集落形成细胞（CFC）的含量对人体的造血细胞

该程序在半固体培养基中评估造血祖细胞沿不同造血谱系增殖和分化以开始培养的能力。在细胞因子存在下新鲜解冻的 CD 34 阳性细胞，两天后促进活化。通过将活化的 CD 34 阳性细胞添加到预装病毒的板中，对表达 GFP 的测试构建体进行逆转录病毒转导。

48 小时后，通过传真分离 GFP 阳性细胞，然后将这些细胞接种在补充有生长因子的半固体甲基纤维素培养基中，孵育约两周，直到集落出现在表面。最后，收获菌落，使用胞嘧啶将细胞固定在载玻片上，并用右吉萨染色，以显微镜测定造血谱系和成熟阶段。该方法可以为白血病发生的研究提供机制见解，即癌基因对造血分化的影响。

为了看到培养物快速解冻一小瓶冷冻的 CD 34 阳性细胞，在 37 摄氏度下轻轻摇晃直到留下最后一个小冰晶，然后将细胞悬液转移到 50 毫升锥形管中。用 1 毫升室温 2%F-B-S-I-M-D-M 培养基轻轻冲洗小瓶中剩余的细胞，然后滴加到 50 毫升试管中，同时轻轻旋转。现在等待 3 分钟。

继续缓慢加入 2 mL 培养基，同时轻轻混合，然后再次平衡 3 分钟。重复此程序，将等体积的培养基加入稀释的细胞悬液中，间隔 3 分钟，在添加之间轻轻旋转，直到最终体积达到 32 毫升以收集细胞，在室温下以 250 G 离心 10 分钟，然后去除上质，在沉淀上方留下约 0.5 毫升的培养基。将沉淀悬浮在 20 mL 培养基中，并以 200 G 离心 8 分钟，继续洗涤细胞一次在室温下，去除理智物质，并以每毫升大约五十万个细胞的浓度悬浮在 IMDM 完全培养基中。

最后，为了测定细胞浓度，取 10 微升悬浮液放入与相同体积的 0.4% trian blue 溶液混合的微量管中，并计数。使用血细胞计数器，通过添加补充有活化细胞因子培养物混合物的完全 IMDM 培养基，将细胞稀释至每毫升 10 至 5 个细胞，细胞在转导当天在 5% 二氧化碳加湿的 37 摄氏度培养箱中放置两天，在开始病毒预装之前对细胞进行计数，以确定要准备的孔数，以便预处理 24 孔未处理的组织培养板。向每个孔中加入 400 微升每毫升 25 微克的逆肌动蛋白溶液，并在室温下在层流生物安全罩中孵育 2 小时。

去除逆向肌动蛋白溶液，并在室温下孵育 30 分钟，用 2% BSA 对每个孔进行编码。同时，解冻病毒原液并储存在冰上。然后，向每个孔中加入 0.5 mL 病毒制剂，吸出 BSA 溶液加载病毒，并在 4 摄氏度下以 2， 200 G 离心 15 分钟。

从孔中取出病毒溶液，再重复病毒上样 3 次。最后，用冷的 IMDM 培养基冲洗每个孔。现在通过离心收集预活化的 CD 34 阳性细胞，并将细胞重悬于补充有细胞因子的新鲜完全 IMDM 培养基中，将 15 万个 CD 34 阳性细胞分装到每个病毒编码孔、孔中，并在加湿的 37 摄氏度培养箱中用 5% 二氧化碳孵育两天，以便温和但彻底地收获转导的细胞。

细胞悬浮在病毒浮标板中，并通过 50 微米细胞过滤器将悬浮液过滤到锥形管中。将 10 μL 细胞悬液放入微量管中。与等体积的 trian blue 溶液混合，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。

用 0.8 毫升含 0.02% EDTA 的冷 HBSS 冲洗每个孔，并通过 50 微米 CEL Trix 细胞过滤器添加到同一收集管中。通过离心沉淀细胞，并用冷 HBSS 洗涤一次。将最终细胞沉淀重新悬浮在含 1%BA 的 HBSS 中，并将细胞置于冰上避光以进行后续细胞分选，这通常在基于实验设计的高速细胞分选仪核心设施中进行。

解冻所需数量的 CFC 分析培养基等分试样，剧烈涡旋混合，让试管静置至少 5 分钟，让气泡上升到表面，然后再添加细胞。现在将 3000 个病毒转导的分选细胞放入含有冷 2%F-B-S-I-M-D-M 培养基的无菌微管中，并将最终悬浮液体积调节至 0.3 毫升。悬浮细胞，并将整个细胞悬液转移至 3 mL 等分试样的甲基培养生长培养基中。

通过剧烈涡旋制备均匀的细胞悬液。让试管静止 3 分钟。为了接种细胞，将 16 号平头针头连接到 3 毫升注射器上并抽取 2.2 毫升。

注意避免吸收大气泡，将 1.1 毫升各推出到两个 30 毫米未经处理的组织培养皿中，并通过将重复的板与 100 毫米的板和水盘一起旋转来均匀地摊开混合物。继续 3 升无菌水培养两周。在标有评分网格的培养皿中，用倒置显微镜以 40 倍放大倍率对菌落进行表征和评分。

为了记录培养结果，使用常规扫描仪以 600 DPI 扫描整个 CFC 测定板，并使用配备彩色相机的倒置显微镜拍摄代表性菌落的低倍显微照片，以进一步分析来自整个 CFC 测定板的分化和增殖细胞，通过悬浮在几体积的室温 2%F-B-S-I-M-D-M 中洗涤并计数进行形态学分析。将从 CFC 检测板中回收的 30， 000 个细胞转移到载玻片上。使用 STO 离心机，将载玻片风干过夜，以有效地对载玻片进行染色。

按以下顺序设置一个由 9 个染色容器组成的装配线，其中包含溶液。无水甲醇 右 Gemsa 储备液 右 Gemsa 缓冲液，50% 甲醇和水，两个 pH 6 的水磷酸盐缓冲液容器，最后是两个水容器。将玻片放入载玻片托架中，在无水甲醇中浸泡 2 分钟，然后流出过量的甲醇。

立即浸入玻片托架，并加入 Gemsa 储备液 5 分钟。将载体转移到 pH 6.4 的 Gemsa 缓冲液中，孵育 10 分钟。将载体浸入 50% 甲醇中 2 次，在水中浸入 10 次，在下一个水容器中再浸入 10 次，然后在磷酸盐缓冲液中浸入 5 次。

pH 值 6.0。将载体转移到水中并孵育 2 分钟。在最后一个水容器中重复洗涤。

现在让载玻片在载体中完全风干。取下每张载玻片，然后用浸有甲醇的 Kim 湿巾擦拭载玻片的背面以去除污渍。滴入一滴细胞密封 60 和盖玻片进行密封。

使用显微镜对每个 GM 持续载玻片进行 500 个细胞的差异计数。为了本实验的目的，细胞分为五类，原始细胞、中间髓系细胞、成熟髓系细胞、中间红系细胞和成熟红系细胞。例如，与新的 98 只鹰的对照表达相比，9 个癌基因增加了红色红细胞集落的形成。

当在低倍率下观察菌落时，癌基因的这种市场影响很明显。通过 GEM 维持进行的进一步形态学检查提供了有关细胞群谱系和成熟程度的信息。在这个例子中，引入新的 98 Hawks，一个 9 导致红细胞增生细胞数量总体增加，并抑制红细胞和骨髓成熟。

该 SA 通过测量输入细胞制剂在半固体培养基中增殖、分化和形成集落的能力，提供对造血细胞分化的见解。