微机械动态细胞培养平台

以下实验的总体目标是微制造用于机械刺激细胞二维和三维培养环境的设备。这是通过使用多层夹层成型和堆叠技术来生产一系列垂直驱动的微型柱来实现的。作为第二步，对垂直驱动的微后阵列进行修改以拉伸培养膜，该膜将受控的菌株应用于在膜上培养的细胞。

或者，可以修改阵列以压缩微图案生物材料结构，以便对细胞施加机械刺激。在三维水凝胶阵列中培养，获得结果，根据荧光基准标记的图像分析，显示在整个阵列中同时应用一系列二维回波、双轴和三维压缩应变。大家好，我是来自多伦多大学机械与工业工程系以及生物材料与生物医学工程研究所 Craig Simmons 和 U Sun 实验室的 Chris Mariahs。

今天，我们将向您展示一种制造用于机械刺激细胞的微型设备的程序。我们在实验室中使用该程序来研究细胞在体外培养中如何响应各种机械力。那么让我们开始吧。

夹层模具的制造过程包括将透明晶片放置在未固化的聚二甲基 Sloane 上，或在 SU 8 母模上放置 PDMS。将三明治放入泡沫玻璃和金属堆栈中，并在烤箱中压缩固化。最后，拆解堆栈并剥去透明度，保留图案化 PDMS 层。

要开始此过程，请充分混合 PDMS、单体和交联剂。以标准的 10 比 1 比例，将 3 毫升未固化的 PDMS 混合物沉积到先前制造的 SU 8 母模上，并在真空室中对聚合物进行 DGA。接下来，将泡沫垫和 SU 8 主站放在有机玻璃底板上。

小心地将喷墨透明度的光滑面降低到未固化的 PDMS 上，确保避免捕获任何气泡。然后将一个孤立的载玻片放在第二个泡沫垫和有机玻璃顶板下方的透明度顶部。使用 C 形夹将三明治夹在一起。

将 PDMS 三明治放入 80 摄氏度的烤箱中固化至少 4 小时。固化后，将三明治从烤箱中取出并冷却。冷却后，取下夹子并拆卸三明治。

小心地从 SU 8 母版上剥离透明胶片，保留专利 PDMS 薄膜。修剪图案膜的边缘以去除多余的 PDMS，将图案层存放在无尘环境中，直到它们准备好使用。该协议的下一部分涉及构建垂直驱动柱的微制造阵列。

需要多层制造工艺来制作微型帖子阵列。最下层的图案化 PDMS 层是通过夹层模具制造制备的。对于这些实验，使用了直径从 600 到 1， 200 微米的圆形图案。

为了将 PDMS 层转移到干净的载玻片上，请使用电晕放电装置用氧气等离子体处理 PDMS 和玻璃表面。然后将两个表面彼此接触。将堆栈放在 80 摄氏度的热板上 10 分钟以完成粘合过程。

剥去透明度并丢弃。该工艺可确保图案化的 PDMS 薄膜永远不会从刚性基材上脱落，从而防止各层收缩。第二个夹层模塑层形成为所需隔膜和柱结构的负复制模具。

在这个演示中，使用直径为 500 微米的圆形柱子来形成该层。首先，使用双面胶带将负模复制模具临时固定在载玻片上，并在真空干燥中将未固化的 PDMS 沉积在夹层、模具层、脱气和旋涂上 45 秒以每分钟 1000 转的速度，产生 60 微米厚的驱动隔膜，在 80 摄氏度下部分固化旋涂 PDMS 层约 20 分钟，或直到 PDMS 发粘但不永久变形。触摸时，从部分固化的 PDMS 层上取下载玻片和双面胶带，并将其透明膜贴在一对载玻片和等离子体上。

处理部分固化的 PDMS，然后将 PDMS 倒置并将其放入定制的对准器中。对准器由安装在微型机械手上的真空吸盘组成。接下来，等离子体处理第一层 PDMS，然后将其放置在真空吸盘下方的旋转台上。

使用 avatar 12 倍缩放机器视觉系统观察两层之间的对齐情况。使用纵器对齐图层并小心地使它们接触。用手指轻轻按压，将各层粘在一起。

然后从矫正器中取出三明治。取下玻璃处理载玻片，并确保各层彼此完全接触。将烤箱在 80 摄氏度下再固化 30 分钟。

30 分钟后，透明和孤立的 PDMS 复制品模具可以从设备上剥离并丢弃。然后将该设备在 80 摄氏度下完全固化至少 4 小时，以对在变形二维基材上培养的细胞进行实验。通过将第三个 PDMS 层键合到器件上来修改微型执行器阵列。

第三个 PDMS 层由两层结构组成。下部圆圈与致动微型柱下方的致动腔的大小相匹配。上圆的直径比加载柱的直径大 100 微米。

一个 200 微米宽的微通道将这些特征连接到连接区域，并将用于润滑加载柱和培养膜。要修改设备以进行 2D 培养，首先按照书面协议中的说明制造连接器并将其粘合到它上面。然后将 10 至 15 微米的 PDMS 层旋涂到透明固化的光滑面上。

PDMS 薄膜在 80 摄氏度下放置至少 4 小时。下一步是将真空施加到执行器上，并将 PDMS 层粘合到器件上。为了完成这个。

首先，对执行器施加低水平真空，降低柱阵列等离子体处理和粘合。按照书面方案中的说明，旋涂 PDMS 膜到致动的微型设备上，柱子和培养膜将在短时间内保持亲水性。然后将润滑剂注射器连接到装置上，并在去离子水溶液中加入 90% 甘油。

除了润滑之外，该配方还无限期地保持了 PDMS 的亲水性，从而降低了摩擦系数。将设备放在 40 摄氏度的热板上，并继续向通道中注入润滑剂，导致压力小幅增加。几分钟后，气泡通过 PDMS 扩散，所有表面都将得到润滑。

最后一步，使用手术刀去除释放柱子的负压。在 PDMS 薄膜周围切割。小心地将透明层从器件等离子键合上剥离。

在设备培养区域周围手工切割的 PDMS 垫圈。将设备浸泡在 70% 乙醇中 5 分钟，然后在生物安全柜中用杀菌紫外线处理 45 分钟，对设备进行消毒。血浆，处理表面并与每毫升 100 微克胶原蛋白在 4 摄氏度下孵育过夜。

孵育过夜后，用无菌磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤设备，并以每平方厘米 10 至 15， 000 个细胞接种细胞。按照标准细胞培养方案，可以修改微致动器阵列，以对在 3D 光图案化水凝胶结构中培养的细胞进行实验。首先，制造了一个基于 PDMS 的多层平台。

用冰毒覆盖基平台后，注入相关的玻璃盖玻片水凝胶前驱体溶液。然后将光聚合物可储备生物材料微图案化到阵列中，并冲走剩余的前驱体溶液。然后，可以使用垂直驱动的加载柱阵列对在三维生物材料中培养的细胞施加压缩机械力，在 PDS 2010 实验室 COTER two 系统中，用隔伞 C 覆盖柱周围区域的透明胶带片。

这将改善生物材料系统的聚合动力学。涂覆后，从涂层系统中取出设备并撕下透明胶带，在柱子上留下一层 paraline C 保形层。然后，将甲基 ACRL 玻璃盖浸入每体积 2% 体积的三种三甲基氧基丙烯酸酯溶液中，溶于 95% 乙醇中 2 分钟。

冲洗盖子。加入 100% 乙醇，然后在 100 摄氏度下烘烤，在表面留下甲基丙烯酸酯基团。铸造一个 200 微米厚的 PDMS 垫片。

在培养皿中拍摄并切成小段。等离子体将其中四个小部分粘接在 MEAC 相关盖玻片的边缘。然后将空间等离子键合到覆盖 Lene C 涂层的器件的 PDMS 区域。

最后用 70% 乙醇洗涤设备，并在生物安全柜中将其暴露在杀菌剂或紫外线下 45 分钟。以光刻方式将载有细胞的 PEG 水凝胶照相到设备中。按照书面方案中的说明准备前体和光引发剂溶液，并充分混合，以获得每体积光引发剂浓度为 0.4% 重量的溶液。

通过 0.45 微米针式过滤器过滤混合物，以消毒和去除颗粒、胰蛋白酶冰细胞培养物，并在培养基中制备两倍于所需终点细胞浓度的细胞悬液。然后将细胞悬液和过滤的水凝胶前体光引发剂溶液以一比一的比例混合。使用 25 号长针头将溶液注入微型设备中。

小心避免在设备中捕获气泡。将打印的透明蒙版与设备表面上的对齐标记对齐。设置紫外线照明系统，在设备表面提供每平方厘米 17.5 毫瓦的 365 纳米波长紫外线剂量。

照明后，透过面罩照射水凝胶 195 秒。用 PBS 洗去未聚合的水凝胶前体溶液，用培养基替换 PBS，启动加载柱以压缩水凝胶结构。在这里，显示了用于 2D 机械刺激培养的完整样品装置。

红色染料用于标记驱动压力输送通道，蓝色 D 用于标记润滑通道应变特性。实验可用于通过跟踪荧光珠在底物上的运动来确定施加的应变场。红点代表微珠的未成型位置，而绿色点代表变形位置。

这里可以看到一个用于三维压缩实验的样品装置，其中绿色染料用于标记驱动压力通道。微后阵列的自上而下视图显示了在后侧顶部图案化的水凝胶结构，水凝胶结构中荧光珠的重建图像。在静止和 55 千克帕斯卡驱动压力下展示了三维培养系统中的菌株表征过程。

因此，我们刚刚向您展示了如何制造用于在二维或三维培养系统中机械刺激细胞的设备。执行此程序时，请务必记住尽可能保持设备清洁无尘，并保持耐心，尤其是在对齐步骤中。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。