Name: 抗原特异性在体内使用CFSE标记的靶细胞的杀伤含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用CFSE标记靶细胞评估小鼠体内抗原特异性CD8+T细胞杀伤功能的方法。该实验通过流式细胞术定量分析细胞毒性，为研究细胞免疫应答质量提供可靠方案。

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我要感谢 Bianca Mothé、Carla Oseroff 和 Marie-France DelGuercio 向我介绍免疫学检测方法和小鼠操作技术。G. A. Splitter 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1-RO1-AI-073558、GLRCE 资助项目 1-U54-AI-057153 以及 BARD 资助项目 US-3829-06 提供经费支持。

1. 通过免疫诱导靶标特异性效应CTL（第0天）
<ol>
<li> 开始之前，需确定一个特定的效应细胞：靶细胞系统。本示例为经典的 体内 CTL 检测中，我们将使用纯化的肽进行免疫，以诱导特异性的 CD8+ T 细胞。相同的肽将用于致敏同源靶细胞，从而建立特异性的效应细胞：靶细胞系统。或者，您也可以选择使用全病原体或蛋白质来获得特异性的效应细胞和靶细胞。</li>
<li> 在生物安全柜内对工作台面进行去污，以确保注射过程的无菌性。通过先将多肽免疫剂置于 50 μg 纯化肽的导入 100 μL 含10% DMSO的PBS/小鼠溶液，置于2 mL离心管中。随后加入等体积的预冷不完全弗氏佐剂，并用1 mm珠子加至0.2 mL刻度线处以助混匀。自此步骤开始，直至注射前均需将免疫原置于冰上。用Parafilm封口膜密封管口。 </li>
<li> 使用珠磨机以最大转速混合乳液3分钟，混匀后立即将乳液放回冰上。所得乳液的稠度应类似于蛋黄酱。将乳液置于冰上静置 4° C 若时间允许（最长可达一周），过夜孵育，若观察到任何分层现象，需进一步混匀。</li>
<li> 使用1 mL注射器和20或20.5号针头吸取乳状液，注意避免吸入微珠（微珠应大于针头孔径，但仍需留意）。</li>
<li> 在尾根部进行小鼠皮下注射。我们使用改良的塑料50 mL离心管，以安全、轻柔地固定小鼠，便于注射。向小鼠注射0.2 mL乳剂。 </li>
</ol>
2. 收集目标细胞（第8天）
<ol>
<li> 需要使用未免疫的同系小鼠作为靶细胞来源。根据AAALAC标准对未免疫小鼠实施安乐死。</li>
<li> 使用70%乙醇喷洒小鼠体表进行消毒，以尽量减少小鼠毛发或其他外部污染物带来的污染风险。</li>
<li> 使用解剖剪在小鼠左侧体表皮肤上剪开一个小口。将皮肤掀开，暴露腹膜腔及内脏器官。</li>
<li> 剪开腹膜，注意不要损伤其下方的任何器官。脾脏靠近体表，颜色与肝脏相似（深红色），但体积较小，呈肾形。感染小鼠的脾脏通常明显大于未感染对照组小鼠。</li>
<li> 小心取出脾脏，操作时应轻柔，避免脾脏破裂成多个碎片，以最大限度回收细胞数量。立即将脾脏放入含有10 mL预冷培养基的15 mL锥形离心管中，并继续处理其余小鼠。</li>
<li> 将15 mL锥形管中的内容物（培养基和脾脏）倒入玻璃组织研磨器中。用力研磨脾脏组织，直至所有组织失去原有颜色，此时可认为已从结缔组织中充分释放出全部细胞。</li>
<li> 将研磨后的悬液通过70 μm细胞滤网过滤至50 mL锥形离心管中。用新鲜培养基冲洗研磨器，并将冲洗液一并通过细胞滤网。</li>
<li> 在4°C下以1300 RPM离心7分钟，弃去上清液。</li>
<li> 用10 mL预配的裂解试剂重悬沉淀，于37°C孵育7分钟。</li>
<li> 加入最多50 mL新鲜培养基，按上述条件再次离心。</li>
<li> 用50 mL新鲜培养基重悬细胞，并按上述条件再次离心（洗涤步骤）。*注意：此时若需获得纯化的靶细胞群体用于移植至受体小鼠，可进行磁珠分选特定细胞类型（例如巨噬细胞）。此外，此时也可向培养体系中引入实验性处理，以研究该处理对细胞特异性杀伤的影响。</li>
<li> 计数细胞，并在96孔圆底组织培养板中每孔接种1 × 107个细胞，体积为100 μL。*此为每孔较高细胞浓度，但由于该检测时间较短，我们观察到在此浓度下细胞活力未受影响。</li>
</ol>
3. 靶细胞的处理与标记
<ol>
<li> 用病原体特异性多肽或无关多肽对照脉冲处理相应细胞及重复样本：加入 1 μg/mL 多肽，4°C 孵育 1.5 小时，随后转移至 37°C 培养箱中继续孵育最后 30 分钟。在此期间准备 CFSE 试剂。</li>
<li> 根据制造商说明书配制 CFSE，并稀释至 0.5 至 25 μM 之间的使用浓度。将“低”浓度 CFSE 配制成“高”浓度的十分之一。例如，对于[低]浓度，将 0.5 μL CFSE 加入 10 mL PBS 中；对于[高]浓度，将 5 μL CFSE 加入 10 mL PBS 中。标记前将配制好的 CFSE 预热至 37°C。</li>
<li> 从培养箱中取出细胞培养板，在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟收集细胞沉淀。轻弹去除上清液。</li>
<li> 通过向相应孔中加入 200 μL 适当的 CFSE 试剂，将细胞重悬于[低]或[高]浓度 CFSE 中，并在 37°C 孵育 15 分钟。</li>
<li> 从培养箱中取出细胞培养板，再次在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟。轻弹去除上清液。</li>
<li> 将细胞重悬于每孔 200 μL 预热的新鲜培养基中，并在 37°C 孵育 30 分钟。</li>
<li> 从培养箱中取出细胞培养板，在室温下以 1300 RPM 离心 7 分钟。轻弹去除上清液。</li>
<li> 将细胞重悬于每孔 100 μL PBS 中。</li>
<li> 进行过继转移时，每只小鼠注射一份[低]标记细胞孔与一份[高]标记细胞孔的混合细胞。最终注射体积为 0.2 mL，其中包含 50% 特异性靶细胞和 50% 无关细胞。</li>
<li> 切记保留部分标记细胞，用于数据分析时作为非转移对照组，并用于流式细胞仪检测（见图 1）。</li>
</ol>
4. 过继性转移
<ol>
<li> 按照 AAALAC 标准对先前经肽段免疫的小鼠（本方案第 #1 部分）进行麻醉。</li>
<li> 通过眶后途径向受体小鼠注射 0.2 mL 标记的靶细胞。</li>
<li> 在处死受体小鼠前，等待 6 小时或预先确定的最佳时间。</li>
</ol>
5. 收集标记细胞
*注意：步骤 5.1 至 5.11 与步骤 2.1 至 2.11 相同
<ol start="12">
<li> 计数细胞，并将细胞以每孔100 μL体积接种到96孔圆底组织培养处理板中，每孔接种量为1 × 106个细胞。</li>
<li> 向所有孔中加入100 μL 2%多聚甲醛，使终浓度为1%多聚甲醛，用于固定回收的和未转移的细胞。</li>
</ol>
6. 流式细胞术与数据分析
<ol>
<li> 在流式细胞仪上运行样本并分析数据。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在所得直方图中，表位特异性峰的降低是细胞特异性杀伤的指标（图1）。使用以下公式（见表1）计算细胞特异性裂解的实际值： 
比率 = 无关百分比 : 表位特异性百分比（[低]峰:[高]峰）， 
特异性裂解百分比 = [1 -（未转移对照组比率 / 实验组比率）] × 100
<img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="流式细胞术直方图，CFSE 分析，显示表位特异性及肽段反应比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 回收的 BALB/c 小鼠脾细胞的 CFSE 分析图谱。 数字表示高或低 CFSE 表型细胞的百分比。A) 未转移对照组。所有[高]CFSE 峰代表表位特异性靶细胞，而[低]CFSE 峰代表用无关肽段致敏的靶细胞。B) 从 PBS 免疫受体小鼠（对照）回收的 CFSE 标记细胞。C) 从两只不同肽段特异性受体小鼠回收的 CFSE 标记细胞，注意表位特异性峰减少。
<img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="特异性杀伤百分比柱状图；治疗组间的实验比较；数据分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 分析数据的图形表示。 每组小鼠（PBS、肽 A 和肽 B）均显示三个数据点。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>样本</td>
 <td>CFSE 高百分比 表位肽刺激组</td>
 <td>CFSE 低百分比 无关对照组</td>
 <td>低:高 比值</td>
 <td>表位特异性杀伤百分比</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>42.8</td>
 <td>57.2</td>
 <td>1.34</td>
 <td>16.97</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>43.1</td>
 <td>56.9</td>
 <td>1.32</td>
 <td>15.94</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>44.3</td>
 <td>55.7</td>
 <td>1.26</td>
 <td>11.74</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide A</td>
 <td>39.7</td>
 <td>60.3</td>
 <td>1.52</td>
 <td>32.56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide A</td>
 <td>38.6</td>
 <td>61.4</td>
 <td>1.59</td>
 <td>35.61</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide A</td>
 <td>40.6</td>
 <td>59.4</td>
 <td>1.46</td>
 <td>29.99</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide B</td>
 <td>38.7</td>
 <td>61.3</td>
 <td>1.58</td>
 <td>24.68</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide B</td>
 <td>38.5</td>
 <td>61.5</td>
 <td>1.60</td>
 <td>25.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptide B</td>
 <td>39.3</td>
 <td>60.7</td>
 <td>1.54</td>
 <td>22.76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS NT Control</td>
 <td>47.4</td>
 <td>52.6</td>
 <td>1.11</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pep A NT Control</td>
 <td>49.4</td>
 <td>50.6</td>
 <td>1.02</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pep B NT Control</td>
 <td>45.6</td>
 <td>54.4</td>
 <td>1.19</td>
 <td> </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 代表性数据分析。 “NT”为未转染。

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

无利益冲突声明。动物实验均依照威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指南与规定进行。

该实验可经修改用于研究细胞的增殖能力，包括克隆扩增，因为CFSE在子代细胞中的分布相对均等10,11。此外，也可利用CFSE标记来研究细胞迁移6,12，但根据具体研究假设，可能存在更合适的方法，例如四聚体技术或生物发光成像13，这些方法也可与CFSE标记联合使用。
需要注意的是，CFSE 在流式细胞仪中会渗漏到多个通道，因此如果要进行表面标志物的共染色，选择PeCy7作为荧光染料较为合适，而PE的效果可能不佳。

<table><tbody><tr><td>1 mm 玻璃珠</td><td>Biospec 产品</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>BD 生物科学</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂 Adjulite&amp;rsquo;佐剂</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>FC 500 流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 玻璃组织研磨器</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>BD 生物科学</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney塑料包装</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse 裂解试剂</td><td>BD 生物科学</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD生物科学</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

抗原特异性 体内 使用cfse标记靶细胞的杀伤实验

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于简便快速地标记目标细胞群体 体内 研究。这种标记方法传统上用于研究细胞增殖和迁移。在本文所介绍的方法中，我们缩短了过继转移后的观察时间，以检测表位特异性CFSE标记靶细胞的存活与杀伤情况4-6CD8+ T细胞克隆的特异性杀伤水平可反映免疫应答的质量，因为其数量可能具有误导性。随着时间推移，特异性CD8+ T细胞可能会出现功能耗竭，表现为细胞因子产生减少和杀伤能力下降7,8此外，某些CD8+ T细胞克隆的杀伤能力可能不如具有不同TCR特异性的其他克隆。9为实现有效的细胞介导免疫（CMI），必须鉴定出能够诱导足够数量且功能强健的应答T细胞的抗原。本文评估了在BALB/c小鼠中两个肽特异性T细胞克隆的细胞特异性杀伤百分比。

许多感染会引发强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，但有时反应细胞的数量与病原体的控制之间并不相关1。衡量CTL质量的一个指标是其特异性杀伤能力2。通过CFSE标记靶细胞可用于在体内（in vivo）研究CTL反应的质量3,4。

抗原特异性 体内 使用CFSE标记靶细胞的杀伤实验

羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于快速、简便地标记特定细胞群体，以进行体内研究。

以下实验的总体目标是通过研究CD8阳性T细胞在体内杀伤靶细胞的能力，评估其对特定抗原的功能质量。该目标首先通过免疫受体小鼠，诱导产生抗原特异性的效应性CD8阳性T细胞来实现。第二步，对初级靶细胞赋予特异性或进行其他处理，从而完成特异性效应细胞-靶细胞系统的构建。接下来，通过眶后过继转移将靶细胞给予受体小鼠。为了观察效应细胞在体内的杀伤效果，通过CFSE染色细胞的流式细胞术分析获得结果，以判断效应细胞是否杀灭了任何靶细胞。你好，我叫Marina Ward。我是威斯康星大学麦迪逊分校 Gary Splitter 实验室的研究生。该方法将有助于深入了解 CTL 杀伤作用，也可应用于细胞增殖和存活研究。本次演示过继性转移操作的将是来自我实验室的科学家 Jerome harms 博士。首先需战略性地确定一个特定的效应细胞-靶细胞体系。例如，在经典的体内 CTL 实验中，使用纯化的肽进行免疫以诱导特异性的 CD8 阳性 T 细胞，并用相同的肽脉冲同基因型靶细胞，从而建立特异性的效应细胞与靶细胞系统。对生物安全柜的工作表面进行去污染，以确保注射过程的无菌性。通过将肽首先加入 2 毫升离心管中，来制备肽免疫原。每只小鼠将50微克纯化肽溶于100微升含10% DMSO的PBS中。接着，加入等体积预冷的不完全弗氏佐剂，并加入1毫米珠子用于混匀。用封口膜封紧管盖，将免疫原置于冰上保存直至注射。使用珠子振荡器，将转速调至每分钟最大转速，充分混匀乳剂3分钟，混匀后立即将乳剂放回冰上。所得乳剂的稠度应与蛋黄酱相似。将乳剂置于4°C条件下过夜或最长一周，若在免疫接种时发现有分层现象，需再次进行混匀。确定本实验部分所需的小鼠。使用1 mL注射器和20号针头吸取乳剂，注意避免吸入任何珠粒，以制备靶细胞。采用 naive 同系小鼠，并按照美国实验室动物照护及使用协会（A-A-A-L-A-C）批准的标准对这些 naive 小鼠实施安乐死。用 70% 乙醇喷洒小鼠相应部位，以尽量减少来自小鼠、毛发或其他外部污染物的污染风险。使用解剖剪在小鼠左侧皮肤上做一个小切口。将皮肤瓣拉开，暴露腹膜囊和内脏器官。切开腹膜时需小心，避免损伤下方的任何器官。找到脾脏，脾脏位置较浅，呈深红色。小心取出脾脏，并立即放入含有 10 毫升预冷的 RPMI 培养基的 15 毫升锥形管中，置于冰上。对剩余小鼠重复此操作。将脾脏和培养基转移至玻璃组织匀浆器中。研磨脾脏直至所有组织失去颜色。将匀浆产物通过70微米细胞滤器过滤至50毫升锥形管中。用新鲜培养基冲洗匀浆器一次，并将冲洗液通过滤器倒入脾脏匀浆液中，于4°C、1,300转/分钟离心样品。静置并弃去上清液，持续七分钟。将细胞沉淀重悬于10毫升裂解试剂中，于37摄氏度孵育七分钟。加入最多50毫升新鲜培养基，通过离心收集细胞。重复此洗涤步骤。计数细胞，并将1000万个细胞分装至每孔。置于96孔圆底组织培养板中。在4摄氏度下孵育一个半小时。最后30分钟转移至37摄氏度的培养箱中。根据生产商说明配制新鲜的CFSE试剂，并稀释至终浓度为0.5至25 µM之间。配制两种浓度相差十倍的CFSE溶液。在标记前，将低浓度和高浓度的CFSE溶液均平衡至37摄氏度。从培养箱中取出含有靶细胞的96孔板，通过离心沉淀细胞。在室温下，轻敲培养板以去除上清液。将细胞重悬于 200 微升低浓度或高浓度 CFSE 溶液中，在 37 摄氏度培养箱中孵育 15 分钟后，于室温下离心收集细胞，轻敲培养板去除上清液，再将细胞重悬于 200 微升新鲜培养基中，于 37 摄氏度继续孵育 30 分钟。再次于室温下离心收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 50 微升 PBS 中。在数据分析时，预留部分标记细胞作为非转移对照组，并用于流式细胞仪检测以进行过继转移实验。每只小鼠将一孔低浓度CFSE标记的细胞加入到一孔高浓度CFSE标记的细胞中。因此，最终注射液包含50%特异性靶细胞和50%非相关细胞，总体积为0.1毫升。为便于过继转移，对肽段免疫的小鼠进行麻醉，通过眶后途径向受体小鼠注射0.1毫升标记的靶细胞。六小时后处死受体小鼠以收获细胞，分离小鼠脾脏，并采用相同方案纯化细胞群体。制备受体脾细胞时，将细胞以每孔100万接种至96孔圆底组织培养板中，用多聚甲醛固定回收的未转移细胞，上流式细胞仪检测并分析数据。细胞特异性杀伤结果的典型展示方式有两种。在流式直方图上，表位特异性峰降低，其计算值代表细胞特异性裂解。此处的数字表示从经PBS免疫的受体小鼠回收的未转移对照CFSE标记细胞中，高或低CFSE表型细胞的百分比，以及从两种不同肽特异性受体小鼠回收的CFSE标记细胞中相应表型细胞的百分比。注意观察到表位特异性峰的降低，提示存在细胞特异性杀伤。或者，可以以图形方式展示各组小鼠的细胞特异性裂解结果，包括 PBS、肽 A 和肽 B 组。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用小鼠建立自身的体内 CTL 杀伤实验。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

抗原特异性在体内使用CFSE标记的靶细胞的杀伤含量

CFSE 可将荧光染料羧基荧光素共价标记到细胞内长寿命的分子上。因此，当 CFSE 标记的细胞发生分裂时，其子代细胞的荧光强度减半，从而可用于评估细胞增殖。本文描述了通常用于 CFSE...

使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测淋巴细胞增殖

一种用于制备人组织提取物的简单方案被描述，该提取物可作为功能性T细胞检测中抗原的来源。该方法可用于检测T细胞对组织来源抗原的反应。 体外.

组织抗原提取用于功能分析

该视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于分析细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答中的免疫显性。注射的荧光标记靶细胞表现出与免疫原性表位相对应的不同荧光强度。在收集脾脏并进行分选后，高荧光强度细胞数量减少，从而证实了CTL应答中的免疫显性现象。...

评估细胞毒性T淋巴细胞应答中免疫优势性的实验方法

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+...

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

详细监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTAs）在一种 体内 评估T细胞功能的检测方法...

体内T细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 In vivo

本实验方案的目的是实现对检测 体内...

体内 检测抗原特异性T细胞杀伤功能的实验方法——基于疫苗接种模型

本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性CD8+ T细胞应答中的免疫显性

本文介绍了一种利用染料稀释法检测CD4+...

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4+ T细胞

体内 肿瘤来源细胞外囊泡的免疫原性筛选：通过脾脏T细胞流式细胞术分析

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

学习使用CFSE标记靶细胞评估小鼠体内抗原特异性CD8+T细胞杀伤功能的方法。该实验通过流式细胞术定量分析细胞毒性，为研究细胞免疫应答质量提供可靠方案。

抗原特异性体内使用CFSE标记靶细胞的杀伤实验

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抗原特异性 体内 使用CFSE标记靶细胞的杀伤实验

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