Name: 在蚊子（埃及斑蚊）感染引起的表型测定为登革热感染病例的议定书 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: 学习在埃及伊蚊中建立登革病毒感染模型以研究病毒与宿主相互作用的方法。该方案涵盖病毒扩增、血餐感染及中肠病毒滴度测定等关键步骤，为蚊媒病毒学研究提供标准化实验框架。

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A. 在 C6/36 细胞系中增殖病毒。
<ol>
<li>细胞在75 cm2培养瓶中生长至80%融合度；</li>
<li>吸除培养基，保留3–4 ml于培养瓶中；</li>
<li>取0.5 ml病毒原液，加入上述细胞中，感染复数为每个细胞1.5个病毒颗粒。在室温下缓慢摇动培养瓶15分钟。</li>
<li>在5% CO2、37°C条件下孵育45分钟；</li>
<li>加入30 ml培养基，继续孵育5天。</li>
</ol>
B. 准备病毒与血液的混合物
<ol>
<li>用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞及培养基转移至50 mL离心管中；</li>
<li>以800g离心10分钟；收集上清液，但保留约1 mL上清液与细胞沉淀一同留存；</li>
<li>将上述细胞沉淀&nbsp;在干冰CO2中冷冻，随后在37°C水浴中解冻，重复两到三次；</li>
<li>以800g离心10分钟，取上清液，并与步骤3中收集的上清液合并；</li>
<li>采用相同程序（步骤3）采集全人血，用于制备恶性疟原虫配子体培养物，以感染按蚊；</li>
<li>将等体积的上述全人血与步骤4所得病毒上清液混合，并加入人血清（终体积的10%）。</li>
<li>将上述人血与登革病毒的混合物在37°C水浴中孵育30分钟</li>
</ol>
C. 喂食蚊虫
该操作步骤与蚊子中Plasmodium falciparum感染部分所述内容几乎完全相同。我们在饲血后第7天检测中肠感染情况，第14天检测唾液腺感染情况。所有接触过病毒的材料均需先用75%乙醇处理，再用10%次氯酸钠溶液处理。
D. 测定蚊虫组织中的病毒滴度
<ol>
<li>在解剖蚊虫组织前两到三天，将 C6/36 细胞接种于 24 孔板中培养，使细胞在实验当天达到 80% 汇合度；</li>
<li>将蚊虫置于 4°C 下麻醉，处死后用 75% 乙醇浸泡 1 分钟进行体表消毒。随后用无菌水洗涤两次，在解剖显微镜下解剖中肠或唾液腺。从该步骤开始，后续所有操作均需在无菌环境（如生物安全柜）中进行。将这些组织转移至含有 150 µl 培养基的离心管中，使用 Kontes 微型研磨器电动匀浆 90 秒；</li>
<li>取 10 µl 匀浆液加入 990 µl 培养基中，制备 1:100 稀释液；</li>
<li>在 96 孔板中用培养基进一步制备 1:10、1:100 和 1:1000 的系列稀释液；</li>
<li>吸除 24 孔板中的原有培养基，将上述四种稀释液各取 100 µl 分别加入对应孔中；</li>
<li>室温下缓慢振荡 15 分钟，然后在 5% CO2、37°C 条件下孵育 45 分钟；</li>
<li>向每孔加入 1 ml 甲基纤维素覆盖层（1%）；</li>
<li>将培养板置于 37°C、5% CO2 条件下孵育 5 天；</li>
<li>自此步骤起，操作无需无菌环境，但如同处理任何其他病原体，应始终采取适当防护措施。弃去每孔中的甲基纤维素覆盖层，并用吸水纸吸干残留液体；</li>
<li>向每孔加入 1 ml 甲醇/丙酮固定液（1:1），4°C 放置 1 小时；</li>
<li>倾去固定液，用 1X PBS 洗涤一次；</li>
<li>用 5% blotto 将抗病毒的一抗稀释至 1:1000；</li>
<li>向每孔加入 200 µl 稀释后的一抗溶液，在 37°C 孵育 1 小时；</li>
<li>移除一抗溶液，用 1X PBS 洗涤培养板；</li>
<li>在 5% blotto（100 ml 1X PBS 中含 5 g 脱脂奶粉）中按 1:1000 稀释山羊抗小鼠二抗（KPL 货号 074-1806），每孔加入 200 µl，37°C 孵育 1 小时；</li>
<li>按以下方法配制底物溶液：将 1 片 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（Sigma 货号 D5905）溶于 20 ml 1X PBS 中，待完全溶解后加入 8 µl 30% 过氧化氢；</li>
<li>向每孔加入 200 µl 上述底物溶液，室温静置 10 分钟；</li>
<li>移除底物溶液，并向每孔加入 1 ml 蒸馏水以终止反应；</li>
<li>倾去蒸馏水，用吸水纸将孔板吸干；</li>
<li>计数病毒斑点（病毒颗粒）。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td></td><td>含 5% CO2，37°C</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td></td><td></td><td></td><td>塑料</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td><td>用于组织培养</td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td><td>玻璃，无菌</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td><td>37°C</td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环水浴锅</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃膜饲器</td><td></td><td></td><td></td><td>配有适合饲器的橡胶管</td></tr><tr><td>蚊虫饲养杯</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 次氯酸钠溶液</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养板</td><td></td><td></td><td></td><td>6 孔、24 孔和 96 孔板</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td>玻璃</td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1×，无菌</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 细胞</td><td>细胞</td><td></td><td></td><td>用于病毒扩增</td></tr><tr><td>C6/36 培养基</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM 加 10% 热灭活 FBS、1% L-谷氨酰胺和非必需氨基酸以及 1% (v/v) 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-二氨基联苯胺四盐酸盐</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 片溶于 20 ml 1× PBS 中，溶解后加入 8 &amp;#x03BC;l 30% 过氧化氢</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>蚊子</td></tr></tbody></table>

埃及伊蚊（a. aegypti）登革病毒感染实验方案及感染表型测定

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

本实验的目的是在实验室条件下使埃及伊蚊感染登革病毒，并检测病毒在蚊虫组织中的感染水平与动态变化。该方案常规用于研究蚊虫与病毒之间的相互作用，尤其适用于鉴定能够决定媒介易感性的新型宿主因子。整个实验必须在生物安全二级（BSL2）实验室中进行。与恶性疟原虫感染实验类似，操作过程中须始终穿戴适当的防护装备，包括手套和实验服。实验结束后，所有接触过病毒的材料均需先用75%乙醇处理并漂白，然后方可进行常规清洗；其余所有材料在丢弃前必须经过高压灭菌处理。

一旦某个基因被鉴定为可能对登革热病毒具有抗性，就必须评估其在蚊子体内预防病毒感染的作用。本实验方案展示了如何检测蚊子中登革热病毒感染的程度。文中演示了病毒在细胞培养中扩增、通过膜饲法使蚊子吸食人血以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。

埃及伊蚊（A. aegypti）登革病毒感染实验方案及感染表型测定

本实验的目的是在实验室条件下使埃及伊蚊感染登革病毒，并检测感染水平和动态变化……

我是 George Dimopoulos，现在我们将向您展示如何用登革热病毒感染埃及伊蚊（Aidas GTI）。首先，我们需要在埃及伊蚊细胞系（Aidas Aus cell line）中扩增病毒。我叫 Jose Luis Ramirez，是 ous 实验室的一名博士研究生。进行此操作时，我们需要一个生物安全二级（BSL-2）实验室，配备组织培养罩和设定在 37°C 的 CO₂ 培养箱。我们需要 50 ml 塑料锥形管、人血清、37°C 水浴锅以及离心机。我们需要96孔板以及其他标准的分子生物学和生物化学试剂及耗材。这是一个位于生物安全二级（BSL-2）设施中的常规组织培养操作台，第一步是取出在75平方厘米培养瓶中生长至80%汇合度的细胞。该培养基为添加了10%经热灭活的胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和非必需氨基酸的MEM培养基。好的，现在我们将登革病毒加入细胞中。我们已从零下80摄氏度冰箱中取出病毒原液，并在37摄氏度培养箱中将其融化。向细胞中加入约0.5毫升的病毒原液，以达到每个细胞约1.5个病毒颗粒的浓度。将细胞置于摇床上，以缓慢的振荡速度摇动约15分钟。随后，将细胞放入CO2培养箱中，在37摄氏度、CO2浓度为5%的条件下孵育约45分钟。孵育45分钟后，取出细胞，加入30 ml培养基，再次将细胞放入培养箱中，继续孵育5天。现在我们将制备用于感染的病毒颗粒。首先，需要用细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，并连同培养基一起转移至50 ml锥形管中。接下来，以12,000 RPM离心10分钟，使细胞沉淀。在这个瓶子的底部，你可以看到沉淀物。接下来，我们将移除上清液，仅留下一毫升含有细胞的液体，以便从细胞中释放病毒。然后将其冷冻。这将使细胞破裂，然后我们将细胞解冻，再次冷冻，并重复此步骤三到四次，冷冻过程在干冰上进行。冷冻后，将细胞沉淀置于37摄氏度水浴中以解冻，随后再次在干冰上冷冻。每次冷冻步骤之间，我们通过涡旋振荡重新悬浮细胞。现在我们正在收集含有病毒的上清液，并将其加入之前离心所得的上清液中，后者也含有病毒颗粒。该病毒制备物现在可与等量的全人血和血清混合。此处我们将病毒制备物与添加了15%人血清的全人血混合。该血液-病毒混合液将用于喂饲蚊虫，以感染蚊虫。我们将把这份血液加入膜饲器中，然后将该膜饲器放置在一个装有蚊子的杯子上，让蚊子吸食这些血液约25分钟。我们已在膜饲器上放置了一个夹子，以使其固定稳定，基本上是通过夹子的重量将其压在网罩上。接下来，我们将把血液加入饲器中。在某些情况下，由于蚊子在自然条件下常在黑暗环境中吸血，因此在暗处进行本实验可能效果更佳。这当然取决于蚊子种群的饲养条件。蚊子目前已吸血约25至30分钟，此时可移除膜式饲血装置，并将其放入安全容器中进行去污染处理。血液饲喂后，必须将未成功吸血的蚊虫从已吸血的蚊虫中移除。为此，我们将盛有吸血后蚊虫的小杯放入低温环境中5到10分钟，以使蚊虫击倒。正如我们所见，蚊虫在低温下已经失去活动能力。打开盖子，将蚊子转移到一个小型的培养皿中，并将培养皿置于冰桶上，以确保蚊子始终处于低温环境，防止其逃逸。请注意，这些是感染性蚊子，因此必须格外小心，切勿让它们逃出。一旦将蚊子带入低温房间，需将其转移至常规昆虫饲养室（该室保持在室温条件下），但我们始终将蚊子放置在培养皿中，并将培养皿置于冰桶上，以确保它们持续处于低温抑制状态。你可以看到如何将吸血后的蚊子从未吸血的蚊子中分离出来。吸血后的蚊子体内有血液，它们的腹部已完全膨胀。其中一些已部分吸血，因此并未完全膨胀。它们的腹部含有少量血液，而另一些个体的腹部则含有大量血液。未吸血（UNFI）个体的腹部没有任何血液，因此你可以非常容易地区分已吸血个体与未吸血个体。因此，我们将把这些蚊子从培养皿转移到涂蜡线的纸杯中。下一步是检测蚊子体内登革病毒的感染情况。如果要检测蚊子中肠中的病毒感染，应在蚊子吸血后约第7天进行蚊子解剖。如果需要检测唾液腺中的病毒感染情况，我们应在蚊子吸血后约14天进行解剖。接下来，Jose 将演示如何从蚊子体内解剖出肠道。蚊子现已在冰上麻醉，并将通过在70%乙醇中孵育约一分钟以杀死。随后，我们将蚊子转移至两轮连续的水浴中。每分钟一次。目的是将蚊子中的乙醇冲洗干净。现在我们将在载玻片的磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖蚊子。从一只刚羽化的蚊子中分离中肠的最佳方法是将蚊子倒置放在其翅膀上，用一把镊子夹住蚊子的腹部，另一把镊子夹住胸部，然后将蚊子拉开。现在 Jose 正将蚊子拉开，肠道将出现在腹部与胸部之间。此时出现的半透明组织即为蚊子上部的肠道。现在，我们将解剖得到的肠道转移至细胞培养基中，并将其带入组织培养操作台，以从肠道中分离病毒颗粒。将解剖后的中肠带入组织培养室后，使用研杵进行匀浆，以释放病毒颗粒。中肠匀浆完成后，向匀浆液中加入培养基，使病毒颗粒达到1:100的稀释度。然后将此溶液进一步稀释为1:10、1:100和1:1000。在96孔板中，我们已在24孔板中将Alba picto细胞系培养至80%汇合度。随后，移除Alba picto细胞的上清液，并向这些细胞中加入稀释后的病毒颗粒，以测定每个稀释度中病毒颗粒的浓度。这将使我们能够确定病毒的感染水平。在蚊子的中肠中，细胞随后在室温下缓慢振荡15分钟。然后将细胞置于37°C的CO₂培养箱中孵育45分钟。接下来，向每个孔中加入 1 ml 的 1% 甲基纤维素覆盖物，然后将培养板再次置于 37°C 的 CO₂ 培养箱中孵育五天。五天孵育结束后，向每个孔中加入 1 ml 丙酮-甲醇固定液。随后将培养板置于 4°C 冰箱中孵育一小时。接下来，我们去除固定剂，并用 PBS 将每个孔清洗一次。然后，在 5% 血液溶液中按 1:1000 的比例稀释抗登革病毒一抗。接着，向每孔加入 200 微升该抗体溶液。向每孔中加入后，移动您的头部。谢谢。接下来，将酶标板在37摄氏度下孵育一小时。然后弃去高免血清液，并用一倍体积的XPBS洗涤每孔。接下来，我们用二抗以完全相同的方式重复上述步骤。根据说明书，我们配制了 20 ml 的底物，并将其加入容器中。然后向每个孔中加入 200 µL 的底物。接下来，我们通过移除底物来终止反应，并向每个孔中加入1毫升蒸馏水。然后弃去板中的水，并让板自然干燥。每个彩色斑点代表一个病毒噬斑，通过计数这些噬斑，我们可以估算出最初来自经匀浆处理的蚊子中肠内的病毒颗粒数量。我们刚刚向您展示了在埃及伊蚊中进行登革病毒感染的操作步骤。该方案包括在蚊子细胞系中产生病毒，随后从细胞系中纯化并分离病毒颗粒，再将其与人全血混合后饲喂给蚊子。病毒会感染蚊子，一旦感染建立，我们将向您展示如何分离蚊子的中肠组织，以及如何测定该中肠的感染水平。我们基本上将中肠进行匀浆处理，并通过该步骤从中肠中释放病毒颗粒。随后，我们利用这些病毒颗粒再次感染蚊子细胞系，以确定中肠的感染水平，即已感染蚊子中肠的病毒颗粒数量。

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科研

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Biology

生物学

在蚊子（埃及斑蚊）感染引起的表型测定为登革热感染病例的议定书“

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频协议展示了James实验室采用的一种将dsRNA注射到携带登革热病毒的埃及伊蚊雌蚊中的方法。视频中演示了注射针头的校准、注射装置的操作，以及将dsRNA注入蚊子胸部的技术。...

将dsRNA注射入雌性埃及伊蚊成蚊

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基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

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媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

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标准膜饲法检测 恶性疟原虫 感染 按蚊属 蚊媒

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学习在埃及伊蚊中建立登革病毒感染模型以研究病毒与宿主相互作用的方法。该方案涵盖病毒扩增、血餐感染及中肠病毒滴度测定等关键步骤，为蚊媒病毒学研究提供标准化实验框架。

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