Name: 集落形成细胞（CFC）的含量对人体的造血细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学习利用集落形成细胞（CFC）实验评估人CD34+造血祖细胞的增殖与分化能力，通过逆转录病毒转导和甲基纤维素培养分析癌基因对造血发育的影响。该方法为白血病发生机制研究提供可靠的体外功能验证手段。

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我们感谢位于密苏里州圣路易斯市的华盛顿大学医学院和巴恩斯-犹太医院的阿尔文·J·西特曼癌症中心的高速细胞分选核心实验室，该实验室提供了流式细胞仪设备及分选服务。本研究由美国国立卫生研究院基金 R01 HL082549 和 K02 HL084179（NRY）资助。西特曼癌症中心的部分支持来自美国国家癌症研究所癌症中心支持基金 P30 CA91842。

1. 试剂的制备
<ol>
<li> 根据制造商说明书，配制无菌的 Fms 相关酪氨酸激酶 3（FLT-3）配体、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、白细胞介素（IL）-3 和 IL-6 的 1000 倍储存液。同时根据制造商说明书配制无菌的 Retronectin 储存液（1 mg/ml）。将上述储存液分装成小份，保存于 -20 °C，避免反复冻融。</li>
<li> 配制含 2% FBS 的 IMDM 溶液。</li>
<li> 配制完全 IMDM 培养基，终浓度为 20% FBS、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素/链霉素（PS）。使用前现加以下细胞因子：100 ng/ml FLT-3 配体、20 ng/ml GM-CSF、100 ng/ml SCF、100 ng/ml TPO、50 ng/ml IL-3 和 100 ng/ml IL-6。</li>
<li> 配制 HBSS（无钙、无镁，不含酚红）中的 1% BSA 溶液，以及 D-PBS（无钙、无镁）中的 2% BSA 溶液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤除菌，4 °C 保存。</li>
<li> 配制 HBSS 中的 0.02% EDTA 溶液，4 °C 保存。</li>
<li> 制备编码目标 DNA 的 GaLV 假型逆转病毒，并分装后于 -80 °C 保存。此步骤不在本文范围内，但其他文献已有描述（1-3）。</li>
</ol>
吉姆萨染色步骤
<ol start="7">
<li> 使用前，将 Wright/Giemsa 染色液连续过滤两次通过 1 μm 将滤纸放入干净的玻璃瓶中。</li>
<li> 使用前立即配制 Wright/Giemsa 缓冲液 pH 6.4，方法是将 50 ml 过滤后的 Wright/Giemsa 染色液与 200 ml 磷酸盐缓冲液（pH 6.4 - Giordano 公式）混合。</li>
<li> 通过将 27.3 g KH₂PO₄ 溶解于水中，配制 pH 6.0 的磷酸盐缓冲液2PO4 和 4.62 g 的 Na2HPO4 在 3.5 L H2O.</li>
<li> 配制50%甲醇水溶液2O.</li>
</ol>

2. 实验步骤
CD34+ 细胞的解冻与预激活
<ol>
<li> 将一管冷冻保存的 CD34+ 细胞在 37 °C 水浴中快速解冻，轻轻摇动直至仅剩少量冰晶，然后将细胞悬液（1 ml）转移至 50 ml 锥形管中。用 1 ml 室温的 2% FBS/IMDM 轻轻冲洗冻存管内残留细胞，并逐滴加入 50 ml 管中，同时轻轻旋转混匀。静置 3 分钟。随后，在轻柔混匀的同时缓慢加入 2 ml 2% FBS/IMDM，再静置 3 分钟。此后每 3 分钟按稀释后细胞悬液体积等量加入 2% FBS/IMDM，每次加入间均轻轻旋转混匀，直至终体积达到 32 ml。</li>
<li> 在室温下以 250 × g 离心 10 分钟，弃上清液，保留约 0.5 ml 沉淀。</li>
<li> 用 20 ml 2% FBS/IMDM 重悬细胞沉淀，在室温下以 200 × g 离心 8 分钟，进行洗涤。</li>
<li> 弃去上清液，将细胞重悬于完全 IMDM 培养基中，浓度约为 0.5 × 106 个细胞/ml。取 10 μl 细胞悬液加入微量离心管中，与等体积的台盼蓝溶液（0.4%）混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
<li> 使用添加细胞因子的完全 IMDM 培养基（参见 1.3）将细胞稀释至 0.1–0.15 × 106 个细胞/ml。</li>
<li> 将细胞置于 37°C、5% CO2 的加湿培养箱中培养 2 天。</li>
</ol>
通过病毒预加载进行逆转录病毒转导
<ol start="7">
<li> 转导当天，在开始病毒预加载前对细胞进行计数，以确定需要准备的孔数。</li>
<li> 将Retronectin储存液稀释至25 μg/ml，并向每孔24孔未处理组织培养板中加入400 μl。在超净生物安全台中室温孵育2小时，进行预包被。</li>
<li> 移除Retronectin溶液，向每孔加入含2% BSA的400 μl D-PBS。室温孵育30分钟。</li>
<li> 解冻病毒储存液并置于冰上保存。吸除BSA溶液，向每孔加入0.5 ml病毒制备液，并在4°C下以2200 × g离心15分钟。</li>
<li> 从孔中移除病毒溶液，并重复步骤2.10所述的病毒加载操作再进行三次。</li>
<li> 用0.5 ml冷的HBSS（含Ca²⁺和Mg²⁺）或IMDM洗涤每孔。</li>
<li> 将预活化的CD34+细胞在室温下以200 × g离心8分钟进行收集。</li>
<li> 在含细胞因子的完全IMDM培养基中，将细胞重悬至每1.5 ml含0.1–0.15 × 106个细胞。</li>
<li> 向每孔加入1.5 ml细胞悬液，在37°C、5% CO2的加湿培养箱中孵育2天。</li>
</ol>
细胞分选与转导细胞的收集
<ol start="16">
<li> 轻柔但充分地重悬上述含有病毒的培养板中的细胞，并通过50 μm CellTrics细胞滤网过滤至一个锥形管中。取10 μl细胞悬液加入微量离心管中，与等体积的台盼蓝溶液混合后，用血细胞计数板进行计数。用0.8 ml冷的0.02% EDTA/HBSS（无钙、镁且不含酚红）冲洗每个孔，并通过50 μm CellTrics细胞滤网加入同一收集管中。</li>
<li> 在4°C下以200 × g离心8分钟，沉淀细胞；再用冷的HBSS（无钙、镁且不含酚红）洗涤沉淀，同样在4°C下以200 × g离心8分钟。</li>
<li> 将细胞沉淀重悬于1% BSA/HBSS（无钙、镁且不含酚红）中，调整细胞浓度至15 × 106/ml，或至少以0.250 ml的最小体积用于细胞分选。将细胞置于冰上并避光保存。准备一个含有冷的20% FBS/IMDM/谷氨酰胺/青霉素-链霉素培养基的收集管，用于收集分选后的细胞。细胞分选在华盛顿大学医学院Alvin J. Siteman癌症中心的高速细胞分选核心设施中进行，使用MoFlo高速分选仪（Dako, Glostrup, Denmark）完成。</li>
</ol>
CFC 实验
<ol start="19">
<li> 解冻所需数量的3 ml CFC检测培养基分装样品。剧烈涡旋振荡以充分混匀，并将离心管静置至少5分钟，使产生的气泡上升至液面，然后再加入细胞。</li>
<li> 为获得每个分选样品的细胞浓度，将分选机构提供的细胞数量除以细胞悬液的近似体积。取3,000个经病毒转导并分选的细胞，加入含有预冷的2% FBS/IMDM的无菌微量离心管中。预先调整2% FBS/IMDM的体积，使最终悬液总体积约为0.3 ml。</li>
<li> 将细胞悬浮，并将全部0.3 ml细胞悬液转移至含有3 ml Methocult GF+ H4435的离心管中，该培养基包含1%甲基纤维素、30% FBS、1% BSA、10-4 M 2-巯基乙醇，2 mM L-谷氨酰胺，50 ng/ml SCF，20 ng/ml GM-CSF，20 ng/ml IL-3，20 ng/ml IL-6，20 ng/ml G-CSF，以及 3 units/ml 促红细胞生成素的 IMDM 培养基。人甲基纤维素富集培养基（R &amp; D系统，包含1.3%甲基纤维素、25%胎牛血清（FBS）、1%牛血清白蛋白（BSA）、5 × 10-5 2-巯基乙醇，2 mM L-谷氨酰胺，50 ng/ml SCF，20 ng/ml GM-CSF，20 ng/ml IL-3，20 ng/ml IL-6，20 ng/ml G-CSF，以及3 units/ml 促红细胞生成素，可加入IMDM培养基中使用。</li>
<li> 剧烈涡旋，使混合液充分上升并下降3-4次。将离心管静置3分钟。</li>
<li> 将16号钝端针头连接至3 ml注射器，抽取2.2 ml液体。避免吸入大气泡；初始时通过推注数次排出气泡。将1.1 ml液体分别推入两个30 mm未处理培养皿中，并通过旋转使混合液均匀铺展。</li>
<li> 将重复的培养皿与一个含有3 ml无菌水的水皿一同放入100 mm培养皿中。培养14–17天。</li>
<li> 使用倒置显微镜在40倍放大下，根据培养皿中标记有计分网格的菌落形态对其进行表征和评分。在本实验中，菌落分为三类：纯红系、髓单核系和混合型。有关菌落进一步亚分类的信息，请参见制造商说明书。</li>
<li> 整个CFC实验板可使用普通扫描仪以600 dpi分辨率进行无放大扫描，也可使用配备彩色相机的倒置显微镜拍摄克隆集落的低倍（40x）显微照片。</li>
<li> 为进一步分析分化与增殖，将整个CFC实验培养板中的细胞用数倍体积的室温2% FBS/IMDM重悬回收。在300 × g离心10分钟之后 4°C，细胞重悬于2% FBS/IMDM中，计数后，或用抗体染色用于流式细胞术，或通过Cytospin离心机转移至载玻片进行吉姆萨染色。</li>
</ol>
抗体染色与流式细胞术
<ol start="28">
<li> 在 4°C 条件下，以 200 × g 离心 8 分钟，沉淀细胞，然后在冰冷的 HBSS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，不含酚红）中重悬，HBSS 中含 50% 正常小鼠血清。</li>
<li> 每管（12 × 75 mm 圆底管）中加入约 5 × 105 个细胞，体积为 80 μl，置于冰上。每管加入抗体混合物（约 20 μl 混合物，无抗体对照管中加入阴性对照溶液），通过轻弹管壁混匀。为每种荧光染料准备无抗体对照管或抗 CD45 抗体对照管。将各管置于冰上避光孵育 20 分钟。孵育 10 分钟后，再次轻弹管壁混匀。孵育结束后，用冰冷的 HBSS 补充管内液体，然后在 4°C 条件下以 200 × g 离心 8 分钟。将沉淀物重悬于冰冷的含 0.5% 多聚甲醛的 HBSS 中。 
以下是我们分析中常用的抗体组合：髓系分化分析使用 CD11b（藻红蛋白标记的克隆 ICRF44）/CD33（别藻蓝蛋白标记的克隆 WM53）/CD45（藻红蛋白-Cy7 标记的克隆 HI30）；红系分化分析使用 CD71（藻红蛋白标记的克隆 M-A712）/CD235a（别藻蓝蛋白标记的克隆 GA-R2）/CD45（藻红蛋白-Cy7 标记的克隆 HI30）。</li>
<li> 流式细胞术在华盛顿大学医学院 Alvin J. Siteman 癌症中心的高速细胞分选核心实验室进行，使用升级为五色双激光的 FACScan 流式细胞仪（BD Biosciences），数据通过 CellQuest（BD Biosciences）或 FlowJO v7.2.4（Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA）软件进行分析。</li>
</ol>
吉姆萨染色
<ol start="31">
<li> 将上述CFC实验板中回收的大约30,000个细胞悬浮于0.3 ml含2% FBS的IMDM培养基中，并使用Cytospin离心机在室温下以1,000 rpm离心10分钟，转移至载玻片上。</li>
<li> 准备九个染色容器，按以下顺序加入溶液：
<ol>
<li> 纯甲醇</li>
<li> Wright/Giemsa储备液</li>
<li> pH 6.4的Wright/Giemsa缓冲液</li>
<li> 含50%甲醇的H2O溶液</li>
<li> H2O</li>
<li> H2O</li>
<li> pH 6.0的磷酸盐缓冲液</li>
<li> H2O</li>
<li> H2O</li>
</ol></li>
<li> 将载玻片放入玻片架中，浸入纯甲醇（#1）中2分钟，然后吸去多余的甲醇。</li>
<li> 立即将玻片架浸入Wright/Giemsa储备液（#2）中，染色5分钟。</li>
<li> 将玻片架转移至pH 6.4的Wright/Giemsa缓冲液（#3）中，孵育10分钟。</li>
<li> 将玻片架在50%甲醇（#4）中浸洗两次，在H2O（#5）中浸洗十次，在另一份H2O（#6）中再浸洗十次，然后在pH 6.0的磷酸盐缓冲液（#7）中浸洗五次。</li>
<li> 将玻片架转移至H2O（#8）中孵育2分钟，随后重复使用H2O（#9）进行一次洗涤。</li>
<li> 让载玻片在玻片架中完全自然晾干。取出每张载玻片，用浸有甲醇的Kimwipe擦拭背面以去除污渍。滴加一滴Cytoseal 60封片剂，并加盖盖玻片进行封固。</li>
<li> 使用Olympus BX51显微镜对每张Giemsa染色的载玻片进行500个细胞的分类计数。细胞分为五类：原始细胞包括原始细胞和早幼粒细胞；中幼髓系细胞包括中幼粒细胞和晚幼粒细胞；成熟髓系细胞包括杆状核细胞、分叶核中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞；中幼红系细胞包括具有中等血红蛋白化的细胞；成熟红系细胞包括具有完全血红蛋白化的细胞。使用Olympus DP71相机配合60倍油镜拍摄显微照片。</li>
</ol>

3.0) 代表性结果：
<ol>
<li>CFC 实验： 在 14–17 天的培养期间，部分输入的细胞群会增殖、分化，并在半固体培养基上形成集落。本实验中，表达 NUP98-HOXA9 癌基因可导致明显的红色集落（红系集落）形成（图 1）(3)。</li>
<li>抗体染色与流式细胞术： 对 CFC 实验培养板中收集的细胞进行流式细胞术免疫表型分析，可提供有关细胞群分化状态的信息。通过联合使用针对特定分化标志物的抗体，可评估细胞的谱系归属及成熟程度。本实验中使用 CD235a 抗体鉴定红系细胞。如图 2A 所示，NUP98-HOXA9 导致 CD235a+ 红系细胞比例增加，但这些细胞 CD235a 表达的荧光强度较对照组减弱，提示红系成熟受到抑制。在图 2B 中，髓系细胞通过其 CD33 阳性进行识别。NUP98-HOXA9 导致 CD33+ 细胞数量减少，同时 CD11b 表达强度降低，符合髓系成熟受抑的表现 (3)。因此，流式细胞术结果表明，NUP98-HOXA9 引起红系增生，并抑制红系和髓系的成熟过程。</li>
<li>吉姆萨染色： 对 CFC 实验培养板中收集的细胞进行形态学检查，可提供有关细胞谱系及成熟程度的信息。形态学得出的结论可能与流式细胞术分析结果不同，因此这两种方法互为补充 (3)。该实验至少重复三次，每次进行 500 个细胞的分类计数，以区分上述五类细胞。这些细胞的示例见图 3。结果经统计制表分析，以确定癌基因转导样本与对照组之间是否存在统计学显著差异。本实验结果显示，NUP98-HOXA9 导致总体细胞数量增加，伴有红系增生以及红系和髓系成熟均受抑制 (3)（未展示）。</li>
</ol>
图注
<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="细胞克隆生长比较，对照组与 NUP98-HOXA9 组，显微镜实验，造血分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：NUP98-HOXA9 对人 CFC 形态的影响。 
将原代人 CD34+ 细胞通过逆转录病毒转导，分别导入对照 MSCV-IRES-GFP 载体或表达 NUP98-HOXA9 的载体，并按 GFP 阳性进行细胞分选。每两个重复培养板中各接种 1000 个细胞进行 CFC 实验，该实验独立重复了 3 至 4 次。图中显示了代表性培养板的无放大图像（左）和代表性红系克隆的低倍显微照片（右）（3）。

<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="流式细胞术分析；CD45、CD235a、CD33、CD11b 标记物示意图；细胞群体比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：流式细胞术显示 NUP98-HOXA9 干扰人原代 CD34+ 细胞的分化。 
（A）红系分化流式细胞术分析：收集集落形成细胞（CFC）培养板中的细胞（见图 1），用 CD45 和 CD235a 抗体进行染色。将 CD235a+ 门控细胞群绘制于直方图中（右图），以显示相对于对照细胞的 CD235a 表达情况。（B）髓系分化流式细胞术分析：收集 CFC 培养板中的细胞，用 CD45 和 CD33 抗体染色。将 CD33+ 门控细胞群绘制于直方图中（右图），以显示 CD11b 的表达水平，并与对照组进行比较。各门控内细胞所占百分比已标出（3）。
<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="细胞形态学比较，NUP98-HOXA9 与对照组，显微镜图像，显示 ME、MM、IM、IE。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：细胞形态学显示 NUP98-HOXA9 与空载对照相比，分化过程受到破坏。 
从 CFC 培养板制备细胞涂片，并用吉姆萨染色。使用 60 倍油镜从代表性视野拍摄显微照片。B：原始细胞；MM：成熟髓系细胞；IM：中间髓系细胞；ME：成熟红系细胞；IE：中间红系细胞（3）。

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

集落形成细胞（CFC）检测已被广泛用于确定造血祖细胞的增殖和分化模式，并研究癌基因的作用（4, 5）。与液体培养相比，CFC检测的优势在于它是一种克隆性检测，每个集落均来源于单个祖细胞，因此可单独挑取集落进行后续分析。CFC检测的局限性在于其无法有效检测更原始的祖细胞或造血干细胞；这类细胞通常通过长期培养起始细胞（LTC-IC）检测来鉴定（6, 7）。本文所述实验表明，与急性髓系白血病（AML）相关的癌基因NUP98-HOXA9可抑制髓系和红系成熟，并导致红系增生（1, 3）。 
 
由于甲基纤维素培养基培养时间相对较长，且集落形成细胞（CFC）培养基中不含抗生素，因此在分选期间及分选后防止细胞培养污染至关重要。任何轻微的细菌或真菌污染都会导致培养体系被完全破坏。流式细胞术分析和细胞形态学判读需要经验积累，建议咨询经过培训的专业人员。应仅使用经过预先筛选、确认适用于人原代髓系祖细胞的胎牛血清（FBS）；我们常规使用的产品已在试剂表中列出。基于甲基纤维素的CFC培养基黏度很高，在操作时需特别小心，确保充分混匀并在倒入培养板前去除气泡。将CFC培养板置于较大的培养皿中，并同时放置盛...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>干细胞技术</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PS）</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FLT-3配体</td><td>PeproTech 公司</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech 公司</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech 公司</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech 公司</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio 公司</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>干细胞技术</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>人源甲基纤维素富集培养基</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>瑞氏-吉姆萨染色</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 6.4 - Giordano 配方</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠血清 </td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD11b 藻红蛋白&amp;#8211;藻红蛋白偶联的</td><td>BD 生物科学</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD33 别藻红蛋白偶联物</td><td>BD 生物科学</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45 藻红蛋白&amp;#8211;rythrin-Cy7-偶联物</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD71藻红蛋白&amp;#8211;藻红蛋白偶联的</td><td>BD 生物科学</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD235a藻红蛋白偶联物</td><td>BD 生物科学</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45 藻红蛋白&amp;#8211;rythrin-Cy7-偶联</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>24孔未处理组织培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 未处理培养皿</td><td>干细胞技术</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>100 毫米细胞培养皿 </td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>网格化评分培养皿</td><td>干细胞技术</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD 生物科学</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD 生物科学</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器 </td><td>干细胞技术</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>16号钝端，1&amp;frac12; 英寸针头 </td><td>干细胞技术</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m CellTrics 细胞滤膜</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>TPX 样品室</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost/Plus 显微镜载玻片，预清洁</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 滤纸卡</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 细胞离心涂片机载玻片夹</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Shandon全自动染色系统100</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>金佰利公司</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m 滤纸</td><td>VWR 国际</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>尼康仪器公司</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>细胞离心涂片</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>Barnstead</td><td>纳米纯钻</td><td></td></tr></tbody></table>

人血液细胞集落形成细胞（cfc）检测

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

人类造血干/祖细胞通常来源于骨髓、脐带血或外周血，用于研究造血过程及白血病的发生。这些细胞具有分化为淋巴细胞系和髓系的能力。集落形成细胞（CFC）实验通过造血祖细胞在半固体培养基中形成集落的能力，来研究其增殖与分化模式。通过固定数量的起始细胞所形成的集落数量和形态，可初步评估祖细胞的增殖与分化潜能。可从单个集落或整块培养板中收集细胞，进一步通过流式细胞术以及吉姆萨染色涂片的形态学评估，分析其细胞数量和分化状态。该实验适用于评估髓系但不适用于淋巴系的分化能力。此处所指的“髓系”采用广义定义，包括粒细胞系、单核细胞系、红细胞系和巨核细胞系。

我们已采用该检测方法评估癌基因对源自外周血的原代人CD34+细胞分化的影响。为此，细胞被转导携带对照逆转录病毒载体或表达目标癌基因（本例中为NUP98-HOXA9）的载体。我们使用一种常用的逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP，其表达一种双顺反子mRNA，可同时产生目标基因和GFP标记物。在逆转录病毒转导前，细胞需在细胞因子存在条件下培养两天以进行预激活。再经过两天后，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP+细胞，并将其与含细胞因子的甲基纤维素半固体培养基混合，孵育至菌落出现在培养基表面，通常为14天。记录菌落的数量和形态。随后从培养板中取出细胞，洗涤、计数，并进行流式细胞术分析和形态学检查。利用针对造血过程中表达的细胞表面标志物的特异性抗体进行流式细胞术分析，可提供有关细胞谱系及成熟阶段的信息。经Wright-Giemsa染色后在显微镜下观察单个细胞的形态学特征，可进一步获得谱系和成熟状态的相关信息。将转导了对照空载体的细胞与转导了癌基因的细胞进行比较，可揭示该癌基因对造血分化的效应。

集落形成细胞（CFC）实验是一种体外实验，其中造血祖细胞在半固体培养基中形成集落。通过集落形态、细胞形态以及流式细胞术相结合的方法，评估祖细胞在不同造血谱系中增殖和分化的能力。

人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

人类造血干细胞/祖细胞通常来源于骨髓、脐血或外周血，用于研究造血作用以及……

该实验通过半固体培养基评估造血祖细胞在培养初期沿不同造血谱系增殖与分化的能力。将新鲜解冻的CD34阳性细胞与促进活化的细胞因子共同孵育两天。通过将活化的CD34阳性细胞加入预先包被病毒的培养板中，进行表达GFP的测试载体的逆转录病毒感染。48小时后，通过流式细胞分选法分离GFP阳性细胞，然后将这些细胞接种于添加了生长因子的半固体甲基纤维素培养基中，培养约两周，直至表面出现细胞集落。最后，收集集落，利用细胞离心涂片法将细胞固定在载玻片上，并用瑞氏-吉姆萨染色法进行染色，以在显微镜下鉴定其造血谱系及成熟阶段。该方法可为白血病发生机制的研究提供重要线索，特别是癌基因对造血分化的影响。为了快速观察培养物，将一管冷冻保存的CD34阳性细胞在37摄氏度下轻轻摇动融化，直至仅剩最后一小块冰晶，随后将细胞悬液转移至一个50毫升的锥形管中。用1毫升室温的2%FBS-IMDM培养基轻轻冲洗冻存管内残留的细胞，并在轻轻旋转锥形管的同时逐滴加入其中。然后静置三分钟。继续缓慢加入2毫升培养基，同时轻轻混匀，并再次平衡3分钟。重复此操作，每隔3分钟加入与稀释后细胞悬液等体积的培养基，期间轻轻涡旋混匀，直至最终体积达到32毫升。收集细胞，于室温下以250 ×g离心10分钟，弃去上清液，保留约0.5毫升培养基在细胞沉淀上方。随后进行一次细胞洗涤：将沉淀重悬于20毫升培养基中，于室温下以200 ×g离心8分钟，弃去上清液，将细胞重悬于完全IMDM培养基中，浓度约为5 × 10⁵ 个细胞/毫升。最后，为确定细胞浓度，取10微升悬浮液加入到含有等体积0.4%台盼蓝溶液的微量离心管中混匀后进行细胞计数。使用血细胞计数板，用完全IMDM培养基将细胞稀释至每毫升含10的5次方个细胞，该培养基需补充细胞活化因子混合液。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的湿润化培养箱中培养两天。在转导当天，开始病毒预加载前对细胞进行计数，以确定所需准备的孔数，从而预先包被一块24孔未经处理的组织培养板。向每个孔中加入400微升浓度为25微克/毫升的RetroNectin溶液，在室温下的层流生物安全柜中孵育两小时。移除反向肌动蛋白溶液，并通过在室温下孵育30分钟，用2% BSA对每个孔进行封闭。同时，将病毒储备液解冻并置于冰上保存。随后吸除BSA溶液，通过向每孔中加入0.5毫升病毒制剂来接种病毒，并在4°C、2,200 ×g条件下离心15分钟。吸出孔中的病毒溶液，重复加病毒步骤三次。最后用冷的IMDM培养基冲洗每个孔。现在通过离心收集预先活化的CD34阳性细胞，并将细胞重悬于新鲜的完全IMDM培养基中，该培养基需添加细胞因子。将0.15百万个CD34阳性细胞分装至各病毒编码的孔中，于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育两天，以温和但充分地收获转导后的细胞。将病毒悬浮培养板中的细胞重悬，并通过50微米细胞滤网过滤至锥形管中。取10微升细胞悬液加入微量离心管中，与等体积的台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。用 0.8 毫升含 0.02% EDTA 的冷 HBSS 冲洗每个孔，并通过 50 微米 CEL Trix 细胞滤器将冲洗液加入同一收集管中。通过离心收集细胞，用冷 HBSS 洗涤一次。将最终的细胞沉淀重悬于含 1% BSA 的 HBSS 中，置于冰上避光保存，用于后续细胞分选；细胞分选通常根据实验设计在高速细胞分选核心设施中进行。解冻所需数量的CFC检测培养基分装样品，剧烈涡旋混匀，并将离心管静置至少五分钟，使气泡上升至表面，然后再加入细胞。取3000个经病毒转导并分选的细胞，加入含有冷的含2% FBS的IMDM培养基的无菌微量离心管中，调整最终悬液体积至0.3毫升。悬浮细胞后，将全部细胞悬液转移至3毫升甲基纤维素培养基分装样品中。通过剧烈涡旋使细胞悬浮液混匀。将离心管静置三分钟。为接种细胞，将一支16号钝头针头连接至3毫升注射器上，并吸取2.2毫升细胞悬液。注意避免吸入大气泡，将1.1毫升混合物分别加入两个30毫米未经处理的组织培养皿中，通过旋转使混合物均匀铺展，将重复的培养皿放入一个100毫米的培养皿中，并同时放置一个盛有水的培养皿。继续培养三升无菌水培养物两周。在标记有计分网格的培养皿中，使用倒置显微镜在40倍放大倍数下，根据菌落形态对其进行表征和评分。为了记录培养结果，使用普通扫描仪以 600 DPI 对整个集落形成细胞（CFC）检测板进行扫描，并使用配备彩色相机的倒置显微镜拍摄代表性集落的低倍照片，以进一步分析分化和增殖情况。将来自整个 CFC 检测板的细胞悬浮于数倍体积的室温 2%F-B-S-I-M-D-M 中，洗涤后进行计数，用于形态学分析。从 CFC 检测板中回收 30,000 个细胞并转移至载玻片上。使用 STOs spin 离心机，在载玻片上空气干燥过夜，以便高效染色。按以下顺序准备九个染色容器组成的流水线，其中分别装有以下溶液：纯甲醇、吉姆萨原液、吉姆萨缓冲液、50%甲醇水溶液、两缸磷酸盐缓冲液（pH 6）以及最后两缸水。将载玻片放入玻片架中，浸入纯甲醇中 2 分钟，然后倾斜以去除多余的甲醇。立即将载玻片架浸入吉姆萨原液中染色5分钟。将载玻片架转移至pH 6.4的吉姆萨缓冲液中，孵育10分钟。将载玻片架在50%甲醇中浸洗2次，水中浸洗10次，再在下一个盛水容器中浸洗10次，最后在磷酸盐缓冲液中浸洗5次。pH 6.0。将载体转移至水中，孵育两分钟。在最后一个盛水容器中重复洗涤。现在让载玻片在载物架中完全自然晾干。取出每张载玻片，用浸有甲醇的Kim擦拭布擦拭载玻片背面，以去除污渍。滴加一滴Cyto Seal 60，并加盖盖玻片进行封片。使用显微镜对每张GM持续培养的玻片进行500个细胞的分类计数。在本实验中，细胞分为五类：原始细胞、中幼髓系细胞、成熟髓系细胞、中幼红系细胞和成熟红系细胞。例如，与对照组相比，新发现的98只鹰中，九个癌基因的表达增加了红系集落的形成。在低倍镜下观察克隆时，癌基因的市场影响显而易见。通过GEM维持进行的进一步形态学检查可提供有关细胞群体谱系及成熟程度的信息。在此示例中，引入新的98 Hawks，一种九型病毒，导致红系增生的细胞总数增加，并抑制了红系和髓系的成熟过程。该半固体培养基中的集落形成实验通过检测输入细胞的增殖、分化及形成集落的能力，为造血细胞分化提供了重要信息。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

集落形成细胞（CFC）的含量对人体的造血细胞

内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。...

成人人类内皮集落形成祖细胞的分离与大规模扩增

内皮集落形成细胞（ECFCs）是一类具有强大克隆增殖潜能的循环内皮细胞，表现出固有的 体内 血管形成能力。对源自脐带血的外向生长型内皮细胞进行表型和功能特征鉴定，对于识别和分离这些细胞至关重要 真正有效的...

人脐带血来源的内皮集落形成细胞的表型与功能特征分析

本视频介绍了基于甲基纤维素的集落形成单位（CFU）实验方案，该方法可用于鉴定和计数白血病细胞在接受抗癌化合物处理后所形成的集落数量。...

基于甲基纤维素的集落形成单位检测：一种评估抗癌化合物对白血病细胞集落形成影响的方法

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本文描述了利用体外和体内遗传学方法以及人源化小鼠模型，对c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点进行遗传学和化学验证的实验方案。该方法可广泛应用于任何靶点的遗传学验证及治疗开发。...

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本文介绍了一种在体外培养的造血干细胞和T细胞中可靠测定线粒体质量与膜电位的方法。...

通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

学习利用集落形成细胞（CFC）实验评估人CD34+造血祖细胞的增殖与分化能力，通过逆转录病毒转导和甲基纤维素培养分析癌基因对造血发育的影响。该方法为白血病发生机制研究提供可靠的体外功能验证手段。

人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

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