分析甲基化和其他 S腺苷 _{L同型半胱氨酸结合蛋白}

以下实验的总体目标是通过捕获化合物质谱或 CCMS 分析复杂蛋白质混合物中的甲基转移酶。甲基转移酶通过携带一般甲基转移酶产物抑制剂、S 腺苷脂、L 同型半胱氨酸短、SAH 作为选择性函数的三功能捕获化合物进行功能分离，在此处所示的工作流程中，功能分离是通过将细胞裂解物与捕获化合物孵育来实现的，以在捕获化合物的选择性功能与靶蛋白之间建立可逆的结合平衡作为第二步。混合物在 capra 盒内由紫外线照射。

照射光激活捕获化合物的反应性功能。这会导致捕获化合物和靶蛋白之间形成不可逆的共价交联。接下来，将捕获化合物蛋白偶联物与裂解物分离，从固体支持物中彻底洗涤释放，并进行胰蛋白酶浸渍，以便通过三联肽的质谱分析鉴定捕获的蛋白质，结果显示基于捕获化合物质谱法，从大肠杆菌细胞裂解物中直接分离和鉴定甲基转移酶。

大家好，我是来自生物化学系 CaTECH 实验室的 Thomas Lentz。我是 Mathias Rega，也来自 CapTech 生物化学实验室。我是分析部门的 Mer Linsky。

今天，我们将向您展示从均衡细胞中捕获甲基转移酶的程序。我们在实验室中使用该程序来研究小分子蛋白质相互作用。该程序能够分离和鉴定功能性亚蛋白质组，例如激酶、金属蛋白酶、gtpa、ais 等。

我们还将这种方法用于药物靶点发现。那么让我们开始吧。对于捕获实验，使用 snail L 同型胱氨酸刺山柑试剂盒短 SAH 刺山柑试剂盒。

该试剂盒包括 SAH 捕获化合物和游离 SAH 作为竞争产品。还包括直径为 1 微米的链霉亲和素包被磁珠、5 倍浓缩捕获缓冲液和 5 倍浓缩洗涤缓冲液，使用一个 200 μL PCR 试管条的不同试管通过混合 50 μL 或 10 mL/mL 制备 SAH 捕获化合物负载的链霉亲和素包被磁珠。对于每个 Eloqua，用 25 微升 100 微摩尔 SAH 捕获化合物大力包被链霉亲和素包被的磁珠。

在室温下摇动所得悬浮液 2 分钟，使捕获化合物的生物素基数与磁珠表面的链霉亲和素结合。然后使用 capra mag 磁性收集 PCR 管盖中的 capra 珠子，弃去 supernat 并将得到的 capra 珠子重悬于 200 μL 的一次性洗涤缓冲液中。再次磁性收集 PCR 试管联排管盖中的 capra 珠子，并弃去上清液。

然后关闭试管以避免珠子干燥。接下来，为捕获测定和必要的对照（包括竞争对照）标记新试管。下拉下拉和联合捕获测定加下拉的竞争对照，将标记管放入 capra 盒中，以将温度调节在 0 至 4 摄氏度。

然后移液 milli Q 水，计算最终反应体积为 100 μL 和 20 μL 的 5 倍捕获缓冲液。对于每个反应，向每个试管中加入 0.26 毫克大肠杆菌 dh 5 α 全细胞裂解物，并通过倒置轻轻混合。对于下拉的竞争控制和竞争控制，加入 20 微升 10 毫摩尔 SAH 竞争溶液。

对于捕获测定，下拉和联合捕获测定加下拉，加入 20 微升毫 Q 水代替 SAH 溶液，倒置轻轻混合所有试管并短暂离心。然后将 capra 珠子悬浮在相应的裂解物中，并在 4 摄氏度下孵育 3 小时。通过旋转使磁珠保持悬浮状态，以允许 SAH 结合蛋白与 SAH 捕获化合物的 SAH 选择性功能发生可逆结合。

孵育后，短暂离心并将悬浮液放入 capra 盒中。分离试管并移除悬架，以进行下拉和比赛控制下拉到冰上。将剩余的悬浮液留给捕获测定、竞争对照和联合捕获测定。

此外，还可以下拉 capra 盒，用紫外光照射样品，同时冷却样品。在 0 到 4 摄氏度之间的封闭管中照射样品总时间为 30 分钟，照射间隔为 2.5 分钟。该过程将在 SAH 捕获化合物的反应功能与 SAH 结合蛋白之间形成共价交联。

从 Capra 盒中取出 2.5 分钟的辐照间隔的悬浮液。在冰水中冷却约 15 秒，然后倒置混合数次。然后短暂离心样品以去除盖子中残留的任何悬浮液，并将它们放回 capra 盒中以进行下一个照射间隔。

接下来，再次包括用于下拉和下拉竞争控制的悬浮液，并向捕获测定中加入 20 微升 10 毫摩尔 SAH 溶液以进行竞争控制，下拉竞争控制和联合捕获测定加下拉，加入 20 微升毫 Q 水。将悬浮液在 4 °C 下孵育 10 分钟，在捕获分析中通过旋转保持珠子和悬浮液。未与 SAH 捕获化合物交联的 SAH 结合蛋白将被置换。

孵育后，使用 capra mag 从悬浮液中收集 capra 珠子，并丢弃 supernat。然后通过复苏洗涤珠子，将它们悬浮在 200 微升的一次性洗涤缓冲液中，并通过磁分离收集珠子。重复此洗涤五次，然后将它们重悬于 200 微升 milli Q 水中，并通过磁分离收集珠子。

珠子重悬于 200 微升 60% 乙酰丁腈中，并使用 capri mag 收集珠子。重复乙酰丁腈洗涤两次。如果磁珠不能轻易重悬，则应用超声波。

接下来，通过添加 200 μL 新鲜制备的蛋白质，从珠子中释放捕获的蛋白质。60% 乙酰腈、0.2% Tri Fluor 乙酸，然后在室温下剧烈摇动孵育 10 分钟。同样，如果磁珠不能轻易重悬，则应用超声波。

最后，磁性收集珠子并丢弃它们。将试管条切成单管，在盖子上穿孔，蒸发 supra natin 直至干燥。在此阶段使用离心蒸发器，捕获的蛋白质可以进行 SDS 页面处理或进行质谱处理，如下一节所述，将从磁珠中释放的捕获蛋白质溶解在 10 微升 50 毫摩尔碳酸氢铵中。

将样品放入超声浴中，然后涡旋样品。接下来，在 1 毫摩尔 HCL 中加入 1 微升 0.5 μg/μL 胰蛋白酶，短暂离心并将溶液在 37 摄氏度下孵育过夜。孵育过夜后，根据制造商的说明，使用 C 18 材料（例如 20 微升阶段吸头）在 Biosystems 上代理对含有捕获蛋白质的三联肽的溶液进行脱盐，用 10 微升 50% 甲醇、5% 甲酸洗脱肽两次。

然后使用离心蒸发器蒸发溶剂，留下干燥的脱盐肽通过在超声浴中应用超声波并涡旋，将肽溶解在 5.5 微升 0.1% 甲酸中。最后，如书面方案中所述，通过纳流液相色谱-串联质谱法分析样品。要分析 MSM S 数据，请使用蛋白质鉴定算法，例如在 bioworks 浏览器版本 3.3 0.1 中实现的 seaquest，在支架 three 软件中实现的 SP one 和 X tandem。

根据最新的通用蛋白质资源知识库执行自动数据库搜索。Swiss Pro 数据库发布 www x pai.组织调查的生物体。

本研究使用的数据库是大肠杆菌菌株。Seaquest 中的 K12 版本 57 dash 11 设置了自动数据库搜索，母离子体的容差为百万分之五。一个原子质量单位的碎裂离子耐受性和完全行程以及特异性，允许最多两次漏诊切割。

设置可变修饰以允许围氨酸磷酸化和酪氨酸氧化蛋氨酸在天冬酰胺和谷氨酰胺处的氧化，赖氨酸的乙酰化和赖氨酸的正弦制剂以及精氨酸的甲基化赖氨酸、正弦硫氨酸和天冬酰胺。不要在数据库搜索中使用固定修改，将 Seaquest 生成的 DTA 或 SRF 文件加载到 Scaffold three 软件中，该软件通过结合 Seaquest 和 x 串联数据库搜索来执行肽分配和蛋白质鉴定的概率评估。Scaffold 可用于轻松比较、验证和可视化来自多个样品的蛋白质列表。

在 scaffold three 软件中设置参数，以仅接受蛋白质鉴定并报告为不同的命中。将命中设置为包含至少一个通过概率验证的判别肽。根据支架 3 分析，仅考虑支架内肽利润算法指定的概率大于或等于 95% 的肽。

三个软件根据蛋白质利润算法将多个肽分配的蛋白质鉴定概率设置为大于或等于 95%。对于单个肽段蛋白质鉴定，将蛋白质概率任意设置为大于或等于 50%，然后手动检查相应的肽段。软件对包含相似肽且无法仅根据 Ms MS 分析进行区分的 Ms ms 谱图蛋白进行分组，以满足精简原则。

可以使用反向蛋白质数据库方法确定肽鉴定的估计错误发现率，并且应小于 1%Here。SDS 页面，捕获完整蛋白质的银染分析显示在捕获分析中。在紫外线照射步骤后添加过量的游离 SAH，以确保仅分离具有通过光反应性功能共价连接的捕获化合物的蛋白质。

通过 MS 从 Ingel Triptych Digest 后切割的蛋白质凝胶条带中鉴定蛋白质。为了进行比较，最左侧的泳道显示 0.25% 的大肠杆菌 DH 5 α 全细胞裂解物，在捕获测定中分离出蛋白质。这种比较表明，捕获化合物技术显著降低了样品复杂性。

对照在凝胶中心运行，包括测定的竞争对照。该对照在 UVI 辐射步骤之前包含过量的游离 SAH 作为竞争者，以防止蛋白质通过 SAH 选择性功能与 SAH 捕获化合物结合。竞争对照对于确定任何不结合 SAH 的非特异性捕获蛋白质至关重要。

因此，在捕获测定中鉴定的蛋白质，而不是在竞争对照中鉴定的蛋白质是特异性的。SAH 结合蛋白。还包括一个无紫外线照射且不添加游离 SAH 的 Pull Down 实验。

下拉的竞争控制也没有经过辐照，但包含 SAH 作为竞争对手。最后，对联合捕获分析加 pull down 进行紫外辐照，在工作流程中未添加游离 SAH。很明显，光交联提高了实验的产量和灵敏度，并且特异性可以在竞争实验中使用过量的游离 SAH 而不是通过 SDS 页面分析捕获的完整蛋白质。

Triptych Digest 之后，可以通过纳米流液相色谱与串联质谱联用立即分析捕获蛋白质的整个混合物。这是真正的 CCMS 方法，比通过 SDS 页面进行分析要敏感得多。甲基转移酶和通过 CCMS 实验鉴定的其他选定蛋白见下表。

给定的数字表示每个蛋白质的未加权肽谱计数，与下拉相比，在捕获测定中鉴定出更多的甲基转移酶和其他 SAH 结合。SAH 特异性表现为竞争对照中几乎完全不存在这些蛋白质。将 CCMS 运行中鉴定的蛋白质总数和运行之间的蛋白质重叠制成表格。

括号中给出了用至少两种肽鉴定的蛋白质数量。该方法的高重现性可以从可比实验之间主要非特异性蛋白质的高度蛋白质重叠中推断出来，尤其是在用至少两种肽稳健鉴定的蛋白质中。维恩图描述了捕获测定、竞争控制和下拉中鉴定的蛋白质的重叠，而所有鉴定的蛋白质的数量在右侧给出，括号中给出了至少两种肽鉴定的蛋白质数量，甲基转移酶和 SAH 核酸酶的数量显示在左侧。

我们刚刚向您展示了如何通过捕获化合物质谱或 CCMS 从大肠杆菌细胞裂解物或其他组织或细胞裂解物中分离和鉴定甲基转移酶或其他功能性亚蛋白质组。执行此程序时，请务必记住避免捕获化合物长时间暴露在可见光下，以保持样品凉爽。新鲜制备 TFA Aceto 丁腈溶液，用于从磁珠中释放捕获的蛋白质，并避免实验受到外部蛋白质来源（如来自灰尘或实验者的角蛋白）的污染。

此外，我们发现这取决于具体的设置，是否是另类配置，光交联配置是否发生在预捕获化合物和蛋白质和溶液之间，或者目前描述的节拍配置表现更好。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。