Name: 微机械动态细胞培养平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: 学习使用微执行器阵列制造技术，通过多层三明治成型与堆叠工艺，在二维和三维培养环境中对细胞进行机械刺激。该方法可用于高通量动态细胞培养研究。

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我们感谢加拿大自然科学与工程研究理事会和加拿大卫生研究院（CHRPJ 323533-06）、CM 获得的安大略省研究生奖学金项目，以及 YS 获得的加拿大微纳工程系统研究讲席和 CAS 获得的力学生物学研究讲席所提供的经费支持。

<ol><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Schaffer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Device+for+the+application+of+a+dynamic+biaxially+uniform+and+isotropic+strain+to+a+flexible+cell+culture+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane.</a> J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).</li>
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<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+shrinkage-induced+PDMS+alignment+registration+issue+in+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micromech.+Microeng%22%5BJournal%5D)">Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography.</a> J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
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<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).</li>
<li>Liu, V. A., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+photopatterning+of+hydrogels+containing+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells.</a> Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).</li>
<li>Hahn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31, 577-584 (2010).</li>
<li>Wipff, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).</li>
<li>Moraes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+polyurethane+culture+substrates+into+poly%28dimethylsiloxane%29+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices.</a> Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管概念上简单，但器件制备确实需要一定的实验技巧和实践经验。特别是在二维细胞培养的情况下，器件中多层结构的对准可能具有挑战性，尤其是在大面积阵列上。从实际操作角度看，当多层之间相邻特征的间距公差为50 μm时，我们能够可靠地实现100%的对准成功率。我们还成功实现了低至15 μm公差的对准，但所需对准时间显著增加，且成功率较低。将掩模对准以在阵列上光刻图案化生物材料同样具有挑战性，但与水凝胶柱相比，可以将定位柱设计得足够大，从而缓解这一限制。

其他挑战涉及本方案所述材料上的细胞培养。在二维拉伸系统中，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为培养膜会将生物学研究限制在短期实验范围内，因为刺激6小时后，细胞对基底的黏附会受到显著影响。这一问题可通过将基质蛋白共价结合到PDMS表面11来解决，或通过用更具临床相关性的聚氨酯材料替代PDMS细胞培养基底，以改善细胞黏附性并提高生物学实验的灵活性12。在所述的三维系统中，水凝胶化学组成仅作为示例性说明。长期培养贴壁细胞需要使用其他天然或合成水凝胶，或在聚乙二醇（PEG）基质中引入黏附性配体（可通过标...

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 PDMS 单体与交联剂试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 母模</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅烷化试剂：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷</td><td>United Chemical Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫垫</td><td></td><td></td><td>工艺用品商店，1–2 mm 厚</td></tr><tr><td>喷墨胶片</td><td>Grand Toy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>有机玻璃板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C 型夹</td><td></td><td></td><td>五金商店</td></tr><tr><td>显微操作系统</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制真空支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>视觉系统，Navitar 12 倍变焦</td><td>Navitar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接管</td><td>VWR international</td><td>Clay Adam Intramedic PE190</td><td></td></tr><tr><td>钝头 18G 针头</td><td>Small Parts (www.smallparts.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏心隔膜微型泵</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC 4.5V 直流</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀阀组</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯 3.4 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光引发剂 Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-乙烯基-2-吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准细胞培养试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于力学动态细胞培养的微加工平台

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

系统探究的能力 体外 细胞对机械生物学刺激组合的响应在组织工程、药物发现或基础细胞生物学研究中受到现有生物反应器技术的限制，因为这些技术无法同时向培养细胞施加多种机械刺激。为解决这一问题，我们开发了一系列微加工平台，旨在以高通量形式筛选机械刺激的影响。在本方案中，我们演示了基于垂直位移微柱阵列的微致动器阵列的制备方法，该阵列构成了该技术的基础；并进一步展示了如何改造这一基础技术，以在二维和三维培养模式下实现高通量、机械动态的细胞培养。

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。

系统研究体外细胞对组织工程、药物发现或……中机械生物学刺激组合响应的能力

以下实验的总体目标是微加工用于在二维和三维培养环境中对细胞施加机械刺激的装置。该目标通过采用多层三明治式 molding 与堆叠技术，制备出可垂直驱动的微柱阵列来实现。第二步，对可垂直驱动的微柱阵列进行改造，以拉伸培养膜，从而对生长在膜上的细胞施加精确控制的应变。或者，该阵列可被改造用于压缩微图案化生物材料结构，从而对细胞施加机械刺激。通过在三维水凝胶阵列中进行培养，结合荧光基准标记物的图像分析，可获得结果显示：在整个阵列上同时施加了一系列二维等双轴拉伸和三维压缩应变。大家好，我是来自多伦多大学机械与工业工程系以及生物材料与生物医学工程研究所Craig Simmons和U Sun实验室的Chris Mariahs。今天我们将向您展示一种用于制造微小装置的工艺，这些装置可用于对细胞施加机械刺激。我们在实验室中使用该工艺来研究细胞在体外培养条件下对多种机械力的响应。那么，让我们开始吧。三明治模具的制备过程包括将一张透明胶片放置在SU-8母模上的未固化聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面。将该三明治结构置于泡沫玻璃和金属组成的叠层中，并在烘箱中加压固化。最后，拆开叠层并剥离透明胶片，从而获得带有图案的PDMS层。首先，充分混合PDMS单体与交联剂。按照标准的10:1比例，将3毫升未固化的PDMS混合物滴加到预先制备的SU-8模具上，然后将该装置置于真空腔中以脱除气泡。接着，将泡沫垫和SU-8模具放置在一块有机玻璃基板上。将喷墨打印透明片的光滑面小心地压在未固化的PDMS上，确保避免夹入任何气泡。然后将一块硅化玻璃片置于透明片上方、第二个泡沫垫下方，并放置一块有机玻璃顶板。使用C型夹将这一夹心结构固定牢固。将PDMS三明治结构置于80摄氏度的烘箱中固化至少四小时。固化完成后，从烘箱中取出该结构并使其冷却。待冷却后，拆除夹具并拆开三明治结构。小心地将透明膜从保留有原始 PDMS 薄膜的 SU-8 模具上剥离。修剪图案薄膜的边缘以去除多余的 PDMS，将图案层存放在无尘环境中，直至准备使用。本实验方案的下一部分涉及构建一个由垂直驱动微柱组成的微加工阵列。制造微柱阵列需要一个多层加工工艺。最底层的图案化PDMS层通过三明治模具法制备。在这些实验中，采用了直径范围为600至1,200微米的圆形图案。为了将PDMS层转移至干净的玻璃载片上，使用电晕放电仪对PDMS和玻璃表面进行氧气等离子体处理。然后将两个表面相互贴合。将该叠层置于80摄氏度的加热板上加热10分钟，以完成键合过程。剥离透明层并弃去。此过程可确保图案化的PDMS薄膜始终未从刚性基底上释放，从而防止各层发生收缩。第二层模压夹层形成所需隔膜和柱状结构的负复制模具。在此演示中，使用直径为 500 微米的圆形柱体形成该层。首先，使用双面胶带将负复制模具临时固定在玻璃载片上，并在真空干燥器中进行硅烷化处理；将未固化的 PDMS 沉积到三明治状的模具层上，脱气后以每分钟 1000 转的速度旋涂 45 秒，形成厚度为 60 微米的驱动膜。将旋涂后的 PDMS 层在 80 摄氏度下部分固化约 20 分钟，直至 PDMS 表面发黏但不会发生永久形变。当触碰时不再粘手后，从部分固化的 PDMS 层上取下玻璃载片和双面胶带，再将透明薄膜固定到一对用于操作的玻璃载片上，并进行等离子处理。对部分固化的PDMS进行处理，然后将PDMS翻转并放入定制的对准装置中。该对准装置由安装在微操纵器上的真空吸盘组成。接着对第一层PDMS进行等离子体处理，然后将其放置在真空吸盘下方的旋转台之上。使用放大12倍的机器视觉系统观察两层之间的对齐情况。利用操纵器对齐各层，并小心地使其接触。用手指轻轻按压，使各层粘合在一起。然后将三明治结构从对准仪中取出，移除玻璃载片，并确保各层之间完全接触。在80摄氏度的固化炉中额外加热30分钟。30分钟后，可将透明且具有微孔结构的PDMS模具从装置上剥离并丢弃。随后，将装置在80摄氏度下完全固化至少4小时，以用于在可变形二维基底上培养细胞的实验。通过将第三层PDMS键合到装置上，对微致动器阵列进行改造。第三层PDMS由双层结构组成。下层圆环与驱动微柱下方驱动腔的尺寸相匹配。上层圆环的直径比加载柱的直径大100微米。一条200微米宽的微通道将这些结构连接至连接区域，用于润滑加载柱和培养膜。为了将装置改造用于二维培养，首先按照书面方案所述，制备并将连接器键合到装置上。然后，在透明膜的光滑面旋涂一层10至15微米厚的PDMS，并进行固化。将薄 PDMS 膜在 80 摄氏度下加热至少四小时。下一步是对执行器施加真空，使 PDMS 层与装置键合。为此。首先，对驱动器施加低水平真空，使柱阵列下降，进行等离子体处理并键合。按照书面方案所述，将旋涂有PDMS薄膜的驱动微装置与柱阵列和培养膜结合，这些表面将在短时间内保持亲水性。然后将润滑剂注射器连接至装置，并用90%甘油的去离子水溶液填充润滑通道。除了润滑作用外，该配方还能无限期地维持PDMS的亲水性，从而降低摩擦系数。将装置置于40摄氏度的加热板上，并持续向通道内注入润滑剂，以产生轻微的压力升高。数分钟后，气泡将通过PDMS扩散，所有表面均会被润滑。最后一步，使用手术刀释放负压，取下支柱。沿薄PDMS膜周围进行切割。小心地将透明背衬从装置的等离子体键合处剥离。在装置的培养区域周围使用手工切割的PDMS垫圈。将装置在70%乙醇中浸泡五分钟进行消毒，随后在生物安全柜中用杀菌紫外灯处理45分钟。对表面进行等离子处理，并在4摄氏度下用100微克/毫升的胶原蛋白溶液孵育过夜。经过过夜孵育后，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤装置，并以每平方厘米10,000至15,000个细胞的密度接种细胞。根据标准细胞培养方案，可对微执行器阵列进行改造，以开展在三维光图案化水凝胶结构中培养的细胞实验。首先，制备一种基于多层PDMS的平台。在基底平台上覆盖一层甲基后，注入相关的玻璃盖玻片水凝胶前体溶液。随后，将光聚合性可固化生物材料微图形化至阵列中，并冲洗掉剩余的前体溶液。该阵列中的垂直驱动加载柱可用于对三维生物材料中培养的细胞施加压缩力学力，操作时可用 Scotch 胶带遮蔽加载柱周围的区域，并在 PDS 2010 实验室 COTER 两系统中用 Paraline C 对装置进行包被。这将改善该生物材料体系的聚合动力学。涂层完成后，将装置从涂覆系统中取出，并揭去胶带，使派瑞林C在微柱表面形成一层保形涂层。随后，将甲基丙烯酸甲酯玻璃盖玻片浸入含有2%（体积比）三甲氧基丙基甲基丙烯酸酯的95%乙醇溶液中处理两分钟。冲洗盖片，依次浸入100%乙醇，随后在100°C下烘烤，使表面留下甲基丙烯酸酯基团。浇铸一层200微米厚的PDMS间隔层。将薄膜置于培养皿中，并切割成小片。取其中四片小片，通过等离子体键合将其固定在与微通道相关的盖玻片边缘。随后，通过等离子体键合将这些区域与覆盖在Lene C涂层上的装置的PDMS区域连接。最后，在生物安全柜中用70%乙醇清洗该装置，并将其暴露于杀菌剂或紫外光下45分钟以完成灭菌。为了通过光刻技术将含细胞的PEG水凝胶在装置内进行图案化，按照书面方案所述配制前体溶液和光引发剂溶液，并充分混合，得到浓度为0.4%（质量/体积）的光引发剂溶液。使用0.45微米注射器滤器过滤混合物，以实现灭菌并去除颗粒物、胰蛋白酶和冰冻细胞培养物，并在培养基中制备浓度为所需终浓度两倍的细胞悬液。然后将细胞悬液与过滤后的水凝胶前体光引发剂溶液按1:1比例混合。使用长25号针头将溶液注入微流控装置中。小心操作，避免在装置中产生气泡。将打印好的透明掩膜与装置表面的对齐标记对齐。设置紫外光照射系统，使装置表面接受波长为365纳米、强度为17.5毫瓦/平方厘米的紫外光照射。照射后，通过掩膜对水凝胶照射195秒。用PBS洗去未聚合的水凝胶前体溶液，并将PBS更换为培养基，启动加载柱以压缩水凝胶结构。此处展示的是用于二维力学刺激培养的完整样品装置。红色染料用于标记驱动压力输送通道，蓝色D用于标记润滑通道的应变表征。通过追踪基底上荧光微珠的移动，实验可用来确定施加的应变场。红色斑点代表微珠未变形时的位置，绿色斑点代表变形后的位置。在此处展示了一种用于三维压缩实验的示例装置，其中使用绿色染料标记驱动压力通道。微柱阵列的俯视图揭示了位于柱顶的水凝胶结构，以及水凝胶结构中荧光微珠的侧向重建图像。在静息状态和55千帕驱动压力下的情况展示了三维培养系统中的应变表征过程。我们刚刚向您展示了如何制备用于在二维或三维培养系统中对细胞施加机械刺激的装置。在进行此操作时，重要的是要尽量保持装置清洁无尘，并保持耐心，尤其是在对准步骤中。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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