Name: 分析甲基化和其他 S腺苷 L同型半胱氨酸结合蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00.000+00:00
Duration: 17 min 12 s
Description: 学习使用捕获化合物质谱技术从大肠杆菌裂解液中分离和鉴定甲基转移酶的方法。该技术利用S-腺苷-L-同型半胱氨酸作为选择性功能基团，通过紫外光交联实现蛋白质的高效捕获与质谱分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由人类前沿科学计划组织（HFSP 奖项 2007，RGP0058/2007-C）资助。我们感谢 Richard Roberts 教授发起该项目并进行富有成效的讨论。

<ol><li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li>
<li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li>
<li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li>
<li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methylation%3A+selected+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li>
<li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Watson+and+Crick%3A+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li>
<li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li>
<li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li>
<li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+small+molecule+methyltransferases%3A+their+structural+and+functional+features%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li>
<li>Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorchardt%2C+RT+%22The+Biochemistry+of+S-Adenosylmethionine%22">The Biochemistry of S-Adenosylmethionine</a>. Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. , Columbia University Press. New York, NY. 151-171 (1977).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li>
<li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS%2FMS+and+database+search%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li>
</ol>

Thomas Lenz、Olivia Grabner、Mirko Glinski、Mathias Dreger 和 Hubert Koster 均受雇于 caprotec bioanalytics GmbH, Inc，该公司生产本文所用的部分试剂。

在执行所述实验方案时，以下注意事项和说明可能有所帮助：a) 共价连接子（CC）的主要优势在于其能够与甲基转移酶（MTase）形成共价键，从而允许后续采用严格的洗涤条件。该共价交联通过紫外光（最大波长310 nm）引发的光化学反应实现。尽管普通室内光源仅含有少量紫外线，但仍需避免SAH-CC在受控且冷却的caproBox照射前长时间暴露于室内光或阳光下。b) 用于分离MTase的生物样品可能含有易于变性的蛋白质，因此必须始终保持样品低温，并在操作过程中避免产生泡沫。c) caproBox可将样品冷却至0–4 °C，但发射紫外光的灯管同时也会产生热量。因此，在照射前需短暂离心反应管，以防止附着在管盖或管壁上的蛋白质形成沉淀核心。d) 若磁珠（例如在洗涤液中）无法通过手动方式重悬，可将样品置于超声水浴中短暂施加超声处理。e) 0.2% TFA/60% ACN溶液需新鲜配制。我们发现，若溶液存放过久，可能导致捕获的蛋白质无法从磁珠上有效切割下来。f) 捕获蛋白质的最终分析通过LC-MS/MS完成。质谱分析是一种高度灵敏的方法，因此在最后步骤（步骤2.11及之后）中必须 exclusively 使用LC-MS级试剂。应避免外来蛋白源（如来自灰尘或实验操作者的角蛋白）对实验造成污染。特别是在最终的消化步骤中，建议保持工作区域清洁，佩戴手套和实验服，必要时佩戴发网，或理想情况下在超净工作台内完成操作。用于胰蛋白酶消化的50 mM碳酸氢铵缓冲液应使用LC-MS级水配制，经0.22 μm滤膜过滤后分装，于-20°C保存，并且每份分装仅使用一次，以避免污染。胰蛋白酶溶液（测序级，Roche，通过向冻干胰蛋白酶中加入1 mM HCl配制成0.5 μg/μl溶液）可在4°C保存数周。g) 为获得可靠的质谱图，ESI-MS/MS分析中必须保持稳定的喷雾状态。h) 若使用不同于本研究中的LC-MS/MS系统，则需针对具体设备单独优化检测参数和肽段鉴定算法。
针对所述实验方案，可进行以下修改：a) 除了使用60%乙腈（ACN）/0.2%三氟乙酸（TFA）从磁珠上洗脱蛋白（步骤2.11）外，也可直接在磁珠悬浮液中进行胰蛋白酶消化（体积同步骤5.1）；或者，对于SDS-PAGE分析，可在步骤2.9收集磁珠后，将其重悬于SDS上样缓冲液中，95°C加热10分钟以释放蛋白（可将整个悬浮液或仅上清液上样至凝胶加样孔中）。我们发现，即使经过多次水相洗涤步骤，在磁珠上直接进行胰蛋白酶消化时，磁珠仍会缓慢释放少量聚合物进入水相胰蛋白酶消化液中。该聚合物污染会干扰质谱对肽段的鉴定，可通过使用80%乙腈（至少洗涤三次）将聚合物从磁珠上彻底洗去。在完成80%乙腈洗涤步骤后，应在进行磁珠上胰蛋白酶消化前，用纯水洗涤磁珠一次。b) 可使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase）结合ECL底物的Western印迹法，检测含生物素的交联剂（CC）与目标蛋白成功交联的情况。因此，既可在步骤3.2获得的凝胶进行转膜检测，也可直接取步骤2.7后的10 μl样品进行Western印迹分析——后者的检测灵敏度比凝胶银染高约10倍。需注意的是，在后一种情况下，除SAH-CC人工标记的生物素化蛋白外，内源性生物素化蛋白也会被同时检测到。c) 我们发现，具体采用“游离交联剂”模式（即交联反应在溶液中自由存在的CC与蛋白之间发生）4，还是采用本文所述的“磁珠结合”模式（图1B），其效果优劣取决于特定实验体系（包括裂解液性质、目标蛋白种类以及CC的选择性和反应活性功能）。
总体而言，该方法还应适用于任何先进的稳定同位素蛋白质或肽段标记技术，或通过二维凝胶电泳对捕获样品进行分析。在“离珠”配置中，还可实现对完整细胞内蛋白质的捕获（未发表结果）。此外，通过质谱肽段测序确定CC在蛋白质序列中邻近的交联位点，可以描绘出药物或辅因子在蛋白质上的结合位点。通过在选择性功能基团上采用不同的化学连接位置以及不同长度的连接臂，可探究小分子与蛋白质的结合模式。如本研究所示，还可鉴定出由选择性功能基团所靶向蛋白质的蛋白结合伙伴（如PrmA作用底物RplK），以及未知的小分子-蛋白质相互作用（如SAH与GlnA之间的相互作用）。综上所述，CCs额外具备的光交联反应活性，使得科学家能够以高灵敏度从复杂的蛋白质混合物中分离和鉴定低丰度蛋白质或功能蛋白质家族，并为研究小分子-蛋白质相互作用提供了一种额外的工具。

<table><tbody><tr><td>SAH caproKit&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-1010-050 (50 次反应) 1-1010-010 (10 次反应)</td><td>包含 SAH-CC、SAH 竞争物、链霉亲和素包被的磁珠、捕获缓冲液和洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>caproBox&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td><td>用于在冷却样品的同时实现可重复的光激活</td></tr><tr><td>caproMag&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5100-001</td><td>便于无移液操作的磁性颗粒处理</td></tr></tbody></table>

甲基转移酶及其他 s-腺苷-l-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（ccms）分析

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

基于功能性小分子-蛋白质相互作用来降低蛋白质组复杂性的方法有多种，例如亲和层析1或活性为基础的蛋白质谱型分析2。三功能捕获化合物（CCs，图1A）3构成了一种通用方法的基础，在该方法中，小分子探针（选择性功能，此处为S-腺苷-L-高半胱氨酸，SAH，图1A）与靶蛋白之间初始的平衡驱动相互作用，通过CC的独立光激活反应功能基团（此处为苯基叠氮化物）与靶蛋白表面发生光交联而被不可逆地固定。分选功能基团（此处为生物素）则用于在固相介质（此处为链霉亲和素磁珠）的帮助下，从复杂的生物混合物中分离CC-蛋白质偶联物。实验有两种可能的构型：“离珠”4或目前所描述的“在珠”构型（图1B）。选择性功能基团几乎可以是任何感兴趣的小分子（如底物、抑制剂、药物分子）。
S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM，图1A）在自然界中作为辅因子的使用频率可能仅次于ATP5, 6。它是所有生物体内主要的甲基供体，该化学反应由依赖SAM的甲基转移酶（MTases）催化，可对DNA7、RNA8、蛋白质9或小分子10进行甲基化。鉴于甲基化反应在多种生理过程（如基因调控、表观遗传、代谢等）中具有关键作用，对MTases的功能分析预计将在功能蛋白质组学中发挥与激酶分析相当的重要性。然而，目前尚缺乏用于此类分析的有效工具。我们近期开发了一种以S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）作为选择性基团的化学探针（CC），以填补这一技术空白（图1A）。
S-腺苷高半胱氨酸（SAH）是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）在甲基转移后产生的产物，已知是一种普遍的甲基转移酶（MTase）产物抑制剂11。由于天然辅因子SAM还被其他酶用于转移辅因子的其他部分或引发自由基反应，且SAM本身化学性质不稳定12，因此SAH成为共价探针（CC）靶向MTase的理想选择性功能基团。本文中，我们通过分析大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）DH5α菌株中的MTase及其他SAH结合蛋白，展示了SAH-CC与CCMS的应用价值。大肠杆菌是研究最为透彻的原核生物之一，已被广泛用作无数生物化学、生物学和生物技术研究中的模式生物。光激活交联可提高实验的产率和灵敏度，且可通过使用过量游离SAH进行竞争实验，便捷地验证结合特异性。

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia coli）全细胞裂解液中分离甲基转移酶，并通过质谱法（MS）对其进行鉴定。

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

基于功能性小分子-蛋白质相互作用（如亲和力相互作用）来降低蛋白质组复杂性的方法有多种

以下实验的总体目标是通过捕获化合物质谱法（CCMS）从复杂的蛋白质混合物中分析甲基转移酶。甲基转移酶通过三功能捕获化合物实现功能性分离，这些化合物携带通用甲基转移酶产物抑制剂S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH），在本实验流程中作为选择性功能。首先，将细胞裂解液与捕获化合物孵育，使捕获化合物的选择性功能与靶蛋白之间建立可逆结合平衡，从而实现功能性分离。随后，将混合物置于Capra盒中进行紫外光照射。照射光可激活捕获化合物的反应功能，从而诱导捕获化合物与靶蛋白之间形成不可逆的共价交联。随后，将捕获化合物-蛋白偶联物从裂解液中分离，经充分洗涤后从固相载体上洗脱，并进行胰蛋白酶消化，以通过质谱分析三联肽来鉴定被捕获的蛋白质。实验结果表明，基于捕获化合物-质谱技术，可直接从大肠杆菌细胞裂解液中分离并鉴定甲基转移酶。大家好，我是来自生物化学系CaTECH实验室的Thomas Lentz。我是Mathias Rega，也来自CapTech生物化学实验室。我是来自分析部门的Mer Linsky。今天我们将向您展示从等量细胞裂解液中实时捕获甲基转移酶的操作步骤。我们在实验室中采用该方法研究小分子与蛋白质之间的相互作用。该方法可实现对功能性亚蛋白质组（如激酶、金属蛋白酶、GTP酶、AIS等）的分离与鉴定。我们还利用该方法进行药物靶点的发现。现在让我们开始。在捕获实验中，使用蜗牛 L-高半胱氨酸捕获试剂盒（snail L homocystine caper kit）短SAH捕获试剂盒。该试剂盒包含SAH捕获化合物及作为竞争物的游离SAH。此外，还包括直径为一微米的链霉亲和素包被磁珠、五倍浓度的捕获缓冲液以及五倍浓度的洗涤缓冲液。使用若干个200微升PCR管条，通过将每份50微升浓度为10毫克/毫升的链霉亲和素包被磁珠与25微升100微摩尔的SAH捕获化合物混合，充分振荡，以制备负载SAH捕获化合物的链霉亲和素包被磁珠，用于每个Eloqua实验。将所得悬浮液在室温下振荡两分钟，使捕获化合物的生物素部分与磁珠表面的链霉亲和素结合。然后使用 Capra Mag 装置将 Capra 磁珠在 PCR 管盖中通过磁力收集，弃去上清液，并将所得的 Capra 磁珠重悬于 200 µL 1× 洗涤缓冲液中。再次通过磁力将 Capra 磁珠在 PCR 管条的管盖中收集，并弃去上清液。然后封闭管子以防止珠子干燥。接下来标记新的管子，用于捕获实验及必要的对照组，包括竞争对照。设置下拉对照、下拉与联合捕获实验加下拉的竞争对照，将标记好的管子放入Capra盒中，使温度保持在0至4摄氏度。然后加入去离子水，体积根据终反应体系为100微升计算，并加入20微升5倍浓度的捕获缓冲液。每个反应中加入0.26毫克大肠杆菌DH5α全细胞裂解液至各管中，通过轻柔颠倒混匀。对于竞争对照及下拉实验的竞争对照，加入20微升10毫摩尔的SAH竞争溶液。对于捕获实验，进行下拉实验以及结合捕获实验加下拉实验时，加入20微升的Milli-Q水以替代SAH溶液，轻轻倒置混匀所有离心管并短暂离心。随后将Capra珠悬浮于相应的裂解液中，在4摄氏度下孵育3小时。通过旋转保持珠子处于悬浮状态，以使SAH结合蛋白可逆地结合至SAH捕获化合物的SAH选择性功能位点。孵育后，短暂离心，将悬浮液放入山羊盒中。分开试管，取出用于下拉实验及其竞争对照的悬浮液，并置于冰上。剩余悬浮液用于捕获实验的竞争对照及联合捕获实验。在山羊盒中进行下拉操作，同时对样品进行紫外光照射并冷却。在0至4摄氏度的封闭管中，以2.5分钟为间隔，总照射时间为30分钟。该过程将使SAH捕获化合物的反应性功能基团与SAH结合蛋白之间形成共价交联。从Capra盒中取出悬浮液，照射间隔为2.5分钟。在冰水中冷却约15秒，并通过反复倒置混合数次。然后短暂离心样品，以去除盖子上残留的悬浮液，并将样品放回Capra盒中进行下一轮照射。接下来，再次加入用于下拉实验及其竞争对照的悬浮液，并向捕获实验的竞争对照、下拉实验的竞争对照以及联合捕获实验加下拉实验中加入 20 微升 10 毫摩尔的 SAH 溶液，向对照组加入 20 微升 milli Q 水。将悬浮液在 4 摄氏度孵育 10 分钟，同时在捕获实验中通过旋转保持珠子和悬浮液混合。未与 SAH 捕获化合物交联的 SAH 结合蛋白将被置换下来。孵育结束后，使用 Capra 磁铁从悬液中收集 Capra 珠，并弃去上清液。随后通过重悬将珠子洗涤，加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液重悬珠子，并通过磁力分离收集珠子。重复此洗涤步骤五次，然后将珠子重悬于 200 µL 的 Milli-Q 水中，并通过磁力分离收集珠子。将珠子重悬于200微升60%乙腈中，并使用Capri磁铁收集珠子。重复乙腈洗涤两次。若珠子难以重悬，可进行超声处理。接下来，通过加入200 µL新配制的60%乙腈、0.2%三氟乙酸，从磁珠中洗脱捕获的蛋白质，并在室温下剧烈振荡孵育10分钟。如果磁珠难以充分重悬，可再次使用超声处理。最后用磁力收集磁珠并弃去。将试管条剪成单个试管，打孔管盖，将上清液蒸发至干燥。在此阶段，可使用离心浓缩仪将捕获的蛋白质直接用于SDS-PAGE，或按照下节所述方法进行质谱分析；将从磁珠上洗脱的蛋白质溶解于10 µL的50 mmol/L碳酸氢铵溶液中。将样品放入超声水浴中，然后涡旋样品。接着，在样品中加入1 µL浓度为0.5 µg/µL的胰蛋白酶（溶于1 mM HCl中），短暂离心后，将溶液在37°C下孵育过夜。过夜孵育后，使用C18材料（例如AB Biosystems公司的Stage Tips，按照生产商说明书操作）对含有捕获蛋白的三联肽的溶液进行脱盐处理，并用10 µL含50%甲醇、5%甲酸的溶液重复洗脱肽段两次。然后使用离心浓缩仪蒸发溶剂，得到干燥的脱盐肽段，再加入5.5 µL含0.1%甲酸的溶液，通过超声水浴和涡旋振荡使肽段充分溶解。最后按照书面实验方案所述，采用纳米流液相色谱串联质谱法分析样品。对于MS/MS数据的分析，可使用蛋白质鉴定算法，例如BioWorks浏览器3.3.0.1版中实现的SEQUEST，或Scaffold 3软件中实现的SPC One和X! Tandem。针对所研究生物体的最新通用蛋白质资源知识库，进行自动化的数据库搜索。Swiss-Prot 数据库发布于 www.xpai.org。本研究所使用的数据库为大肠杆菌菌株 K12 release 57 dash 11。在 Seaquest 中设置自动化数据库搜索时，前体离子容差为百万分之五，碎片离子容差为 1 个原子质量单位，采用完全三酶切特异性，并允许最多两次漏切。设置可变修饰，允许丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，甲硫氨酸发生氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺发生脱酰胺，赖氨酸发生乙酰化，赖氨酸发生甲酰化，以及精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺发生甲基化。在数据库搜索中不使用固定修饰。将 Seaquest 生成的 DTA 或 SRF 文件载入 Scaffold 3 软件中，该软件通过整合 Seaquest 和 X! Tandem 的数据库搜索结果，对肽段指认和蛋白质鉴定进行概率评估。Scaffold 有助于便捷地比较、验证和可视化来自多个样品的蛋白质列表。在 Scaffold Three 软件中设置参数，仅接受蛋白质鉴定结果，并将结果报告为不同的鉴定命中。要求每个命中至少包含一条通过概率验证的区分性肽段。根据 Scaffold Three 的分析，仅考虑由 Scaffold 内置的肽段概率算法确定的概率大于或等于 95% 的肽段。三种软件根据蛋白质概率算法，将多个肽段匹配的蛋白质鉴定概率设定为大于或等于95%。对于仅基于单个肽段的蛋白质鉴定，将蛋白质概率任意设定为大于或等于50%，并手动检查相应的肽段。在串联质谱分析中，含有相似肽段且仅基于串联质谱数据无法区分的蛋白质，软件会依据简约性原则将其归为一组。可通过反向蛋白质数据库方法确定肽段鉴定的假发现率，其值应低于1%。此处显示了捕获实验中通过SDS-PAGE银染法对捕获的完整蛋白质进行的分析。在紫外照射步骤后加入过量的游离SAH，以确保仅分离通过光反应功能共价结合捕获化合物的蛋白质。通过凝胶内三联消化（Ingel Triptych Digest）后，从切割的蛋白质凝胶条带中利用质谱（MS）鉴定蛋白质。作为对照，最左侧泳道显示的是用于捕获实验中蛋白质分离的大肠杆菌DH5α全细胞裂解液的0.25%。该对照凸显了捕获化合物技术在降低样品复杂性方面的显著效果。对照样本在凝胶的中央位置进行电泳，其中包括该实验的竞争性对照。此对照在UVI辐射步骤之前加入过量的游离SAH作为竞争物，以阻止蛋白质通过SAH选择性功能与SAH捕获化合物结合。该竞争性对照对于确定那些不与SAH结合的非特异性捕获蛋白至关重要。因此，在捕获实验中鉴定出但在竞争对照实验中未出现的蛋白质为特异性的SAH结合蛋白。实验还包括未进行紫外照射且未添加游离SAH的下拉实验。下拉实验的竞争对照组也未进行辐照，但含有SAH作为竞争物。最后，联合捕获实验加上下拉步骤经过UV辐照处理，在整个流程中未添加游离的SAH。显然，光交联可提高实验的得率和灵敏度，而通过使用过量游离SAH进行竞争实验，可以方便地验证特异性，而无需通过SDS-PAGE分析捕获的完整蛋白质。通过三联消化后，捕获的蛋白质混合物可一次性采用纳米流液相色谱串联质谱法进行分析。这是真正的CCMS方法，其灵敏度远高于SDS-PAGE分析。本表列出了通过CCMS实验鉴定出的甲基转移酶及其他选定蛋白质。所示数字表示每种蛋白质的非加权肽段质谱计数，与下拉实验相比，在捕获实验中鉴定出更多的甲基转移酶及其他SAH结合蛋白。竞争性对照实验中这些蛋白质几乎完全缺失，表明了SAH结合的特异性。CCMS运行中鉴定出的蛋白质总数以及各次运行间的蛋白质重叠情况已被汇总成表。鉴定到至少两个肽段的蛋白质数量以括号表示。从可比实验之间主要非特异性蛋白质的高度重叠中，可以推断该方法具有较高的可重复性，尤其是在此处通过至少两个肽段被稳健鉴定出的蛋白质中更为明显。维恩图描述了捕获实验、竞争对照和拉下实验中鉴定到的蛋白质之间的重叠情况，右侧给出了鉴定到的所有蛋白质总数（括号内为鉴定到至少两个肽段的蛋白质数量），左侧则显示了甲基转移酶和SAH核酸酶的数量。我们刚刚向您展示了如何通过捕获化合物质谱法（CCMS）从大肠杆菌裂解液或其他组织或细胞裂解液中分离和鉴定甲基转移酶或其他功能性亚蛋白质组。在进行该实验步骤时，需注意避免捕获化合物长时间暴露于可见光下，以保持样品低温；用于从磁珠上洗脱捕获蛋白的三氟乙酸乙腈溶液应新鲜配制；并应避免来自灰尘或实验操作者皮肤角蛋白等外源性蛋白质对实验造成污染。此外，我们发现其效果取决于具体的实验设置，即非同步配置与光交联配置相比，究竟是预捕获化合物与溶液中的蛋白质之间发生交联的配置更优，还是目前所描述的同步配置表现更佳。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分析甲基化和其他 S腺苷 L</sub捕捉复合质谱（CCMS）>同型半胱氨酸结合蛋白

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP...

捕获化合物质谱法——一种鉴定新型环二鸟苷酸效应蛋白的强大工具

本文介绍了一种采用无鞘流多孔尖端接口设计的毛细管电泳-质谱联用技术对生物样品进行代谢谱分析的实验方案。...

无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术用于生物样本的代谢谱分析

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

本文介绍一种高通量的全面药物监测方法，该方法可提高对多种滥用药物及其代谢物的分辨率和检测能力，并基于多段进样-毛细管电泳-质谱技术进行质量控制。...

高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

学习使用捕获化合物质谱技术从大肠杆菌裂解液中分离和鉴定甲基转移酶的方法。该技术利用S-腺苷-L-同型半胱氨酸作为选择性功能基团，通过紫外光交联实现蛋白质的高效捕获与质谱分析。

甲基转移酶及其他 S-腺苷-_L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

探索更多视频