Name: 微机械动态细胞培养平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: 学习使用微执行器阵列制造技术，通过多层三明治成型与堆叠工艺，在二维和三维培养环境中对细胞进行机械刺激。该方法可用于高通量动态细胞培养研究。

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我们感谢加拿大自然科学与工程研究理事会和加拿大卫生研究院（CHRPJ 323533-06）、CM 获得的安大略省研究生奖学金项目，以及 YS 获得的加拿大微纳工程系统研究讲席和 CAS 获得的力学生物学研究讲席所提供的经费支持。

<ol><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Schaffer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Device+for+the+application+of+a+dynamic+biaxially+uniform+and+isotropic+strain+to+a+flexible+cell+culture+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane.</a> J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).</li>
<li>Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micro-channel+fabrication+in+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+shrinkage-induced+PDMS+alignment+registration+issue+in+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micromech.+Microeng%22%5BJournal%5D)">Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography.</a> J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft-tribology%3A+Lubrication+in+compliant+PDMS-PDMS+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Tribology+International%22%5BJournal%5D)">Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact.</a> Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).</li>
<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).</li>
<li>Liu, V. A., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+photopatterning+of+hydrogels+containing+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells.</a> Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).</li>
<li>Hahn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31, 577-584 (2010).</li>
<li>Wipff, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).</li>
<li>Moraes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+polyurethane+culture+substrates+into+poly%28dimethylsiloxane%29+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices.</a> Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管概念上简单，但器件制备确实需要一定的实验技巧和实践经验。特别是在二维细胞培养的情况下，器件中多层结构的对准可能具有挑战性，尤其是在大面积阵列上。从实际操作角度看，当多层之间相邻特征的间距公差为50 μm时，我们能够可靠地实现100%的对准成功率。我们还成功实现了低至15 μm公差的对准，但所需对准时间显著增加，且成功率较低。将掩模对准以在阵列上光刻图案化生物材料同样具有挑战性，但与水凝胶柱相比，可以将定位柱设计得足够大，从而缓解这一限制。

其他挑战涉及本方案所述材料上的细胞培养。在二维拉伸系统中，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为培养膜会将生物学研究限制在短期实验范围内，因为刺激6小时后，细胞对基底的黏附会受到显著影响。这一问题可通过将基质蛋白共价结合到PDMS表面11来解决，或通过用更具临床相关性的聚氨酯材料替代PDMS细胞培养基底，以改善细胞黏附性并提高生物学实验的灵活性12。在所述的三维系统中，水凝胶化学组成仅作为示例性说明。长期培养贴壁细胞需要使用其他天然或合成水凝胶，或在聚乙二醇（PEG）基质中引入黏附性配体（可通过标...

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 PDMS 单体与交联剂试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 母模</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅烷化试剂：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷</td><td>United Chemical Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫垫</td><td></td><td></td><td>工艺用品商店，1–2 mm 厚</td></tr><tr><td>喷墨胶片</td><td>Grand Toy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>有机玻璃板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C 型夹</td><td></td><td></td><td>五金商店</td></tr><tr><td>显微操作系统</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制真空支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>视觉系统，Navitar 12 倍变焦</td><td>Navitar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接管</td><td>VWR international</td><td>Clay Adam Intramedic PE190</td><td></td></tr><tr><td>钝头 18G 针头</td><td>Small Parts (www.smallparts.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏心隔膜微型泵</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC 4.5V 直流</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀阀组</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯 3.4 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光引发剂 Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-乙烯基-2-吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准细胞培养试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于力学动态细胞培养的微加工平台

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

系统探究的能力 体外 细胞对机械生物学刺激组合的响应在组织工程、药物发现或基础细胞生物学研究中受到现有生物反应器技术的限制，因为这些技术无法同时向培养细胞施加多种机械刺激。为解决这一问题，我们开发了一系列微加工平台，旨在以高通量形式筛选机械刺激的影响。在本方案中，我们演示了基于垂直位移微柱阵列的微致动器阵列的制备方法，该阵列构成了该技术的基础；并进一步展示了如何改造这一基础技术，以在二维和三维培养模式下实现高通量、机械动态的细胞培养。

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。

系统研究体外细胞对组织工程、药物发现或……中机械生物学刺激组合响应的能力

以下实验的总体目标是微加工用于在二维和三维培养环境中对细胞施加机械刺激的装置。该目标通过采用多层三明治式 molding 与堆叠技术，制备出可垂直驱动的微柱阵列来实现。第二步，对可垂直驱动的微柱阵列进行改造，以拉伸培养膜，从而对生长在膜上的细胞施加精确控制的应变。或者，该阵列可被改造用于压缩微图案化生物材料结构，从而对细胞施加机械刺激。通过在三维水凝胶阵列中进行培养，结合荧光基准标记物的图像分析，可获得结果显示：在整个阵列上同时施加了一系列二维等双轴拉伸和三维压缩应变。大家好，我是来自多伦多大学机械与工业工程系以及生物材料与生物医学工程研究所Craig Simmons和U Sun实验室的Chris Mariahs。今天我们将向您展示一种用于制造微小装置的工艺，这些装置可用于对细胞施加机械刺激。我们在实验室中使用该工艺来研究细胞在体外培养条件下对多种机械力的响应。那么，让我们开始吧。三明治模具的制备过程包括将一张透明胶片放置在SU-8母模上的未固化聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面。将该三明治结构置于泡沫玻璃和金属组成的叠层中，并在烘箱中加压固化。最后，拆开叠层并剥离透明胶片，从而获得带有图案的PDMS层。首先，充分混合PDMS单体与交联剂。按照标准的10:1比例，将3毫升未固化的PDMS混合物滴加到预先制备的SU-8模具上，然后将该装置置于真空腔中以脱除气泡。接着，将泡沫垫和SU-8模具放置在一块有机玻璃基板上。将喷墨打印透明片的光滑面小心地压在未固化的PDMS上，确保避免夹入任何气泡。然后将一块硅化玻璃片置于透明片上方、第二个泡沫垫下方，并放置一块有机玻璃顶板。使用C型夹将这一夹心结构固定牢固。将PDMS三明治结构置于80摄氏度的烘箱中固化至少四小时。固化完成后，从烘箱中取出该结构并使其冷却。待冷却后，拆除夹具并拆开三明治结构。小心地将透明膜从保留有原始 PDMS 薄膜的 SU-8 模具上剥离。修剪图案薄膜的边缘以去除多余的 PDMS，将图案层存放在无尘环境中，直至准备使用。本实验方案的下一部分涉及构建一个由垂直驱动微柱组成的微加工阵列。制造微柱阵列需要一个多层加工工艺。最底层的图案化PDMS层通过三明治模具法制备。在这些实验中，采用了直径范围为600至1,200微米的圆形图案。为了将PDMS层转移至干净的玻璃载片上，使用电晕放电仪对PDMS和玻璃表面进行氧气等离子体处理。然后将两个表面相互贴合。将该叠层置于80摄氏度的加热板上加热10分钟，以完成键合过程。剥离透明层并弃去。此过程可确保图案化的PDMS薄膜始终未从刚性基底上释放，从而防止各层发生收缩。第二层模压夹层形成所需隔膜和柱状结构的负复制模具。在此演示中，使用直径为 500 微米的圆形柱体形成该层。首先，使用双面胶带将负复制模具临时固定在玻璃载片上，并在真空干燥器中进行硅烷化处理；将未固化的 PDMS

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Bioengineering

生物工程

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我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

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一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

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多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

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基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。...

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。...

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

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