Name: 恶性疟原虫在蚊子和病毒感染的表型测定感染的议定书 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学习恶性疟原虫蚊子感染表型测定方法，掌握配子体培养、膜饲血餐及中肠解剖技术。该方案为疟疾传播动力学研究提供可靠的实验基础。

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A. 配子体培养物的制备：
<ol>
<li>将新鲜的人类血液和血清在水浴中升温至37oC。</li>
<li>在通风橱内无菌条件下，用移液器将1 mL温热血液加入离心管中。在离心机中以2200 rpm离心5分钟。红细胞应形成沉淀；移除并弃去上层澄清血清。用等体积的新鲜血清将红细胞洗涤3次，以获得用于配子体的全血。</li>
<li>从CO2培养箱或蜡烛罐中取出配子体培养物。该培养物应维持在RPMI培养基中，并在培养第16天用于喂食蚊子。为确定培养第16天的配子体血症百分比（%），取一滴血液在玻片上制备薄血涂片，并进行吉姆萨染色。在寄生虫培养物的视野中计数配子体数量，通常范围为2–4%。根据所需最终配子体血症（0.3–1%），计算所需全血的体积。</li>
<li>用移液器吸除配子体培养物中的大部分培养基，注意不要扰动或吸走寄生虫（寄生虫呈黑色，而培养基为浅粉红色/红色）。将剩余的培养基和寄生虫转移至15 mL Falcon管中。在离心机中以2200 rpm离心5分钟。寄生虫和红细胞将形成沉淀，小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀中的寄生虫。</li>
<li>根据前述计算结果，将寄生虫与适量的制备全血（来自步骤A2）混合，以达到所需的最终配子体血症。轻轻吹打混匀约1分钟。</li>
</ol>
现在，该样品将用于喂养蚊虫。在水浴中保持37oC。
B. 喂食蚊虫：
<ol>
<li>将您的 按蚊属 将约30–50只蚊子通过电池供电的吸虫器吸入内衬石蜡的纸板杯中，杯口用橡皮圈或随杯附带的纸板盖固定纱网覆盖。</li>
<li>通过在玻璃进液管两侧插入喷嘴并连接至橡胶管，准备循环水浴装置。根据需要将多个进液管串联连接；串联的一端通过管路连接至水浴循环器的出水口（推动水流通过进液管的部分），另一端则由浸没在水浴中的橡胶管构成，以便循环后的水回流至水浴中。开启水浴装置，使水温升至约37oC，水通过进水管循环并流回浴槽。这是为了保持血液温度，确保寄生虫存活。</li>
<li>准备膜材料（我们使用拉伸的帕拉菲姆膜小方块），将其拉伸后覆盖在玻璃膜喂食器周围，并施加压力使其与喂食器开口紧密密封。该膜将模拟皮肤。</li>
<li>将一个饲喂器的膜面朝下放置在每个蚊虫饲喂杯上，并使用夹子或胶带固定饲喂器。膜应与网面平齐，以便蚊虫能够从杯内接触到膜。</li>
<li>小心地将步骤 A5 中的寄生虫-血液餐液通过移液器加入饲喂器的颈部，确保血液完全流经颈部进入储液腔，并与膜接触，以便蚊子能够接触到血液。我们通常使用约 200 &mu;每次饲喂的血量为 l，但此量可有所变化。</li>
<li>让蚊子吸血。我们让它们吸血一段时间 &asymp;30分钟（可变，取决于实验；对于大多数实验，可通过观察腹部血液含量来偶尔监测已进食个体的数量）。</li>
<li>喂食后，从蚊子饲养杯中移除饲喂器。关闭水浴，并将饲喂器与管路断开。</li>
<li>取出膜后，将喂食器浸泡于10%次氯酸钠溶液中进行去污，随后用水冲洗。将受污染的材料（膜、纸巾、手套等）放入小型生物危害废物袋中，并投入大型生物危害废物容器内。</li>
<li>将装有蚊子的杯子放入冰箱或冷室中使其麻醉。待蚊子完全麻醉后，将其转移至置于冰桶中的培养皿上。仔细检查蚊子的腹部，根据是否有吸血迹象进行分类，并剔除未吸血的个体。部分蚊子腹部会完全充血，另一些则仅呈现狭窄的血带；只要可见摄入血液，均视为“已吸血”。将已吸血的蚊子重新放回纸杯中。</li>
<li>提供糖餐（用10%蔗糖溶液浸湿的棉片），并将蚊虫在正常的昆虫饲养条件下培养7天。每天应监测蚊虫的死亡率。同时，需定期将棉片重新浸湿蔗糖溶液，以确保蚊虫不致饥饿。此外，最好添加一张浸有蒸馏水的纸巾，以保持蚊虫环境湿润。这些蚊虫为 P. falcipraum 已感染，因此必须格外小心，确保没有蚊子从杯中逃出。最好将杯子放入小型笼子中，以提供双重保护。</li>
</ol>
C. 解剖蚊子中肠并估算卵囊载量：
<ol style="margin-top: 0in">
<li style="tab-stops: list .5in">使用电池供电的吸蚊器从纸杯（步骤 B 中的）吸取蚊子。将吸蚊器可拆卸储液罐内的蚊子移至冷室，或将其埋入冰中至少 5 分钟，直至蚊子停止活动，以实现麻醉。</li>
<li style="tab-stops: list .5in">将麻醉后的蚊子从储液罐转移至置于冰上的玻璃培养皿中，铺成单层，并用塑料培养皿盖覆盖。无法容纳在培养皿中的蚊子保留在储液罐中，并将储液罐放回冷室或冰中。</li>
<li style="tab-stops: list .5in">使用尖头镊子将一只蚊子从培养皿转移至载玻片上的 100 µL PBS 液滴中，载玻片置于解剖显微镜下。其余蚊子保持覆盖状态，留在冷藏的培养皿中。</li>
<li style="tab-stops: list .5in">用尖头镊子夹住蚊子的胸部和腹部后端，将身体拉开，直至中肠暴露。用镊子去除肠道周围的多余组织。肠道呈白色、囊状结构。清除肠道上的多余组织。将肠道置于 12 孔载玻片的一个孔中，并浸入 5–10 µL 的 0.2% 汞溴红溶液中。压碎蚊体残骸并丢弃在湿润的纸巾上。重复操作，直至 12 孔载玻片装满。用玻璃盖玻片覆盖已固定的肠道。</li>
<li style="tab-stops: list .5in">在光学显微镜下检查肠道，寻找呈圆形、在透明或淡粉色肠组织背景下染成亮粉色的卵囊。计数卵囊数量，记录数据，然后继续处理下一个样本。对所有实验处理组的蚊子均重复此操作。</li>
<li style="tab-stops: list .5in">操作完成后，用纸巾擦拭载玻片。将带有肠道的纸巾和带有残骸的纸巾一同放入小型生物危害袋中，并丢弃至垃圾桶。整个操作过程中需佩戴手套，并注意防止任何感染蚊子逃逸。</li>
</ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
<li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

疟原虫感染及感染表型的检测可能存在一定差异，不同实验室可能采用不同的技术方法。

<table><tbody><tr><td>Anopheles</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>蚊子</td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>寄生虫。具有已知配子体血症的配子细胞。</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td><td>塑料</td></tr><tr><td>血清、血液</td><td></td><td></td><td></td><td>人源，O+型</td></tr><tr><td>0.2% 汞溴红</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td><td>12 孔</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数器</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 漂白剂</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td><td>用于组织培养</td></tr><tr><td>封口膜</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蚊子饲喂装置</td><td></td><td></td><td></td><td>玻璃膜饲喂器，适配饲喂器的橡胶管</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td>玻璃</td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>1X，无菌</td></tr><tr><td>循环水浴锅</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">移液器</td></tr></tbody></table>

恶性疟原虫蚊虫感染方案及感染表型测定

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，必须进一步评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本实验方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含疟原虫的人血，以及检测蚊子中肠内疟原虫载量的技术。

一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，就必须评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含人类血液的样本，以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。

一旦某个基因被识别为可能对疟疾具有抗性，就必须评估其在防止疟原虫感染按蚊体内的作用。

我是乔治·Dimopoulos，来自约翰斯·霍普金斯大学公共卫生学院的疟疾研究所。现在我们将向您展示如何用恶性疟原虫感染冈比亚按蚊，以及如何检测蚊子中肠的感染表型。本实验所需的最基本设备包括用于寄生虫培养的CO2培养箱。此外，如果您没有CO2培养箱，也可以使用蜡烛罐。当然，我们还需要一个昆虫饲养室，以及标准的分子生物学和细胞生物学设备，例如解剖显微镜、光学显微镜。我们需要水浴锅、蚊虫膜饲系统和离心机。大家好，我叫ISH，我在George Depos博士的实验室工作，是一名博士后。我叫Lindsay Garver，是一名博士研究生。质粒感染的第一步是准备好质粒培养物。如果你没有二氧化碳培养箱，可以使用蜡烛罐，在其中放入六孔板，板内含有待处理的细胞培养物，然后点燃蜡烛，再将罐子密封。第一步还需要准备好新鲜的人类血液和血清，并先将其置于37°C水浴中融化，同时使其保持温热状态，因为实验需要真正温热的血液和血清。为制备血液，需取一份新鲜人血样本。新鲜血液需在2000 RPM转速下离心5分钟，以沉淀红细胞。离心结束后，需弃去上清液，并用人体血清将红色沉淀物（即红细胞，RBC）洗涤三次。向沉淀中加入等体积的人类血清，混匀后再次以2000 RPM离心五分钟。此步骤重复进行三次。最后，获得可直接加入甘特培养物中的红细胞沉淀。好的，疟原虫培养物培养在CO2培养箱中，需在RPMI培养基中维持16天，第16天时即可用于感染实验。由于我们操作的是疟原虫培养物，每一步都必须格外小心。第一步是寄生虫应在BSL-2级实验室中培养，并且操作必须在生物安全柜中进行。所有移液器吸头和所有附加物均需丢弃在生物危害盒中，其他任何溶液也需如此处理，例如我们的移液器吸头。它们必须用10%的次氯酸钠溶液清洗，且操作时必须佩戴手套。在第16天培养时，实验人员需从血样中取一滴血液置于玻片上，制备涂片，进行染色，然后在光学显微镜下观察。我们可以从培养16天的配子体中测定GAMMAT百分比。移除大部分培养基时需小心操作，避免扰动或吸走任何寄生虫，这些寄生虫通常位于孔底部。保留剩余的培养基和寄生虫，将红细胞中的寄生虫混匀后转入离心管，随后放入离心机，在2000 RPM条件下离心5分钟。离心后，寄生虫将与红细胞一同形成沉淀。上清为RPMI培养基，底部沉淀中含有寄生虫。连同红细胞一起，移除上清液，即RPMI培养基。操作培养基时应注意避免扰动寄生虫和红细胞。由GIMs 10确定的GATOT百分比通常在2%至4%之间。当红细胞和寄生虫经离心后准备就绪时，将二者混合，所需添加的血液体积由最终的GATOT百分比决定。该百分比需为急性值，通常在0.3%至1%之间，此浓度将用于喂饲按蚊。对于按蚊感染实验，这是一个玻璃饲喂器，我们用它来进行蚊虫的膜饲喂。我们通过您所看到的小孔将血液注入其中，并由其容纳。在底部侧面有两个喷嘴，连接至我们的水浴装置，水浴温度为37摄氏度。为了准备饲喂，我们取一小块滤膜，从四个方向的两端将其拉伸，然后将其覆盖在玻璃饲喂器的开口端，形成一层薄膜，以模拟皮肤。这种方法被称为膜饲法。这是一个循环水浴装置，可将水温维持在37℃，并通过玻璃喂食器循环水流，从而使血液保持在37℃。我们将玻璃喂食器通过细小的毛细管连接到循环水浴装置上，并打开水浴设备，使水开始循环。水和血液不会混合，因为它们分别处于两个独立的腔室中。这个小容器中装有冈比亚按蚊（phis Gambi mosquitoes）。首先，将玻璃饲血器放置在蚊笼上，并在玻璃饲血器上放置一个重物，以确保包皮膜（phim）与网状金属网齐平。向饲血器中加入约 200 µL 含有寄生虫且符合所需按蚊感染率的血液，注意使血液完全流至底部，以便蚊虫能够接触到血液。拟合过程持续约30分钟。拟合完成后，将玻璃喂食器在10%次氯酸钠溶液中彻底清洗，并将剩余的膜和胶带全部取下，放入生物危害废物盒中丢弃。血液拟合后，需将未成功吸血的蚊虫从已吸血的蚊虫中移除。为此，我们将装有吸血后蚊虫的小杯子放入低温环境中5到10分钟，使其麻醉。如图所示，蚊虫在低温下已失去活动能力。打开杯盖后，将蚊虫转移至一个置于冰桶中的小培养皿内，以确保蚊虫在整个操作过程中保持低温状态，无法逃逸。请注意，这些是感染了疟原虫的蚊子，因此必须格外小心，切勿让它们逃逸。一旦蚊子在低温房间内被麻醉后，我们会将它们转移到维持在室温条件下的普通昆虫饲养室，但始终将蚊子放置在盛有冰块的冰桶内的培养皿中，以确保它们持续处于低温麻痹状态。您可以看到，如何将已喂食的蚊子与未喂食的蚊子区分开来。已吸血的蜱虫体内充满血液，完全饱血。有些蜱虫仅部分吸血，因此未完全饱血。它们的腹部只有少量血液，而另一些蚊子的腹部则含有大量血液。未吸血的蚊子腹部没有任何血液，因此你可以很容易、很容易地区分吸血与未吸血的个体。图中所示为吸食了血液的成年雌蚊，因此我们将把这些蚊子从培养皿转移到涂蜡纸板杯中。将吸血后的蚊子放入杯子中后，放入一小块浸有10%蔗糖溶液的棉花，以便蚊子在接下来的七天培养期间可以摄食10%蔗糖，同时放入一小块折叠的卫普毛巾以维持杯内湿度，并用培养皿盖住。感染疟原虫的蚊子被放入另一个小型笼子中，需采取双重防护措施，并将该笼子置于保持在27摄氏度和80%湿度的生物安全三级实验室中。在吸血七天后，将原本饲养在昆虫饲养室双层笼盒中的蚊子从饲养室取出，转移至冷藏室以使蚊子麻痹。蚊虫麻醉后，将其转移至培养皿中，并将培养皿置于装有冰块的容器上。现在我们准备开始解剖蚊虫，将解剖其中肠并寻找包囊。第一步是在解剖显微镜载物台上的玻片上加入100 µL PBS。下一步使用钝头镊子，将一只蚊子从培养皿转移到位于解剖显微镜载物台上玻片中的PBS中。其余蚊子仍置于冰冷的培养皿中。解剖蚊子时，用一把镊子夹住蚊子的胸部，另一把镊子夹住腹部后端，然后缓慢拉开身体部分，直至中肠暴露出来。它看起来像一个白色的囊状结构，用镊子去除多余的组织和其他身体部分。是的，这是中肠，外观呈白色囊状，内含口器。现在我们将中肠转移至12孔玻璃培养板中，并浸入5到10 µL的0.2% MicroPro溶液中，以利于中肠附着到载玻片上。使用盖玻片，我们对所有感染的蚊子进行此步骤。肠道呈现亮粉色，我们将此载玻片转移至光学显微镜下，以计数卵囊（oocyst, OS）负荷量。我们现在观察的是从感染蚊子中解剖出的中肠。中肠呈细长形，经罗马诺夫斯基染色后呈现非常淡的粉红色，而卵囊（O SST）应表现为在浅粉色肠组织背景上的鲜亮粉红色。然而，这些中肠来自感染的蚊子，却未显示任何卵囊，因此可能并未被感染。但如果中肠已被感染，卵囊会呈现为微小的鲜亮粉红色圆点，有时在一个中肠内可存在数十至数百个卵囊。该实验步骤包括用恶性疟原虫感染人血，将感染后的血液喂食冈比亚按蚊，解剖获取这些蚊子的中肠，并测定感染中肠内的卵囊数量。该技术至关重要，因为它是目前实验室条件下可实现的最接近人类疟疾传播过程的模拟方法。

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生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P.

Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

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