel 工作表中。

当您打开 Excel 页面时，结果将以 NFD 的每平方毫米数和 NFL 的 MBD 每平方毫米数和 NFT 的曲折系数显示。要进行这些测量，首先要标记每条主神经，然后标记每个主要神经分支。最后，追踪框架中的每条神经。

可以使用数字笔来提高准确性。一旦掌握了，如果在尝试此过程时正确执行了此技术，则可以在一分钟内完成此技术。按照详细的说明进行作很重要。

看完这个视频，我们希望你对如何使用角膜共聚焦显微镜从角膜的运动层工作和捕获图像有一个很好的理解，并在周围神经病变，特别是糖尿病神经病变患者中量化和分析来自该层的图像。并且不要忘记，使用 CCM 需要专业知识，并且建议接受过眼科检查培训的专业人员应进行该程序。